基于偏最小二乘回歸法分析訶子對潰瘍性結(jié)腸炎“肺腸同治”的譜效關(guān)系

王 巍， 張 強(qiáng)， 杜春潔， 鞠成國

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性腸道炎癥性疾病，臨床主要表現(xiàn)為黏液膿血便、腹瀉、腹痛及里急后重等，與中醫(yī)“腸澼”相對應(yīng)。其病因至今尚不完全清楚，目前認(rèn)為主要與飲食和生活方式不規(guī)律以致腸道菌群失調(diào)、黏液和上皮屏障功能缺陷有關(guān)[1]?，F(xiàn)代臨床治療多以水楊酸類、糖皮質(zhì)激素以及免疫抑制劑等藥物聯(lián)用，但存在療效不穩(wěn)定、肝腎毒性、藥物依賴性等問題[2]，因此尋找安全有效的中醫(yī)藥療法成為當(dāng)務(wù)之急。中醫(yī)理論認(rèn)為本病病位在大腸，病在血分，氣血凝滯，病久及肺[3]，因此目前從肺腸合治法論治潰瘍性結(jié)腸炎研究較多[4]。訶子收載于《中國藥典》2020 年版一部，為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.及絨毛訶子TerminaliachebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果實，其味苦、酸、澀，性平，歸肺、大腸經(jīng)，具有澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽的功效[5]。由于訶子主歸肺與大腸經(jīng)，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)常用其治療“腸澼”，本課題組前期對其治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥效學(xué)進(jìn)行研究，結(jié)果表明訶子水提物可顯著改善潰瘍性結(jié)腸炎模型動物癥狀。本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，建立訶子水提物HPLC指紋圖譜，以偏最小二乘(partial least squares，PLS)回歸法分析其“肺腸同治”的譜效關(guān)系，為訶子對潰瘍性結(jié)腸炎“肺腸同治”藥效物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥材 10批訶子經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定，均為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.的干燥成熟果實，具體信息見表1。

表1 樣品信息

1.2 動物 SPF級昆明小鼠，雄性，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號 SCXK(遼)2015-0001，體質(zhì)量(20±2)g。

1.3 試劑與藥物 小鼠白細(xì)胞介素10(IL-10)(批號20171014GP)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)(批號20171014HS)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)(批號20171014JA)、髓過氧化物酶(MPO)(批號20170328CT)試劑盒均購自上海朗頓生物科技有限公司；葡聚糖硫酸鈉(DSS)(批號9011-18-1)，購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；沒食子酸(批號MUST-13040103，純度≥98%)、鞣花酸(批號MUST-14031010，純度≥98%)對照品均購自成都曼思特生物科技有限公司；訶黎勒酸(批號PRF8112302，純度≥98%)、訶子酸(批號PRF8071201，純度≥98%)對照品均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司。甲醇為色譜純，磷酸為分析純，購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；水為超純水。

1.4 儀器 安捷倫1100高效液相色譜系統(tǒng)(美國 Agilent公司)；FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)(常州市國旺儀器制造有限公司)；Multiskan Mk 3酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Fresco臺式高速冷凍離心機(jī)(德國Heraeus公司)；FA1004B分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 藥效實驗

2.1.1 訶子水提液制備 取各批藥材，砸取果肉，粉碎，稱取適量，加10倍量水浸泡0.5 h，加熱回流提取3次，每次1 h，濾過，合并濾液，預(yù)留適量濾液，供HPLC指紋圖譜用；剩余濾液分別濃縮成質(zhì)量濃度為0.13 g/mL的溶液，作為給藥溶液(以2020年版《中國藥典》所載訶子最大服用量按小鼠體表系數(shù)換算方法折算)備用[6]。

2.1.2 動物分組、造模及給藥 按隨機(jī)對照原則將小鼠分為空白組、模型組及訶子給藥組(2.6 g/kg，S1～S10)，每組10只。除空白組外，其余各組小鼠每日自由飲用2.5% DSS水溶液，空白組自由飲用純凈水，連續(xù)4 d，以小鼠毛色晦暗、腹瀉及聚堆現(xiàn)象明顯、糞便隱血測試陽性為造模成功[7]。實驗第5天，各組小鼠均自由飲用純凈水，然后訶子組每天按0.4 mL/20 g劑量灌胃給藥溶液，空白組、模型組小鼠灌胃同等劑量純凈水，連續(xù)7 d。

2.1.3 指標(biāo)檢測 末次給藥后，各組小鼠禁食不禁水24 h，脫頸處死，剖開腹腔及胸腔，剝離結(jié)腸和肺，生理鹽水沖洗血污，吸水紙上吸掉生理鹽水，稱定質(zhì)量，加10倍量生理鹽水充分勻漿，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，采用ELISA法對組織勻漿中IL-10、IL-1β、TNF-α、MPO水平進(jìn)行測定[6-7]。

2.2 HPLC指紋圖譜建立

2.2.1 供試品溶液制備 取“2.1.1”項下預(yù)留訶子水提液30 mL回收溶劑，70%甲醇復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶，定容，再精密吸取1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，吸取適量，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸、訶黎勒酸、訶子酸、鞣花酸對照品適量，甲醇制成分別含四者0.022 4、0.157 0、0.119 0、0.035 1 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 色譜條件 Diamonsil Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相甲醇(A)-0.1%磷酸水(B)，梯度洗脫(0～8 min，95.0%～90.0%B；8～15 min，90.0%～75.0%B；15～25 min，75.0% B；25～30 min，75.0%～70.0% B；30～50 min，70.0%～55.0%B；50～55 min，55.0%B)；體積流量1.0 mL/min；檢測波長270 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般體征 造模后，小鼠毛色晦暗，伴有炸毛、聚堆現(xiàn)象，腹瀉明顯，體質(zhì)量下降，糞便隱血檢測呈陽性，訶子干預(yù)后上述現(xiàn)象均好轉(zhuǎn)。

3.2 訶子對小鼠肺腸組織中細(xì)胞因子的影響 模型組小鼠肺與結(jié)腸IL-10水平低于空白組，IL-1β、TNF-α、MPO水平均高于空白組；與模型組比較，訶子組IL-10水平升高，IL-1β、TNF-α、MPO水平降低，見表2。

表2 訶子對小鼠結(jié)腸與肺IL-10、IL-1β、TNF-α、MPO水平的影響

3.3 HPLC指紋圖譜建立

3.3.1 圖譜生成 取“2.2.1”項下供試品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下測定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2004A版)進(jìn)行共有峰匹配，得到指紋圖譜(圖1)，對各色譜峰進(jìn)行平滑、去噪、峰對齊后，生成對照指紋圖譜(圖2)，共標(biāo)記32個共有峰。取“2.2.2”項下對照品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下測定，與指紋圖譜對比，確定3號峰為沒食子酸，27號峰為訶黎勒酸，31號峰為訶子酸，32號峰為鞣花酸(圖3)，相似度見表3，共有峰峰面積見表4。

圖1 10批樣品HPLC指紋圖譜

圖2 10批樣品對照圖譜

圖3 對照品色譜圖

表3 10批樣品指紋圖譜相似度

表4 10批樣品共有峰峰面積

3.3.2 方法學(xué)考察 取供試品溶液(S1)，在“2.2.3”項色譜條件下進(jìn)樣6次，測得各共有峰相對保留時間RSD<0.8%，共有峰峰面積RSD<1.4%，色譜圖相似度>0.99，表明儀器精密度良好；取供試品溶液(S1)，于0、2、4、8、12、16 h在“2.2.3”項色譜條件下進(jìn)樣，測得各共有峰相對保留時間RSD<0.8%，共有峰面積RSD<1.2%，色譜圖相似度>0.99，表明溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；取藥材粉末(S1)6份，每份0.1 g，按“2.1.1”及“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項下色譜條件進(jìn)樣，計算各共有峰相對保留時間RSD<0.8%，共有峰面積RSD<1.2%，色譜圖相似度>0.98，表明該方法重復(fù)性良好。

3.3.3 譜效關(guān)系分析 以HPLC指紋圖譜中32個共有峰的峰面積為自變量(X)，編號為X1～X32，IL-10、IL-1β、TNF-α、MPO水平為因變量(Y)，將相關(guān)數(shù)據(jù)代入MINITAB 19 軟件，建立偏最小二乘回歸方程，得到肺與結(jié)腸組織中4種細(xì)胞因子與共有峰之間的回歸系數(shù)值，見表5。由于藥效的產(chǎn)生是對IL-10、IL-1β、TNF-α、MPO水平綜合調(diào)節(jié)作用的結(jié)果[8-10]，故進(jìn)一步以四者回歸系數(shù)的平均值來評價各色譜峰與潰瘍性結(jié)腸炎治療效果的相關(guān)度，結(jié)果見表5、圖4，可知與肺和結(jié)腸均呈正相關(guān)的色譜峰有8個，為峰1、8、9、10、19、20、27、32；均呈較大負(fù)相關(guān)的峰有5個，為峰3、12、13、15、26。

表5 各指標(biāo)回歸系數(shù)值

圖4 結(jié)腸與肺的平均回歸系數(shù)

4 討論

將供試品溶液在200～400 nm進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示在220、270 nm處呈現(xiàn)最大吸收，其中270 nm處訶黎勒酸、鞣花酸、訶子酸均呈較大吸收，并且為酚酸類成分測定所常用，因此本實驗采用270 nm作為檢測波長。

中藥具有多成分、多靶點的特點，其藥效的發(fā)揮是多種成分相互之間共同作用的結(jié)果。實踐證明，某些化學(xué)成分在中藥中含量較低，但其生物學(xué)活性卻很強(qiáng)，因此本實驗在建立指紋圖譜的過程中，將檢測到的所有色譜峰進(jìn)行共有峰匹配，共得到32個共有峰。進(jìn)一步地，將32個共有峰與藥效結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)，以確保最大程度地反應(yīng)成分與藥效之間的關(guān)系。

潰瘍性結(jié)腸炎的臨床癥狀主要為腹瀉、便血，本實驗采用DSS誘導(dǎo)制備小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，動物體質(zhì)量下降、聚堆明顯且便血嚴(yán)重，與臨床癥狀相符。潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠肺與結(jié)腸組織中促炎因子和抑炎因子失調(diào)，腸道內(nèi)環(huán)境紊亂，炎癥加重[11]；IL-1β、TNF-α為常見的促炎因子，IL-10為抑炎因子，MPO 為評價炎癥程度的重要指標(biāo)[12]。經(jīng)訶子治療后，所選取的4項指標(biāo)治療組與模型組均具有顯著性差異，表明訶子改善潰瘍性結(jié)腸炎癥狀的作用與下調(diào)IL-1β、TNF-α，促進(jìn)IL-10產(chǎn)生及抑制MPO活性有關(guān)。

中醫(yī)理論認(rèn)為“肺與大腸相表里”，肺與腸相互絡(luò)屬，病理上相互影響，腸病日久，必會累及于肺[13]。“肺氣虛，大腸亦虛，而不能禁固，時時欲去，后重不已……”其指出肺氣虛弱，會累及大腸固攝作用，導(dǎo)致里急后重[14]，因此治療當(dāng)以升肺固腸共進(jìn)。本實驗所造潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠肺組織的各項炎癥因子水平測定結(jié)果表明結(jié)腸病變確實影響了肺，經(jīng)過訶子的治療，既減輕了腸道炎癥及腹瀉癥狀，又修復(fù)了肺部的損傷，達(dá)到了“肺腸同治”的作用。本實驗共得到4組炎癥有關(guān)的藥效指標(biāo)數(shù)值，每組數(shù)值與共有峰面積計算回歸系數(shù)，發(fā)現(xiàn)同一個色譜峰與不同指標(biāo)具有不同的回歸系數(shù)，說明某一成分對不同指標(biāo)調(diào)控作用是不同的[15]，而藥效的產(chǎn)生是化學(xué)成分對4種細(xì)胞因子綜合調(diào)控的結(jié)果，因此應(yīng)綜合考慮某一成分對4種因子的整體調(diào)控作用，故最終選擇四組回歸系數(shù)的平均值來確定關(guān)聯(lián)度。結(jié)果表明，色譜峰1、8、9、10、19、20、27、32與結(jié)腸和肺均呈正相關(guān)，色譜峰2與結(jié)腸呈較大正相關(guān)，色譜峰7、14、30與肺呈較大正相關(guān)，提示這12種成分應(yīng)為“肺腸同治”的主要藥效成分，其中27為訶黎勒酸，32為鞣花酸；色譜峰3、12、13、15、26與結(jié)腸和肺均呈較大的負(fù)相關(guān)，說明此5種成分不利于訶子對潰瘍性結(jié)腸炎治療作用的發(fā)揮。

綜上所述，本實驗通過偏最小二乘回歸分析法建立訶子水提物指紋圖譜與潰瘍性結(jié)腸炎模型動物肺與結(jié)腸組織中4種細(xì)胞因子之間的譜效關(guān)系，初步得到12種化學(xué)成分可能為訶子對潰瘍性結(jié)腸炎起治療作用的主要成分，為后續(xù)訶子治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥效物質(zhì)及作用機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。