近自然管理對橡膠林土壤細(xì)菌組成及多樣性的影響*

李明美，全飛，孫樹晴，蘭國玉，楊川，吳志祥

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 橡膠研究所，海南 ?？?571101;2.海南大學(xué) 林學(xué)院，海南 ?？?570228;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州熱帶作物科學(xué)觀測試驗(yàn)站，海南 儋州 571737)

橡膠樹(Heveabrasiliensis)是典型的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，近年來東南亞地區(qū)橡膠樹的種植面積在不斷擴(kuò)大[1-3]。海南島的橡膠林分布廣泛，約占海南島總植被的四分之一，常規(guī)橡膠林已成為熱帶地區(qū)的主要植被類型[4]。橡膠林在區(qū)域生態(tài)平衡上有著重要作用，同時(shí)對于熱帶地區(qū)經(jīng)濟(jì)持續(xù)發(fā)展起著一定作用。1880年德國林學(xué)家Gayer第一次正式提出了“接近自然的林業(yè)”[5]，并于1898年率先提出了“人類盡可能按照森林的自然規(guī)律來進(jìn)行林業(yè)活動”的近自然林業(yè)思想，尊重森林生態(tài)系統(tǒng)的自然發(fā)展規(guī)律，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)和生態(tài)可持續(xù)的有機(jī)結(jié)合[6]。通常人工林因?yàn)闃浞N單一、結(jié)構(gòu)簡單，導(dǎo)致林分抵御病蟲害的能力相對較差，所以近自然管理的試驗(yàn)與研究十分重要。蘭國玉等[7]在海南省儋州市設(shè)立一個(gè)1 hm2的橡膠林固定樣地進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測橡膠林的多樣性特征，結(jié)果表明該樣地植物多樣性迅速恢復(fù)，其多樣性接近熱帶雨林。近自然管理后土壤微生物是否也在一定程度上增加，仍無相關(guān)報(bào)道。

橡膠林土壤微生物對于橡膠樹的生長和產(chǎn)量等有一定影響，同時(shí)對于土壤的肥力、土壤中的固氮和分解作用都有著重要的影響[8]。目前對于地上部植物和動物等多樣性的研究有很多，國內(nèi)對橡膠林群落物種多樣性已經(jīng)開展了一些研究[9]，但對土壤中細(xì)菌組成及多樣性的研究，特別是關(guān)于不同管理方式下橡膠林土壤細(xì)菌群落組成及多樣性的研究很少。我國近年來對于自然林業(yè)撫育技術(shù)等方面開展大量研究與實(shí)踐，如果能將近自然林理論應(yīng)用在橡膠產(chǎn)業(yè)中，對于橡膠林生物多樣性的恢復(fù)、實(shí)現(xiàn)天然橡膠產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展都有很大的幫助。細(xì)菌作為自然界的分解者，是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，參與著生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)。土壤中的細(xì)菌群落對植物生長有著重要的作用，土壤微生物多樣性是土壤生態(tài)系統(tǒng)的一個(gè)生命特征[10]，對自然的物質(zhì)循環(huán)具有重要意義。土壤細(xì)菌群落的組成和結(jié)構(gòu)可以作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康情況、生產(chǎn)力情況和環(huán)境干擾程度的新指標(biāo)[11-12]。土壤中細(xì)菌的主要作用是分解土壤中的有機(jī)質(zhì)，分解后的養(yǎng)分用于植物生長，土壤微生物對于物質(zhì)循環(huán)和土壤有機(jī)質(zhì)代謝起到重要的作用，是判斷土壤肥力的重要指標(biāo)之一，對于土壤微生物的研究，具有重要的意義[13-15]。

本研究通過對不同管理方式下橡膠林土壤中細(xì)菌的組成及多樣性、土壤中微生物生物功能進(jìn)行對比，探討近自然管理方式對橡膠林土壤細(xì)菌群落的影響，以期為橡膠林近自然管理方式下生物多樣性的恢復(fù)提供理論依據(jù)。

1 研究區(qū)概況與方法

1.1 研究區(qū)自然概況

試驗(yàn)區(qū)位于海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場四隊(duì)橡膠林。海南島位于中國南端，儋州市地處海南島的西北部，處于熱帶北緣，屬熱帶季風(fēng)氣候，常年受季風(fēng)氣候影響，旱雨季分明，雨熱同期，全年陽光充足，雨量充沛。儋州市全年平均氣溫為23.5 °C左右，最熱月為7月，最冷月為1月，5—10月為雨季，11月至翌年4月為旱季，年平均降水量可達(dá)到1 639 mm，年降水量在1 000～2 600 mm之間。

1.2 研究方法

1.2.1 樣地設(shè)置與基本情況

在海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)試驗(yàn)場四隊(duì)橡膠林中選取1 hm2生長狀況良好的橡膠林作為固定樣地，進(jìn)行近自然管理；另外在四隊(duì)橡膠林選取1 hm2生長狀況良好的常規(guī)橡膠林，進(jìn)行對比研究。試驗(yàn)區(qū)內(nèi)的橡膠樹均為2005年種植，2013年開割。

樣地內(nèi)種植的橡膠樹品種均為‘熱研7-33-97’，該品種適應(yīng)性良好，具有代表性。樣地地形平緩，海拔在70～100 m。在近自然管理前，林下僅有少量散穗弓果黍(Cyrtococcumpatens)、短葉黍(Panicumbrevifolium)等禾本科植物，近自然管理后，許多植物恢復(fù)生長，但群落結(jié)構(gòu)還是比較簡單。

1.2.2 樣品采集

在樣地等距選取3個(gè)樣點(diǎn)，作為3次重復(fù)，在每個(gè)樣點(diǎn)選取長勢良好的一棵橡膠樹，樹木之間距離50 m左右。采用四點(diǎn)取樣法，以選取的橡膠樹樹干為圓心，0.5 m為半徑，在圓上等距取4個(gè)點(diǎn)；去除表層5 cm的土壤，在5～20 cm土層采集土壤200 g；4個(gè)點(diǎn)土壤混勻，去除雜質(zhì)并過篩；其中500 g土壤裝入自封袋用于理化分析，再另取10 g土壤保存無菌離心管中，寫好編號并低溫保存，用于試驗(yàn)。于2014年3月、4月和7月分別進(jìn)行取樣，常規(guī)林和近自然管理林中都分別采集3個(gè)樣本作為重復(fù)，將樣品在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測試。

1.2.3 樣品分析與數(shù)據(jù)處理

土壤理化性質(zhì)和微生物功能測定參考魯如坤[16]的土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法。土壤含水率采用鮮土進(jìn)行烘干(105 ℃)法測定。土壤pH值使用pH計(jì)測定，土水比是1.0∶2.5。土壤有機(jī)質(zhì)測定采用重鉻酸鉀-外加熱法進(jìn)行測定；全鉀采用火焰光度計(jì)法測定；全磷采用鉬銻抗比色法測定；全氮采用靛酚藍(lán)比色法測定。

土壤微生物生物功能的測定方法如下：纖維素分解作用的測定采用埋布片法進(jìn)行，用布條失重的百分?jǐn)?shù)來表示；呼吸作用利用堿吸收滴定法進(jìn)行測定，以每公斤的土壤在單位時(shí)間(24 h)內(nèi)釋放的二氧化碳(mg)數(shù)來表示；微生物生物量碳采用精氨酸培養(yǎng)法，通過測定提取液中的NH4+-N來計(jì)算得到微生物生物量碳；氨化作用強(qiáng)度測定采用土壤培養(yǎng)法，用培養(yǎng)后土壤氨態(tài)氮含量和培養(yǎng)前土壤氨態(tài)氮含量的差值得到氨化作用強(qiáng)度；硝化作用強(qiáng)度測定采用溶液培養(yǎng)法，將培養(yǎng)后的過濾液采用比色法測定NO2-N的含量得到硝化作用強(qiáng)度；固氮作用采用土壤培養(yǎng)法，用單位時(shí)間單位重量土壤的全N含量增量表示固氮強(qiáng)度。

同時(shí)進(jìn)行Illumina公司MiSeq測序，從2%瓊脂糖凝膠中提取擴(kuò)增子，使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences,Union City，CA，U.S.)根據(jù)制造商的說明進(jìn)行純化，并使用QuantiFluor -ST(Promega，U.S.)進(jìn)行定量。將純化的擴(kuò)增子等摩爾合并，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案在Illumina MiSeq平臺上進(jìn)行配對末端測序(2×250)。

數(shù)據(jù)分析采用Excel和SPSS進(jìn)行Duncan多重比較等分析和相關(guān)分析，得到結(jié)果進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)林與近自然管理林土壤養(yǎng)分特征比較

從表1中可以看出，在常規(guī)橡膠林和近自然管理橡膠林的土壤理化性質(zhì)和養(yǎng)分對比中，兩者的pH值、有機(jī)質(zhì)和全磷含量對比存在顯著性差異。進(jìn)行近自然管理后，土壤的pH值升高，所以常規(guī)橡膠林的土壤酸性更強(qiáng)。對橡膠林進(jìn)行近自然管理后，土壤中有機(jī)質(zhì)含量有所降低，但土壤的全磷含量增加。

表1 常規(guī)林與近自然管理林土壤養(yǎng)分對比

2.2 常規(guī)林與近自然管理林土壤微生物生物功能比較

從圖1可以看出，常規(guī)橡膠林和近自然管理橡膠林的土壤微生物生物功能對比，微生物生物量碳、硝化作用和固氮作用都存在顯著性差異；纖維素分解、呼吸作用和氨化作用不存在顯著性差異。對橡膠林進(jìn)行近自然管理后，土壤微生物的生物功能中，微生物生物量碳、氨化作用、硝化作用和固氮作用都出現(xiàn)下降現(xiàn)象；呼吸作用出現(xiàn)增加現(xiàn)象。其中微生物生物量碳、硝化作用和固氮作用下降現(xiàn)象明顯。

圖1 常規(guī)林和近自然管理林土壤微生物生物功能比較

2.3 常規(guī)林與近自然管理林土壤細(xì)菌組成及多樣性比較

在門和科的水平上，對常規(guī)橡膠林和近自然管理橡膠林的土壤微生物豐富度進(jìn)行對比，從圖2可以看到，2種林分微生物物種組成在門水平和科水平均差異性不顯著，但在圖2a中，紅色部分代表的酸桿菌門是常規(guī)林多于近自然管理林。

圖2 常規(guī)林和近自然管理林土壤細(xì)菌在門和科水平上豐富度對比

不同季節(jié)中，在門的水平上，對常規(guī)橡膠林和近自然管理橡膠林的土壤微生物豐富度進(jìn)行對比，從圖3可以看到，圖3a中2種林分細(xì)菌物種組成在旱季時(shí)差異較明顯，物種組成上常規(guī)林的變形桿菌門、酸桿菌門、綠彎菌門均高于近自然管理林；近自然管理林的物種組成中，放線菌門、厚壁菌門高于常規(guī)林；圖3b中，在旱季—雨季時(shí)，近自然管理林中的疣微菌門和酸桿菌門高于常規(guī)林，變形桿菌門低于常規(guī)林；圖3c中，在雨季時(shí)，常規(guī)林的細(xì)菌組成中變形桿菌門和酸桿菌門高于近自然管理林。

圖3 不同季節(jié)時(shí)常規(guī)林和近自然管理林土壤細(xì)菌門水平上豐富度對比

從圖4可以看到，在OTU水平對兩種橡膠林土壤細(xì)菌物種進(jìn)行對比，2種管理方式下橡膠林的樣本點(diǎn)不接近，說明近自然管理橡膠林和常規(guī)橡膠林中土壤細(xì)菌的物種組成差異不顯著。

圖4 常規(guī)林和近自然管理林土壤細(xì)菌OTU水平上豐富度對比

累計(jì)多樣性分析曲線是在OTU水平用于描述對著樣本量的加大，物種總量和核心物種數(shù)量的變化情況。圖5a、圖5b、圖5c為不同季節(jié)時(shí)，常規(guī)林與近自然管理林的土壤細(xì)菌總量隨著樣本量的不斷增加的變化規(guī)律，可以看出，在不同季節(jié)時(shí)，隨著樣本量的不斷增加，常規(guī)林和近自然管理林的土壤細(xì)菌總量變化趨勢相同，都是在不斷增加。旱季時(shí)，常規(guī)橡膠林細(xì)菌物種總量高于近自然橡膠林；旱季—雨季時(shí)，2個(gè)橡膠林的細(xì)菌物種總量相同；雨季時(shí)，近自然橡膠林細(xì)菌物種總量高于常規(guī)橡膠林。從圖5d可以看出，將各季節(jié)樣本匯總進(jìn)行分析時(shí)，近自然管理林和常規(guī)林中隨著樣本量不斷增加，土壤細(xì)菌物種總量變化趨勢相似，都是不斷增加，并且近自然管理林土壤細(xì)菌物種總量始終高于常規(guī)林。

圖5 常規(guī)林和近自然管理林土壤細(xì)菌OTU水平上γ多樣性(伽瑪多樣性)對比

表2和圖6是對常規(guī)林和近自然管理林的土壤細(xì)菌進(jìn)行Alpha多樣性對比，在OTU水平對2個(gè)林種土壤樣品進(jìn)行Alpha多樣性對比，運(yùn)用t檢驗(yàn)，常規(guī)林和近自然管理林的土壤細(xì)菌的群落豐富度并沒有明顯的差別。

表2 常規(guī)林和近自然管理林土壤細(xì)菌OTU水平上Alpha多樣性對比

圖6 常規(guī)林和近自然管理林土壤細(xì)菌OTU水平上Alpha多樣性對比

3 討論與結(jié)論

3.1 近自然管理方式對橡膠林土壤養(yǎng)分特征及微生物生物功能的影響

根據(jù)已有研究可知，土壤的酸堿度對于土壤有機(jī)質(zhì)有著十分重要的影響[17-18]，不同的土地利用方式會影響土壤微生物群落的功能實(shí)現(xiàn)[19-20]。土壤有機(jī)質(zhì)含量是決定土壤細(xì)菌多樣性的重要因素[21]。根據(jù)本研究結(jié)果可知，在對橡膠林進(jìn)行近自然管理后，土壤pH值和全磷含量增加，有機(jī)質(zhì)含量降低。由此可得，土壤的微生物差異不僅與地上植被的差異有關(guān)，與不同的土地利用方式也有關(guān)，這與已有的研究結(jié)果相一致。常規(guī)橡膠林的土壤微生物硝化作用、固氮作用高于近自然管理林。常規(guī)林土壤有機(jī)質(zhì)高于近自然管理林，有機(jī)質(zhì)可以供應(yīng)土壤微生物所需的能量和養(yǎng)分，有利于微生物如固氮菌等的活動，所以固氮作用更高。根據(jù)中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所相關(guān)研究結(jié)果，酸性土壤中硝化作用更高，本研究土壤理化性質(zhì)的測定中得到，常規(guī)橡膠林土壤的pH值更低，因而其硝化作用高于近自然管理橡膠林。

3.2 近自然管理方式對橡膠林土壤細(xì)菌多樣性的影響

根據(jù)土壤理化性質(zhì)測定可知，常規(guī)林的土壤酸性比近自然管理林的更強(qiáng)。在門的水平上對比，常規(guī)橡膠林和近自然管理橡膠林的土壤細(xì)菌物種組成相同，常規(guī)林的酸桿菌門多于近自然管理林。因?yàn)樗釛U菌更喜酸性土壤，所以常規(guī)林土壤中酸桿菌門相對更多。已有研究表明，長期施用化肥會使土壤pH值降低[22-23]，常規(guī)林與近自然管理林相比會更多的施用化肥，所以化肥的施用是造成常規(guī)林土壤酸性更強(qiáng)的原因之一。在旱季—雨季時(shí)，近自然管理林土壤中酸桿菌門高于常規(guī)林，與全年結(jié)果對比不同。多數(shù)研究表明，土壤中酸桿菌的豐度與土壤pH值呈負(fù)相關(guān)[24]，但也有研究發(fā)現(xiàn)，酸桿菌的相對豐度和土壤pH值的相關(guān)性不顯著，還受其它環(huán)境因子的影響[25-27]。在旱季—雨季時(shí)由于含水量、N等因素的不同造成影響，使近自然管理林土壤中酸桿菌門更多。土壤全氮、全碳和全磷含量增加為氨氧化微生物的生長提供了充足的能源和碳源，促進(jìn)了細(xì)菌數(shù)量的增加，是細(xì)菌數(shù)量增加的重要因素[28]。所以，橡膠林在進(jìn)行近自然管理后，全磷含量增加，促進(jìn)了細(xì)菌數(shù)量的增加。在OTU水平進(jìn)行的橡膠林土壤細(xì)菌多樣性研究可知，進(jìn)行累計(jì)多樣性分析時(shí)，常規(guī)林和近自然管理林細(xì)菌物種豐富度隨著樣本量增加變化趨勢相同，都是在不斷增加，但近自然管理林的土壤細(xì)菌物種數(shù)目始終高于常規(guī)林。植物物種豐度和植物功能多樣性對土壤細(xì)菌群落的活性和多樣性有成正比的影響[29]。蘭國玉等[30]研究表明，近自然管理后橡膠林群落物種多樣性較高，所以近自然管理后橡膠林土壤細(xì)菌豐富度更高。在OTU水平上進(jìn)行的PCoA分析和Alpha多樣性分析中，常規(guī)林和近自然管理林的土壤細(xì)菌多樣性沒有顯著性差異。因此，對橡膠林進(jìn)行近自然管理不會造成土壤中細(xì)菌組成和多樣性發(fā)生很大改變，但會對土壤細(xì)菌多樣性的恢復(fù)有一定幫助。研究表明季節(jié)是橡膠林土壤細(xì)菌組成與多樣性的驅(qū)動因子之一，這與之前蘭國玉等[30]的研究結(jié)果一致，但值得注意的是近自然管理對季節(jié)變化的響應(yīng)是不一致的。

3.3 近自然管理方式對橡膠林群落微生物多樣性的影響

常規(guī)橡膠林由于受人為生產(chǎn)活動的影響，群落內(nèi)物種多樣性比較低，經(jīng)過研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，橡膠林實(shí)行近自然管理后，其群落物種多樣性并不低[7]，更為重要的是近自然管理后橡膠林的產(chǎn)量并不低于常規(guī)管理橡膠林[31]。目前國內(nèi)外對有關(guān)地上植物群落與微生物群落開展了大量研究，發(fā)現(xiàn)土壤細(xì)菌物種多樣性受溫度、水分、植物生長發(fā)育等條件的綜合影響[32-33]，地上植物群落多樣性和豐富度升高使細(xì)菌多樣性相應(yīng)增加[34]。植物可以影響微生物群落結(jié)構(gòu)，植被通過影響土壤環(huán)境，從而影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，土壤細(xì)菌多樣性與土壤上的植物群落多樣性呈正相關(guān)[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，對橡膠林進(jìn)行近自然管理后，有利于土壤微生物多樣性的提高，近自然管理對于橡膠林生物多樣性的恢復(fù)有重要意義。

土壤微生物與全球生物化學(xué)循環(huán)、全球生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定有著十分密切的關(guān)系，通過研究土壤微生物多樣性的影響因素可了解土壤微生物和土壤環(huán)境條件的改變及人類對土壤的利用之間的聯(lián)系，為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的研究和土壤生態(tài)環(huán)境的保護(hù)提供理論依據(jù)[36]。近自然管理不僅可以提高橡膠林的生物多樣性，同時(shí)可以降低管理成本和人工成本，近自然管理方式在橡膠林中的應(yīng)用對橡膠林生物多樣性恢復(fù)和橡膠林的可持續(xù)發(fā)展都提供了重要的幫助。