東方蜜蜂微孢子蟲一新型孢壁蛋白的基因克隆、表達(dá)及亞細(xì)胞定位

熊 亮, 敖塘堰, 張 真, 馬振剛, 周澤揚(yáng)

(重慶師范大學(xué), 重慶市動(dòng)物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶市媒介昆蟲重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 401331)

微孢子蟲是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的單細(xì)胞真核生物，廣泛存在于自然界中包含無脊動(dòng)物與脊椎動(dòng)物在內(nèi)的所有宿主中(Snowden, 2004; Weiss and Becnel, 2014)。目前約1 500種微孢子蟲被鑒定，在今后隨著新的宿主被發(fā)現(xiàn)，越來越多的微孢子蟲被發(fā)現(xiàn)和鑒定(Schotteliusetal., 2000; Keeling and Fast, 2002; Baki and Bekircan, 2018)。蜜蜂微孢子蟲Nosemaapis早在1909年時(shí)被發(fā)現(xiàn)(Grobov and Ziuman, 1972)；熊蜂微孢子蟲Nosemabombi(Fantham and Porter, 1914)、東方蜜蜂微孢子蟲Nosemaceranae(Friesetal., 1996)先后也被鑒定出來；Ptaszyńska等(2014)對(duì)蜜蜂微孢子蟲和東方蜜蜂微孢子蟲進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析表明兩種微孢子蟲具有不同的外部特征(Ptaszyńskaetal., 2014)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，西方蜜蜂Apismellifera能夠被東方蜜蜂微孢子蟲所感染(Higesetal., 2006, 2007)。目前，對(duì)于微孢子蟲的致病性分子機(jī)制研究較多，其中有研究指出在蜜蜂微孢子蟲極管蛋白3以及NCER_101456和NCER_100157等蛋白基因的有效沉默對(duì)蜜蜂有改善生理和壽命延長(zhǎng)的作用(Rodríguez-Garcíaetal., 2018; Kimetal., 2020)。

微孢子蟲宿主范圍廣、種類多以及細(xì)胞類型特異性差異大，但入侵宿主的機(jī)制相似(Franzenetal., 2006)，感染過程包括從休眠的孢子彈出極管穿透宿主細(xì)胞膜并且從孢子內(nèi)將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中形成新的孢子(Williams, 2009)。微孢子蟲的孢壁不僅參與這一過程，在微孢子蟲侵染宿主的細(xì)胞時(shí)黏附、入侵、感染等活動(dòng)中起著重要的作用(Lietal., 2012)，對(duì)孢壁蛋白進(jìn)行分離鑒定以及生物功能的研究意義重大。目前，在家蠶微孢子蟲Nosemabombycis中SWP1, SWP2, SWP3, SWP5, SWP11, SWP12和SWP26等10個(gè)孢壁蛋白被鑒定出來, 其中SWP11和SWP26參與孢子的形成與黏附，SWP5不僅是構(gòu)成微孢子蟲的一種孢壁蛋白，還存在與極管蛋白之間的相互作用(Lietal., 2009; Lietal., 2012; Chenetal., 2013; Zhuetal., 2013; Yangetal., 2014a; Wangetal., 2015, 2017)；來源于兔腦炎微孢子蟲Encephalitozooncuniculi中的4個(gè)孢壁蛋白EcSWP1, EcSWP2, EcSWP3和EnP1也被鑒定到(Bohneetal., 2000; Haymanetal., 2001; Xuetal., 2006; Southernetal., 2007)，且EcSWP1可為作為兔腦炎微孢子蟲臨床診斷的選擇性抗原(Mengetal., 2014)；腸腦炎微孢子蟲Encephalitozoonintestinalis中的SWP1和SWP2能夠定位在孢子內(nèi)壁和外壁，參與到孢子壁的構(gòu)成(Haymanetal., 2001)；蝗蟲微孢子蟲Antonosporalocustae中的孢壁蛋白AlocSWP2在孢子形成過程中行使功能(Chenetal., 2017)；EhSWP1在蝦肝腸胞蟲Enterocytozoonhepatopenaei中可以作為孢子侵染宿主過程中重要的媒介蛋白來介導(dǎo)孢子結(jié)合至宿主細(xì)胞表面的肝素(Jaroenlaketal., 2018)?？偟膩碇v，微孢子蟲孢壁蛋白不僅參與微孢子蟲的孢壁的構(gòu)成，還在信號(hào)傳導(dǎo)、宿主黏附和介導(dǎo)極管發(fā)芽等方面具有重要的生物學(xué)作用(Haymanetal., 2005; Huangetal., 2007; Lietal., 2009)。

東方蜜蜂微孢子蟲對(duì)蜜蜂的生存及蜂產(chǎn)品的生產(chǎn)危害巨大，對(duì)我國的蜜蜂養(yǎng)殖業(yè)乃至世界蜜蜂養(yǎng)殖業(yè)造成了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失。為了分析東方蜜蜂微孢子蟲孢壁蛋白在侵染宿主中行使的功能，本研究以團(tuán)隊(duì)前期質(zhì)譜鑒定獲得的東方蜜蜂微孢子蟲候選孢壁蛋白AAJ76_1400036761為研究對(duì)象，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行原核表達(dá)并以重組表達(dá)蛋白為抗原制備多克隆抗體，對(duì)其亞細(xì)胞定位進(jìn)行深入的研究。對(duì)孢壁蛋白AAJ76_1400036761開展系統(tǒng)深入的研究，有助于揭示微孢子蟲孢壁蛋白與孢子侵染的關(guān)系，可為了解微孢子蟲侵染機(jī)制及建立行之有效的東方蜜蜂微孢子蟲診斷和防治措施奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 東方蜜蜂微孢子蟲的分離和純化

取健康成年西方蜜蜂Apismellifera，按每頭蜜蜂添食105個(gè)東方蜜蜂微孢子蟲，感染第20天后取蜜蜂中腸，用滅菌后的研缽研磨成勻漿、紗布過濾；濾液以300 r/min進(jìn)行離心，獲得的上清再經(jīng)3 000 r/min離心收集沉淀；用滅菌水重懸沉淀后再次重復(fù)上述差速離心過程；經(jīng)過5次重復(fù)差速離心后上清以3 000 r/min離心，收集的沉淀經(jīng)適量滅菌超純水復(fù)懸。將上述獲得的微孢子蟲在12 000 r/min離心30 min的條件下，在濃度為100%, 75%, 50%和25% Percoll溶液中進(jìn)行密度梯度離心，收集底部純化的蜜蜂微孢子蟲。最后用滅菌的0.01 mol/L PBS溶液清洗孢子3次，經(jīng)3 000 r/min離心5 min后的沉淀保存于含終濃度為1 000 U/mL的鏈霉素和氨芐青霉素的滅菌超純水中，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 載體菌株和主要試劑

原核表達(dá)載體pCold Ⅱ由重慶師范大學(xué)媒介昆蟲重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌Eescherichiacoli克隆菌株DH5α和表達(dá)菌株Rosetta (DE3)購于北京博邁德生物技術(shù)有限公司。蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、NaCl、β-巰基乙醇、甘氨酸、尿素和吐溫20購自上海生工生物；ECL Marker購自北京索萊寶科技有限公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒、蛋白marker購自上海雅生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購于北京博邁德生物技術(shù)有限公司；Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記羊抗鼠二抗、多聚賴氨酸、DAPI、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗購自Thermo Scientific公司；PCR酶(Premix ExTaq),SalⅠ,BamH Ⅰ和Solution Ⅰ連接試劑盒購自TaKaRa公司；Ni-NAT預(yù)裝His親和層析柱購自Qiagen公司；免疫電鏡專用固定液A液和B液均購自Servicebio公司；10 nm膠體金顆粒標(biāo)記羊抗鼠二抗購自Sigma公司。

1.3 東方蜜蜂微孢子蟲孢壁蛋白AAJ76_1400036761的序列特征分析

將團(tuán)隊(duì)前期質(zhì)譜鑒定獲得的東方蜜蜂微孢子蟲候選孢壁蛋白的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與MicrosporidiaDB(https:∥microsporidiadb.org/micro/app)數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)，并下載獲得AAJ76_1400036761蛋白序列及對(duì)應(yīng)的編碼基因序列，將其在GenBank中進(jìn)行BLASTP序列比對(duì)以完成序列驗(yàn)證。采用在線分析序列特征，其中包括：分子量/等電點(diǎn)預(yù)測(cè)，ExPASy(https:∥web.expasy.org/compute_pi/)；疏水性分析，ProtParam(http:∥web.expasy.org/protparam/)；信號(hào)肽預(yù)測(cè)，SignalP 5.0 (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；跨膜域分析，TMHMM Server v2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)， NetPhos(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)；O-糖基化位點(diǎn)分析，NetOGlyc(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，PSIPRED Server(http:∥bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)；為了進(jìn)一步研究 AAJ76_140036761的系統(tǒng)進(jìn)化情況，以及在其他微孢子蟲中同源基因和基因座位之間位置的保守性，利用來自于東方蜜蜂微孢子蟲、家蠶微孢子蟲Nosemabombycis、兔腦炎微孢子蟲Encephalitozooncuniculi、蝦肝腸胞蟲Enterocytozoonhepatopenaei、腸腦炎微孢子蟲Encephalitozoonintestinalis、海倫腦炎微孢子蟲Encephalitozoonhellem、比氏腸胞蟲Enterocytozoonbieneusi、北美蝗蟲腦炎微孢子蟲Encephalitozoonromaleae、肌炎微孢子蟲Anncaliiaalgerae、結(jié)膜炎微孢子蟲Vittaformacorneae等微孢子蟲基因組數(shù)據(jù)及相關(guān)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析和基因座位共線性分析MicrosporidiaDB(https:∥microsporidiadb.org/micro/app/search/transcript/UnifiedBlast)。

1.4 東方蜜蜂微孢子蟲孢壁蛋白AAJ76_1400036761基因的克隆與原核表達(dá)

根據(jù)AAJ76_140036761基因序列設(shè)計(jì)引物，分別在上游引物與下游引物增加BamHⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，引物序列：36761_F(5′-GCGCGGATCCATGATATTTTTTTTTATTTC-3′, 下劃線序列為BamHⅠ酶切位點(diǎn))；36761_R(5′-CGCGTCGACGTATTCTTCCGATTGTTGGTT-3′, 下劃線序列為SalⅠ酶切位點(diǎn))。利用CTAB法(Heetal., 2019)提取1.1節(jié)東方蜜蜂微孢子蟲基因組DNA，作為PCR反應(yīng)的模板，利用上述引物對(duì)AAJ76_140036761基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系: Premix ExTaq 25.0 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL， 模板cDNA 1 μL, 加滅菌去離子水至50 μL。PCR擴(kuò)增程序: 94℃ 5 min; 94℃ 40 s, 54.6℃ 1 min, 72℃ 90s, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。目的片段經(jīng)切膠回收后連接到pCold II原核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選獲得重組表達(dá)載體。將測(cè)序正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，用終濃度為1.0 mmol/L IPTG在37℃ 200 r/min下誘導(dǎo)表達(dá)8 h。經(jīng)分離膠濃度為12%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況。收獲的重組蛋白為包涵體蛋白，使用Ni-NTA親和層析柱(QIAGEN, 德國)純化目標(biāo)蛋白，用PBS溶液透析復(fù)性后存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 多克隆抗體制備及免疫印跡分析

參照前人報(bào)道的多克隆抗體制備方法(劉澤鋒等, 2017)，將純化獲得的外源表達(dá)蛋白AAJ76_1400036761-His作為免疫抗原。第1次免疫將抗原與弗氏完全佐劑(Sigma, 美國)等體積混合并乳化完全，每只小鼠免疫量約為110 μg重組蛋白。隨后每隔7 d對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫一次，共加強(qiáng)免疫3次；每次均將抗原與弗氏不完全佐劑(Sigma, 美國)按體積比1∶1充分乳化，抗原量為每只小鼠110 μg。第4次免疫后的第7天進(jìn)行眼球采血。采集后的血液置于37℃培養(yǎng)箱中靜置1 h后取出置于4℃過夜，收集抗血清后分裝并于-20℃保存。

東方蜜蜂微孢子蟲成熟孢子經(jīng)玻璃珠破碎后提取總蛋白。分別將重組表達(dá)蛋白AAJ76_1400036761-His和東方蜜蜂微孢子蟲總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上，多克隆抗體Anti-AAJ76_1400036761按1∶3 000(v/v)稀釋后為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Thermo, USA)為二抗，使用ECL試劑(Solarbio, 北京)進(jìn)行顯色以分析多克隆抗體的特異性及AAJ76_1400036761蛋白在東方蜜蜂微孢子蟲中的表達(dá)情況。

1.6 東方蜜蜂微孢子蟲孢壁蛋白AAJ76_1400036761的間接免疫熒光定位分析

采取玻璃珠破碎提取的東方蜜蜂微孢子蟲總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上；使用Anti-AAJ76_14000367611為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western blotting，以進(jìn)一步分析AAJ76_1400036761在東方蜜蜂微孢子蟲中的表達(dá)情況。隨后，參照文獻(xiàn)(Peuvel-Fangetetal., 2006; Lietal., 2009; Lietal., 2012)進(jìn)行免疫熒光定位分析，方法如下：取適量多聚賴氨酸于載玻片上涂抹均勻，待干燥；添加?xùn)|方蜜蜂微孢子蟲懸液至載玻片上并涂抹均勻，待其快干燥時(shí)用4%的多聚甲醛固定15 min，PBST溶液清洗3次，每次5 min；待干燥后加封閉液1 h，清洗同上；實(shí)驗(yàn)組將獲得的多克隆抗體以1∶200(v/v)稀釋后為一抗，對(duì)照組以小鼠陰性抗體1∶200(v/v)稀釋后為一抗，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都以1∶1 000 (v/v)稀釋的Alexa Fluor 488(Thermo, 美國)熒光抗體為二抗，分別與孢子在室溫下孵育1 h，PBST溶液清洗5 min，重復(fù)清洗3次；DAPI染色10 min，清洗同上；半干狀態(tài)下滴加適量抗熒光淬滅劑(碧云天，北京)，封片后在奧林巴斯FV1200激光共聚焦顯微鏡(OLYMPUS, 日本)下觀察并采集圖像，以分析AAJ76_1400036761在東方蜜蜂微孢子蟲中的亞細(xì)胞定位情況。

1.7 東方蜜蜂微孢子蟲孢壁蛋白AAJ76_1400036761的免疫膠體金定位分析

取1.1節(jié)純化后的東方蜜蜂微孢子蟲，用ddH2O清洗后5 000 r/min離心收集沉淀，固定液A液固定2 h，再用固定液B液清洗3次后于4℃固定過夜；以3 000 r/min離心收集孢子，棄上清后加入4℃預(yù)冷的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，漂洗后離心收集沉淀；在2%的瓊脂糖中固定微孢子蟲；最后，用30%, 50%, 70%, 80%, 85%, 90%和95%酒精于-20℃下進(jìn)行梯度脫水；樹脂包埋并低溫聚合后進(jìn)行切片。將其粘附在200目的鎳網(wǎng)上的切片，4℃取出后用超純水懸浮5 min；TBS清洗3次后利用1%的BSA/TBS封閉液室溫封閉30 min；實(shí)驗(yàn)組以制備的多克隆抗體為一抗，陰性對(duì)照組以鼠陰性抗體為一抗，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別與封閉液體積比1∶30稀釋后于4℃過夜孵育；室溫復(fù)溫后TBS清洗3次，10 nm膠體金顆粒標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Sigma，美國)二抗與二抗稀釋液體積比按1∶50孵育；TBS清洗5次，每次5 min后，超純水清洗5次，鎳網(wǎng)于2%醋酸鈾飽和酒精溶液避光染色8 min；70%酒精清洗3次；超純水清洗3次；清洗后的鎳網(wǎng)用濾紙吸干后放入網(wǎng)板中，37℃烘箱放置10 min烘干備用；在透射電子顯微鏡下觀察并采集圖像，黑色10 nm大小的金顆粒即陽性表達(dá)或蛋白位置。

1.8 AAJ76_1400036761重組蛋白與幾丁質(zhì)殼的互作檢測(cè)

參照Yang等(2014b)提出的方法制備東方蜜蜂微孢子蟲的幾丁質(zhì)殼。取200 μg AAJ76_1400036761重組蛋白與幾丁質(zhì)殼于4℃孵育2 h；在轉(zhuǎn)速為8 000 r/min的條件下離心1 min分離上清與沉淀，其中上清作為結(jié)合上清存于-20℃暫存?zhèn)溆?；?.01 mol/L PBS溶液將沉淀清洗10次，每次按8 000 r/min離心1 min收集沉淀；最后一次洗滌后的上清(作為清洗上清樣品)和沉淀(作為結(jié)合沉淀樣品)備用。取上述處理后得到的結(jié)合上清、清洗上清和結(jié)合沉淀樣品，以anti-AAJ76_1400036761為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western blotting。

2 結(jié)果

2.1 東方蜜蜂微孢子蟲AAJ76_140036761基因序列特征及系統(tǒng)進(jìn)化

東方蜜蜂微孢子蟲AAJ76_140036761基因序列下載自MicrosporidiaDB(https:∥microsporidiadb.org/micro/app)，分析并獲得其完整CDS序列，基因全長(zhǎng)681 bp。AAJ76_1400036761蛋白由226個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，蛋白分子質(zhì)量預(yù)測(cè)為26.19 kD，等電點(diǎn)為6.84。該蛋白質(zhì)的氨基酸的疏水性平均值為-0.688，表明其具有一定親水性。該蛋白無信號(hào)肽，無跨膜結(jié)構(gòu)域，無典型的肝素結(jié)合基序。對(duì)該蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明該蛋白由 6個(gè) α 螺旋，16個(gè) β 折疊和 20 個(gè)無規(guī)則卷曲組成。翻譯后修飾分析表明，AAJ76_140036761蛋白上有1個(gè)N糖基化位點(diǎn)(圖1: A)，3個(gè)O-糖基化位點(diǎn)；具有25個(gè)磷酸化位點(diǎn)(圖1: B)，其主要存在于絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)上。GPI錨定位點(diǎn)分析表明，第 157 位的絲氨酸/S為AAJ76_140036761蛋白的錨定位點(diǎn)(圖1: C)。

圖1 東方蜜蜂微孢子蟲孢壁蛋白AAJ76_140036761的翻譯后修飾位點(diǎn)與錨定位點(diǎn)Fig. 1 Analysis of post-translational modification sites and anchoring sites of spore wallprotein AAJ76_140036761 from Nosema ceranaeA: 糖基化位點(diǎn)，星號(hào)表示O-糖基化位點(diǎn)，箭頭表示N-糖基化位點(diǎn)Glycosylation sites, the asterisk representing O-glycosylation sites, and arrows indicating N-glycosylation sites; B: 磷酸化位點(diǎn)，加粗字母表示磷酸化位點(diǎn)Phosphorylation sites, bold letters indicating phosphorylation sites; C: GPI錨定位點(diǎn)，下劃線表示GPI錨定位點(diǎn)GPI anchoring site, the underline indicating the GPI anchor sites.

基因座位共線性分析結(jié)果表明，AAJ76_140036761基因與家蠶微孢子蟲CQ1 contig上的NBO_32g0011基因在染色體上的基因座位具有共線性，說明二者的基因座位在東方蜜蜂微孢子蟲和家蠶微孢子蟲基因組中的基因座位比較保守。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，AAJ76_140036761與家蠶微孢子蟲的NBO_32g0011聚為一枝(圖2)，表明它們序列進(jìn)化關(guān)系較近，暗示其可能具有類似的生物學(xué)功能。但值得注意的是，在所有具有序列相似性的序列中，只有來自蝦肝腸胞蟲E.hepatopenaei的EHP00_6被注釋為信號(hào)識(shí)別顆粒受體(signal recognition particle receptor, SRPR)，其他的均被注釋為假定蛋白。

圖2 東方蜜蜂微孢子蟲孢壁蛋白AAJ76_140036761與其他微孢子蟲中同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of spore wall protein AAJ76_140036761 of Nosema ceranae and homologs of other insectsHSP: 假定蛋白Hypothetical protein; SRPR: 信號(hào)識(shí)別顆粒受體Signal recognition particle receptor. 圖中標(biāo)尺代表遺傳距離。Scale bar represents the genetic distance.

2.2 東方蜜蜂微孢子蟲孢壁蛋白AAJ76_140036761的原核誘導(dǎo)表達(dá)與純化

IPTG誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果表明，獲得一條約30 kD左右的差異性蛋白條帶(圖3)。經(jīng)過Ni-NAT預(yù)裝His親和層析柱純化后獲得一條目的蛋白，該蛋白質(zhì)的分子量與預(yù)測(cè)分子量大小一致，表明實(shí)驗(yàn)成功純化獲得重組蛋白AAJ76_140036761。將該蛋白作為抗原，免疫小鼠制備獲得多克隆抗體后，以制備獲得的多克隆抗體為一抗的Western blotting結(jié)果表明，在分子量大小約28 kD左右處雜交獲得一條明顯的條帶(圖4)，表明AAJ76_140036761的多克隆抗體能夠特異性地識(shí)別目的抗原重組蛋白AAJ76_140036761，可以用于后續(xù)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位研究。

圖3 東方蜜蜂微孢子蟲重組蛋白AAJ76_1400036761的原核表達(dá)與純化Fig. 3 Prokaryotic expression and purification ofthe recombinant protein AAJ76_1400036761of Nosema ceranaeM: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) Protein molecular weight marker; 1: 含pCold II質(zhì)粒, 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)pCold II plasmid without IPTG induction; 2: 含pCold II質(zhì)粒, 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)pCold II plasmid after induction with IPTG; 3: 含pCold II-AAJ76_1400036761質(zhì)粒，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)pCold II-AAJ76_1400036761 plasmid without IPTG induction; 4: 含pCold II-AAJ76_1400036761質(zhì)粒, 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)pCold II-AAJ76_1400036761 plasmid after induction with IPTG; 5: 純化后的AAJ76_1400036761蛋白 Purified AAJ76_1400036761 protein.

圖4 Western blot檢測(cè)東方蜜蜂微孢子蟲AAJ76_1400036761多克隆抗體的特異性Fig. 4 Specificity detection of polyclonal antibody of AAJ76_1400036761 of Nosema ceranae by Western blotM: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker; 1: 重組蛋白AAJ76_1400036761 Recombinant protein AAJ76_1400036761.

2.3 東方蜜蜂微孢子蟲孢壁蛋白AAJ76_1400036761在成熟孢子中的表達(dá)

Western blotting分析結(jié)果顯示在東方蜜蜂微孢子蟲總蛋白中，可以雜交獲得一條分子量大小約為28 kD的單一條帶(圖5)，其分子量與AAJ76_1400036761蛋白的預(yù)測(cè)分子量大小一致，表明Anti-761可以特異識(shí)別總蛋白中的AAJ76_1400036761蛋白，且該蛋白在成熟孢子中有表達(dá)。結(jié)果為后續(xù)開展該蛋白在東方蜜蜂微孢子蟲中的亞細(xì)胞定位奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

圖5 東方蜜蜂微孢子蟲總蛋白中AAJ76_1400036761的免疫印跡Fig. 5 Western blotting of AAJ76_1400036761 in totalproteins of Nosema ceranaeM: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker; 1: 東方蜜蜂微孢子蟲總蛋白Total proteins of N. ceranae.

2.4 東方蜜蜂微孢子蟲孢壁蛋白AAJ76_1400036761的亞細(xì)胞定位

間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，在東方蜜蜂微孢子蟲成熟孢子周圍發(fā)現(xiàn)一圈明亮的綠色熒光(圖6)，與白光下的成熟孢子疊加后發(fā)現(xiàn)綠色熒光信號(hào)分布在東方蜜蜂微孢子蟲的孢壁上面，表明AAJ76_1400036761蛋白可以定位到成熟孢子的表面，可能為東方蜜蜂微孢子蟲的孢壁蛋白。

圖6 間接免疫熒光法分析AAJ76_140036761在東方蜜蜂微孢子蟲中的定位Fig. 6 Localization of AAJ76_140036761 in Nosema ceranae by indirect immunofluorescence method以鼠陰性抗體為一抗孵育組為對(duì)照。Incubation group with mouse negative antibody as the primary antibody was used as the control. Anti-761: AAJ76_140036761蛋白的多克隆抗體Polyclonal antibody of protein AAJ76_140036761; Alexa Fluor 488: 熒光抗體，作為二抗Fluorescent antibody as the secondary antibody; DAPI: 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚，用于核酸染色4,6-Diamidino-2-phenylindole, for nucleic acid staining.

免疫膠體金定位分析結(jié)果表明，陰性對(duì)照組中的孢子內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)明顯的黑色膠體金顆粒定位信號(hào)(圖7: A)，而實(shí)驗(yàn)組中黑色的膠體金顆粒主要在成熟微孢子蟲的孢壁上有分布，且在孢子內(nèi)壁分布明顯(圖7: B, C)。這一結(jié)果與該蛋白的間接免疫熒光定位分析結(jié)果一致，說明AAJ76_140036761確實(shí)在東方蜜蜂微孢子蟲的孢壁上有分布，是鑒定到的一種新的東方蜜蜂微孢子蟲孢壁蛋白。這可為后續(xù)進(jìn)一步開展AAJ76_140036761在參與孢子孢壁構(gòu)成等方面的功能研究打下堅(jiān)持的基礎(chǔ)。值得注意的是，免疫膠體金定位結(jié)果顯示膠體金顆粒除了在孢壁上有定位外，在孢子近極管區(qū)域也有少量的分布(圖7: C)。結(jié)果暗示東方蜜蜂微孢子蟲孢壁蛋白AAJ76_140036761可能與極管蛋白存在相互作用。

圖7 AAJ76_140036761在東方蜜蜂微孢子蟲中的免疫膠體金定位Fig. 7 Localization of AAJ76_140036761 in Nosema ceranae using immune colloidal gold techniqueA: 陰性抗體處理的陰性對(duì)照組Negative control treated with negative antibody; B: AAJ76_140036761抗體處理的實(shí)驗(yàn)組Treatment group treated with antibody of AAJ76_140036761; C: AAJ76_140036761蛋白質(zhì)定位信號(hào)的放大觀察Amplification observation of location signal of AAJ76_140036761 protein. 黑色三角形表示AAJ76_140036761蛋白在孢壁上的定位；箭頭表示AAJ76_140036761蛋白在極管區(qū)域的定位。The black triangle indicates the location of the AAJ76_140036761 protein at spore wall. The arrow indicates the location of the AAJ76_140036761 protein at the area of polar tube.

2.5 AAJ76_1400036761重組蛋白與幾丁質(zhì)殼的互作

微孢子蟲的孢壁分為內(nèi)壁和外壁，其中幾丁質(zhì)層為孢子內(nèi)壁的主要成分，起著銜接原生質(zhì)膜和孢子外壁的橋梁作用。由上述蛋白質(zhì)定位結(jié)果可知，AAJ76_140036761可以定位于孢子內(nèi)壁，進(jìn)一步的幾丁質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，在重組蛋白AAJ76_1400036761孵育幾丁質(zhì)殼的泳道中發(fā)現(xiàn)了一條明顯的蛋白質(zhì)條帶(圖8)，其與結(jié)合前的重組蛋白AAJ76_1400036761分子量大小一致，表明重組蛋白AAJ76_1400036761能夠與蜜蜂微孢子蟲的幾丁質(zhì)殼結(jié)合，其可能參與了蜜蜂微孢子蟲孢子內(nèi)壁的構(gòu)成。

圖8 重組蛋白AAJ76_140036761與東方蜜蜂微孢子蟲幾丁質(zhì)殼的互作Fig. 8 Interaction between recombinant proteinAAJ76_140036761 and the chitin spore coat ofNosema ceranaeM: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker; S0: 重組蛋白 AAJ76_140036761與幾丁質(zhì)殼孵育后的上清Supernatant of the recombinant protein AAJ76_140036761 after incubation with chitin spore coats; S: 與重組蛋白 AAJ76_140036761孵育后幾丁質(zhì)殼經(jīng)10次清洗后的上清Supernatant of chitin spore coats after 10 times of washing after incubation with the recombinant protein AAJ76_140036761; P: 與重組蛋白 AAJ76_140036761孵育后的幾丁質(zhì)殼經(jīng)10次清洗后的沉淀Precipitation of chitin spore coats after 10 times of washing after incubation with the recombinant protein AAJ76_140036761. 在P泳道中的條帶表示重組蛋白 AAJ76_140036761可以結(jié)合到幾丁質(zhì)殼上。The band in line P indicates that the recombinant protein AAJ76_140036761 can bind with chitin spore coats.

3 討論

微孢子蟲表面有著由蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)組成的較厚的孢壁，其在微孢子蟲抵御外界不良環(huán)境而得以生存的過程中扮演重要的角色(Vávra and Larsson, 1976)。同時(shí)，作為微孢子蟲與宿主細(xì)胞最先接觸的組織，孢壁蛋白在參與孢壁構(gòu)成與侵染宿主的過程中也起到十分關(guān)鍵的功能(Jaroenlaketal., 2018; Yangetal., 2018)。本研究在東方蜜蜂微孢子蟲中鑒定出一種新的孢壁蛋白AAJ76_140036761，間接免疫熒光定位分析和免疫膠體金定位研究結(jié)果表明該蛋白可以定位在孢壁上(圖6和7)，且主要分布在孢子內(nèi)壁上，表明其可能參與了孢子內(nèi)壁的組成。在對(duì)家蠶孢壁蛋白NbSWP26的研究過程中發(fā)現(xiàn)該蛋白能夠參與孢子內(nèi)壁構(gòu)成，同時(shí)在介導(dǎo)對(duì)宿主細(xì)胞的粘附與侵染的過程中也發(fā)揮重要的功能(Lietal., 2009)；而家蠶類IG蛋白BmTLP(turtle-like protein)作為互作蛋白，介導(dǎo)了孢子與宿主細(xì)胞粘附，進(jìn)而提高孢子對(duì)宿主的侵染力(Zhuetal., 2013; Shravanetal., 2020)。積極探尋AAJ76_140036761蛋白與孢子自身及宿主細(xì)胞中的互作蛋白并研究其互作機(jī)制，成為后續(xù)系統(tǒng)揭示AAJ76_140036761蛋白生物學(xué)功能的重要研究?jī)?nèi)容之一。

微孢子蟲的孢壁分為內(nèi)壁和外壁，其中幾丁質(zhì)層為孢子內(nèi)壁的主要成分，起著銜接原生質(zhì)膜和孢子外壁的橋梁作用。本研究發(fā)現(xiàn)，孢壁蛋白AAJ76_140036761定位于孢子內(nèi)壁，且其能夠與蜜蜂微孢子蟲的幾丁質(zhì)殼結(jié)合(圖8)。在家蠶微孢子蟲中，rSWP26, rNbSWP30和NbSWP32都被證明可以結(jié)合到家蠶微孢子蟲的幾丁質(zhì)殼上，而NbSWP25則不具有類似的生物學(xué)功能(Yangetal., 2014b)。孢壁蛋白與幾丁質(zhì)殼的結(jié)合表明其可能參與了孢壁的構(gòu)成，對(duì)保持孢子完整形態(tài)，保護(hù)成熟孢子不受外界傷害等方面行使功能(Yangetal., 2014b)。這就表明AAJ76_140036761蛋白參與了蜜蜂微孢子蟲孢子內(nèi)壁的構(gòu)成，在維持孢壁完整性上能夠起到一定的作用。

極管作為微孢子蟲特有的侵染器官，在其侵染宿主細(xì)胞過程中扮演了重要的角色(Han and Weiss, 2017)。孢壁在孢子侵染宿主過程中最先與宿主細(xì)胞接觸，其在粘附宿主細(xì)胞與起始侵染過程中發(fā)揮重要功能(Lietal., 2009; Jaroenlaketal., 2018)。孢壁與極管都被認(rèn)為是所有微孢子蟲共有的特殊的侵染裝置(Hanetal., 2017)。在本研究中，免疫膠體金定位結(jié)果顯示膠體金顆粒除了在孢壁上有定位信號(hào)外，在孢子極管區(qū)域也有少量的分布，這表示東方蜜蜂微孢子蟲孢壁蛋白AAJ76_140036761可能與其自身極管蛋白存在相互作用。前人的研究表明，家蠶微孢子蟲NbSWP9可以定位于孢子母細(xì)胞和成熟孢子的極管部位，且NbSWP9可以與極管蛋白相互作用，其作為支架蛋白參與了極管與孢子壁的連接(Yangetal., 2017)。NbSWP5則能夠通過與極管蛋白互作而影響孢子發(fā)芽，且能保護(hù)孢子免受細(xì)胞吞噬(Caietal., 2011; Lietal., 2012)。類似地，家蠶孢壁蛋白NbSWP5和EOB14572同樣被證明可以與極管蛋白相互作用，其功能與孢壁構(gòu)成及孢子發(fā)芽相關(guān)(Lietal., 2012; Wangetal., 2017)。這就暗示孢壁蛋白AAJ76_140036761在孢子發(fā)芽及極管固定過程中可能行使一定的生物學(xué)功能，進(jìn)一步篩選與之互作的極管蛋白，深入揭示該蛋白與極管蛋白的互作機(jī)制，成為后續(xù)AAJ76_140036761功能分析的另一個(gè)重要內(nèi)容。

本研究制備了針對(duì)孢壁蛋白AAJ76_140036761特異性較好的多克隆抗體，基于這種抗體進(jìn)行的亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明AAJ76_140036761蛋白可以定位于東方蜜蜂微孢子蟲的孢壁上，其能夠與東方蜜蜂微孢子蟲的幾丁質(zhì)殼互作，AAJ76_140036761蛋白在極管部位的分布暗示該蛋白可能與極管存在互作。研究結(jié)果為后續(xù)系統(tǒng)開展AAJ76_140036761蛋白在孢子孢壁構(gòu)成、對(duì)孢子發(fā)芽影響及其與極管蛋白的互作機(jī)制等方面研究提供科學(xué)依據(jù)，為深入揭示東方蜜蜂微孢子蟲孢壁蛋白生物學(xué)功能及微孢子蟲致病機(jī)理提供參考。