阿司匹林水解反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)測定實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)

張勝紅，戚傳松，榮華，龔良發(fā)，李巍

北京石油化工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，北京 102617

阿司匹林(又名乙酰水楊酸)是一種常見的非甾體藥物，廣泛用于解熱、陣痛、抗炎和抗血栓等方面[1]。阿司匹林的合成是有機(jī)化學(xué)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)[2–4]，阿司匹林片劑的制劑、溶出和質(zhì)量分析也是藥物化學(xué)及相關(guān)專業(yè)的綜合性實(shí)驗(yàn)[5]，但其水解實(shí)驗(yàn)，作為阿司匹林綜合實(shí)驗(yàn)的重要一環(huán)，至今尚未納入國內(nèi)大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程。究其原因，現(xiàn)行阿司匹林水解反應(yīng)動力學(xué)的測定主要基于絡(luò)合顯色法[6–9]，即采用可溶性Fe3+鹽與阿司匹林水解產(chǎn)物水楊酸(見圖1)在酸性條件下形成穩(wěn)定的紫色絡(luò)合物，然后利用可見分光光度法監(jiān)測水楊酸絡(luò)合物在波長～525 nm處的吸光度并間接測定阿司匹林的含量。該方法在實(shí)驗(yàn)原理和操作層面存在以下不足：

圖1 阿司匹林水解反應(yīng)方程式

(1) Fe3+和水楊酸絡(luò)合顯色的pH值窗口較窄，介于2.5–3.5之間，這直接導(dǎo)致可溶性Fe3+鹽存在時(shí)只能測定酸性條件下阿司匹林水解反應(yīng)的動力學(xué)數(shù)據(jù)，難以模擬藥物存儲環(huán)境測定中性條件下阿司匹林水解反應(yīng)的動力學(xué)。

(2) 若采用反應(yīng)液取樣和Fe3+絡(luò)合顯色，實(shí)驗(yàn)操作過程繁瑣，需要準(zhǔn)確移取一定量的反應(yīng)液加入到特定pH值(通常為緩沖溶液)和Fe3+濃度的顯色溶液；此外，該方法無法排除顯色過程，尤其是緩沖溶液的低pH值(2.5–3.5)對阿司匹林水解反應(yīng)的影響。

(3) 絡(luò)合顯色法需要事先明確絡(luò)合物的穩(wěn)定性、檢出限和標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性區(qū)間，額外增加了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容并延長了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，難以適應(yīng)常規(guī)物理化學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)(4學(xué)時(shí))的要求。

為規(guī)避化學(xué)衍生顯色法的弊端，張彩云等[10]基于水楊酸在275 nm和316 nm具有等吸收點(diǎn)的特性，采用雙波長紫外分光光度法成功消除水楊酸對阿司匹林的干擾，測定了阿司匹林水解反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)并據(jù)此推測阿司匹林水溶液的有效期。但該方法未采用緩沖溶液穩(wěn)定反應(yīng)體系的pH，忽略了產(chǎn)物水楊酸(pKa= 2.98)對溶液pH以及阿司匹林水解速率的影響，在原理上存在瑕疵。

借鑒上述研究成果，本文嘗試從實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容方面進(jìn)一步改進(jìn)阿司匹林水解實(shí)驗(yàn)。具體而言，采用近中性的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖體系(pH = 6.85，25 °C)模擬中性條件下阿司匹林水溶液的存儲環(huán)境，采用紫外分光光度法監(jiān)測產(chǎn)物水楊酸的吸光度并直接利用測得的吸光度替代濃度推導(dǎo)反應(yīng)的速率常數(shù)。改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方案不僅簡化了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和操作過程，縮短了反應(yīng)時(shí)間，而且在大幅度減少藥品使用種類和數(shù)量的同時(shí)避免了含酸廢液的生成，符合物理化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

阿司匹林和水楊酸的pKa分別為3.57和2.98，在近中性的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中二者主要以離子的形式存在并且對光的吸收集中在紫外區(qū)，如圖2所示。

圖2 阿司匹林和水楊酸在NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中的紫外-可見吸收光譜

其中，水楊酸的最大吸收波長為296 nm，而阿司匹林在此波長時(shí)幾乎不存在吸收(由于阿司匹林在常溫下亦能水解，采用5 × 10?4mol·L?1的溶液實(shí)際測得水楊酸和阿司匹林在296 nm處的摩爾吸光系數(shù)之比大于100/1)。因此，理論上可以忽略阿司匹林的影響，采用296 nm波長時(shí)的吸光度A監(jiān)測水楊酸的濃度以及阿司匹林水解反應(yīng)的進(jìn)度[11]。

阿司匹林在pH恒定的水溶液中的水解反應(yīng)為準(zhǔn)一級反應(yīng)，反應(yīng)速率與阿司匹林的濃度呈正比，即：

式中c為時(shí)間t時(shí)阿司匹林的濃度，k為速率常數(shù)。式(1)積分可得：

其中，c0為阿司匹林的初始濃度。根據(jù)Lambert-Beer定律，反應(yīng)未開始、反應(yīng)達(dá)到平衡和反應(yīng)過程中任意時(shí)間t時(shí)溶液在296 nm處的吸光度(記作A0，A∞和At)可以分別采用式(3–5)進(jìn)行表示?？紤]到實(shí)驗(yàn)測定A∞的數(shù)值需要等待較長的時(shí)間，可以合理假設(shè)阿司匹林完全水解并采用濃度為c0的水楊酸溶液的吸光度數(shù)值代替反應(yīng)平衡時(shí)水解溶液的吸光度A∞[11]。

式(3–5)中，b為石英樣品池的內(nèi)部寬度，ε和ε'分別為阿司匹林和水楊酸的摩爾吸光系數(shù)。將式(3–5)聯(lián)立，得：

進(jìn)一步將式(6)和(7)代入式(2)得：

以ln(A∞?At)對t作圖，由其斜率即可求得反應(yīng)的速率常數(shù)k。假設(shè)阿司匹林水解反應(yīng)的活化能在實(shí)驗(yàn)溫度區(qū)間為定值，則可由不同溫度下的k值和式(9)中的Arrhenius方程計(jì)算阿司匹林水解反應(yīng)的表觀活化能Ea。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

主要實(shí)驗(yàn)儀器：G-10雙光束紫外可見分光光度計(jì)(讓奇(上海)儀器科技有限公司)；SYC-15c超級恒溫水浴(南京桑力電子設(shè)備廠)；電子分析天平，容量瓶，100 mL玻璃試管。

試劑：阿司匹林，水楊酸，NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Parafilm封口膜，瑞士Bemis公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

(1) 配制溶液：以NaH2PO4和Na2HPO4濃度均為0.025 mol·L?1的緩沖溶液為溶劑，分別配制5 × 10?4mol·L?1的阿司匹林溶液和水楊酸溶液。

(2) 打開紫外-可見分光光度計(jì)，待儀器穩(wěn)定后以緩沖溶液為參照分別測定阿司匹林和水楊酸溶液的紫外-可見吸收光譜，確定水楊酸的最大吸收波長以及此波長時(shí)二者的摩爾吸光系數(shù)。

(3) 打開恒溫水浴裝置并設(shè)定目標(biāo)溫度為60 °C，待溫度穩(wěn)定后將盛有約60 mL阿司匹林溶液的大試管置入水浴中，同時(shí)開始計(jì)時(shí)。每隔30 min吸取適量反應(yīng)液滴入石英比色皿中并置于大量室溫水浴中冷卻2 min，然后以緩沖溶液為參比測定反應(yīng)液在296 nm處的吸光度，每個(gè)樣品重復(fù)測量三次并對結(jié)果取平均值。反應(yīng)時(shí)長控制為180 min。

(4) 采用和步驟(3)相似的方法測定80 °C時(shí)阿司匹林水解反應(yīng)液的吸光度，取樣間隔和反應(yīng)時(shí)長分別控制為20和80 min。

2 結(jié)果與討論

不同溫度下阿司匹林水解反應(yīng)液在296 nm處的吸光度A隨時(shí)間t的變化如圖3(a)所示，其中，A0和A∞分別為0.0145和1.5991。以ln(A∞?At)對t作圖，結(jié)果如圖3(b)所示，60 °C和80 °C的數(shù)據(jù)點(diǎn)均呈現(xiàn)明顯的線性相關(guān)(擬合直線的線性回歸決定系數(shù)R2分別為0.9999和0.9997)，證實(shí)上述條件下阿司匹林水解遵從準(zhǔn)一級反應(yīng)動力學(xué)。由擬合直線斜率計(jì)算出60 °C和80 °C時(shí)阿司匹林水解反應(yīng)的k值分別為4.65 × 10?3和2.03 × 10?2min?1，進(jìn)而根據(jù)式(9)中的Arrhenius公式得出阿司匹林在60–80 °C近中性緩沖溶液中水解反應(yīng)的平均表觀活化能Ea為72.0 kJ·mol?1。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[12]，pH為5–9時(shí)阿司匹林水解反應(yīng)的Ea為68.6–73.6 kJ·mol?1。改進(jìn)實(shí)驗(yàn)得到的Ea值與文獻(xiàn)結(jié)果吻合，同時(shí)也接近絡(luò)合顯色法測得的弱酸性介質(zhì)中阿司匹林水解反應(yīng)的活化能(69.8–73.0 kJ·mol?1)[6–8]，表明此改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性能夠比擬傳統(tǒng)絡(luò)合顯色法。

圖3 不同溫度下阿司匹林水解反應(yīng)液吸光度A (a)和ln(A∞ ? At) (b)隨反應(yīng)時(shí)間t變化關(guān)系圖

3 實(shí)驗(yàn)教學(xué)建議

3.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

鑒于實(shí)驗(yàn)中阿司匹林和水楊酸溶液濃度較低(5 × 10?4mol·L?1)且用量不多(250 mL和50 mL)，直接配制溶液容易導(dǎo)致較大的稱量誤差，需要采用逐級稀釋法配制。為減少學(xué)生配制溶液時(shí)的繁瑣操作和不必要的藥品浪費(fèi)，建議任課教師或?qū)嶒?yàn)員提前準(zhǔn)備足量的5 × 10?4mol·L?1的水楊酸溶液，以及NaH2PO4和Na2HPO4濃度均為0.025 mol·L?1的緩沖溶液。對于不穩(wěn)定的阿司匹林溶液，建議實(shí)驗(yàn)當(dāng)天配制濃度為5 × 10?3mol·L?1的母液以供學(xué)生稀釋后直接使用。

3.2 教學(xué)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)課堂教學(xué)中，任課教師可以通過阿司匹林的“一專多能”功效激發(fā)學(xué)生的興趣，引導(dǎo)他們思考：為什么常見的阿司匹林藥品是片劑而不是針劑或者口服液？進(jìn)而引出化學(xué)穩(wěn)定性是藥物劑型設(shè)計(jì)的關(guān)鍵因素，以及如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)測定阿司匹林水解反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)。教學(xué)策略方面，建議采用探究式教學(xué)法鼓勵學(xué)生質(zhì)疑阿司匹林水解反應(yīng)的準(zhǔn)一級反應(yīng)動力學(xué)特征并自己去證實(shí)，以培養(yǎng)其“質(zhì)疑–假設(shè)–求證–結(jié)論”的科學(xué)思維方法[13]。具體而言，任課教師不需要按部就班地講解實(shí)驗(yàn)原理、方法和內(nèi)容，而是應(yīng)該鼓勵學(xué)生對阿司匹林水解反應(yīng)動力學(xué)進(jìn)行大膽假設(shè)和小心求證。假設(shè)該反應(yīng)遵從一級反應(yīng)動力學(xué)，那么lnc應(yīng)該與t成線性關(guān)系，也就是ln(A∞?At)與t成線性關(guān)系；然后指導(dǎo)學(xué)生開展實(shí)驗(yàn)探究，采集和分析數(shù)據(jù)以明確ln(A∞?At)與t之間的關(guān)系。如果ln(A∞?At)與t線性相關(guān)，即證實(shí)阿司匹林水解反應(yīng)遵從一級反應(yīng)動力學(xué)并由此計(jì)算相關(guān)的速率常數(shù)和表觀活化能。

3.3 實(shí)驗(yàn)拓展

藥品的有效期通常是指25 °C時(shí)藥效損失10%所需的時(shí)間。假設(shè)阿司匹林在60?80 °C水解反應(yīng)的Ea為常數(shù)，則可進(jìn)一步引導(dǎo)學(xué)生利用實(shí)驗(yàn)測定的數(shù)據(jù)估算阿司匹林溶液在25 °C和近中性條件下的有效期。此外，任課教師還可以要求學(xué)生思考并在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中回答以下問題：(1) 阿司匹林溶液為什么要現(xiàn)用現(xiàn)配？其新鮮度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果理論上有無影響？(2) 查閱文獻(xiàn)，列舉至少三種測定阿司匹林水解反應(yīng)動力學(xué)的方法并評價(jià)其優(yōu)缺點(diǎn)。(3) 查閱文獻(xiàn)，分析溶液pH值影響阿司匹林水解反應(yīng)速率常數(shù)的規(guī)律并給出初步解釋。

3.4 注意事項(xiàng)

阿司匹林室溫下在水中的溶解度較小，配制溶液時(shí)可以采用超聲輔助溶解；為減少高溫水浴時(shí)阿司匹林溶液中水的蒸發(fā)，非取樣時(shí)間可以采用Parafilm封口膜對大試管進(jìn)行密封；為節(jié)約時(shí)間，雙人實(shí)驗(yàn)小組成員在配制溶液前應(yīng)預(yù)熱分光光度計(jì)和恒溫水浴，組內(nèi)分工分別測定60 °C和80 °C的反應(yīng)數(shù)據(jù)，組間共用彼此的恒溫水浴裝置(即相鄰兩組的水浴溫度分別設(shè)定為60 °C和80 °C)以保證每組同時(shí)進(jìn)行兩個(gè)溫度系列的阿司匹林水解實(shí)驗(yàn)。

4 結(jié)語

借鑒現(xiàn)有阿司匹林水解反應(yīng)動力學(xué)測定方法，創(chuàng)新性地發(fā)展了單波長紫外分光光度法測定阿司匹林水解反應(yīng)動力學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法。和傳統(tǒng)絡(luò)合顯色法相比，新方案大幅簡化了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和步驟，雙人實(shí)驗(yàn)小組通過合理分工協(xié)作能夠?qū)?shí)驗(yàn)時(shí)間控制在4小時(shí)以內(nèi)。因此，改進(jìn)后的阿司匹林水解實(shí)驗(yàn)有望發(fā)展成為面向藥學(xué)和醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生的化學(xué)動力學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)。