地骨皮HPLC特征圖譜建立及灰分檢測(cè)

李 婷， 王丹丹， 趙林松， 高 崎， 聶依文， 吳佩穎,3*， 張 彤

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203；3.蕓豆數(shù)字科技有限公司，四川 成都 610031；4.上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司，上海 201703)

地骨皮為常用中藥，功能涼血除蒸、清肺降火，用于陰虛潮熱、骨蒸盜汗、內(nèi)熱消渴、肺熱咳嗽、咯血等癥[1]。2015年版《中國(guó)藥典》收載的地骨皮為枸杞LyciumchinenseMill.和寧夏枸杞Lycium.barbarumL.的干燥根皮[1]。春初或秋后采挖根部，洗凈，剝?nèi)「?，曬干[1]。中藥地骨皮來(lái)源于茄科枸杞屬植物，本屬植物約80種，主要分布在南美洲，少數(shù)種類分布于歐、亞大陸溫帶，《中國(guó)植物志》里記載我國(guó)產(chǎn)7種3變種[2-3]，全國(guó)大部分地區(qū)均有分布，其中主產(chǎn)于華北和西北地區(qū)，并且只有枸杞為廣布種。 華北地區(qū)是商品地骨皮的主產(chǎn)地，其中以山西省產(chǎn)量最大，主要是野生枸根皮作地骨皮用，主產(chǎn)于該省的平遙、陽(yáng)曲、晉城等地[4]。根據(jù)實(shí)際調(diào)查和研究，現(xiàn)作藥用的地骨皮主要來(lái)源于枸杞的根皮，同屬的寧夏枸杞和北方枸杞Lyciumchinensevar. Potaninii 根皮僅在個(gè)別地區(qū)作地骨皮用[5]。

國(guó)內(nèi)外在植物分類生藥鑒定、化學(xué)成分、藥理作用等方面對(duì)中藥地骨皮已作了一定的工作。地骨皮中含有生物堿類、酰胺類、有機(jī)酸類、黃酮類等多種成分[6]，其中酚類成分為地骨皮中主要成分，包括地骨皮甲素、地骨皮乙素、咖啡酰丁二胺等[7]。地骨皮甲素和地骨皮乙素屬于精胺類生物堿，體外實(shí)驗(yàn)表明，地骨皮甲素和乙素可以阻斷細(xì)胞的炎癥活化，避免免疫反應(yīng)紊亂等[8]，另外，還可以拮抗細(xì)菌內(nèi)毒素[9]，同時(shí)，地骨皮甲素和地骨皮乙素還是降壓的主要成分[10]。 地骨皮也是某些中成藥的主要組成藥味，如地骨降糖膠囊、十味降糖顆粒、養(yǎng)血退熱丸等。除藥用外，地骨皮還可用于輔助降血糖保健食品中。以地骨皮為主要原料制成的地骨皮露常用于體虛骨蒸、虛熱口渴等證的治療，具有涼營(yíng)血、解肌熱的功能[2]。2015年版《中國(guó)藥典》中，地骨皮檢驗(yàn)項(xiàng)除性狀、顯微、薄層、水分、總灰分、酸不溶性灰分外，并沒(méi)有含量測(cè)定項(xiàng)。陳倩倩等[11]對(duì)47批地骨皮飲片進(jìn)行質(zhì)量分析，發(fā)現(xiàn)各廠家地骨皮質(zhì)量差異較大，潔凈度差和摻偽問(wèn)題是不合格的主要原因。為了提高地骨皮藥材質(zhì)量，保障臨床用藥的安全有效，本實(shí)驗(yàn)在前人工作的基礎(chǔ)上，對(duì)地骨皮類藥材進(jìn)行含量測(cè)定、特征指紋圖譜、灰分等方面的系統(tǒng)研究，以期為地骨皮藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制提供參考。

1 材料

1.1 藥材 21批地骨皮購(gòu)自成都誠(chéng)實(shí)通貿(mào)易有限公司，均為野生資源，由上海中醫(yī)藥大學(xué)張彤教授鑒定為正品，具體信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息

1.2 儀器與試劑 Agilent1260系列高效液相色譜儀(四元泵、DAD檢測(cè)器)，配置Chemstation色譜工作站(美國(guó)Agilent公司)；BS124S型電子天平(萬(wàn)分之一， 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；XS105DU型電子天平(十萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；JP-100 型數(shù)控超聲波清洗器(深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)； Thermo Sorvall ST16R 高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；HH-S2 四孔智控水浴鍋(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；SXL-1008程控箱式電爐(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

地骨皮乙素對(duì)照品(批號(hào)120099-201903，純度≥98%，安徽西青果生物科技有限公司)。乙腈(色譜純，美國(guó) Honeywell公司)；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 地骨皮乙素含量測(cè)定

2.1 色譜條件 Dikmatech PlatisilODS色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動(dòng)相0.15%磷酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脫，程序見(jiàn)表2；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量5 μL。理論塔板數(shù)按地骨皮乙素峰計(jì)，應(yīng)不低于10 000。

表2 梯度洗脫程序

2.2 對(duì)照品溶液制備 取地骨皮乙素適量，精密稱定，20%甲醇和0.15%磷酸的混合溶液制成質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 將地骨皮粉碎，過(guò)4號(hào)篩，精密稱取粉末約0.2 g，置于50 mL離心管中，加入流動(dòng)相溶液7 mL，超聲(350 W)處理30 min，離心(4 000×g)10 min，取上清液轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，重復(fù)提取2次，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶液洗滌，合并提取液，用流動(dòng)相溶液洗滌定容，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得[12]。

2.4 專屬性實(shí)驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品、對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖1。

1.地骨皮乙素圖1 地骨皮HPLC色譜圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 取地骨皮乙素母液，以20%甲醇和0.15%磷酸的混合溶液稀釋，制備成質(zhì)量濃度分別為40、80、160、240、480 μg/mL的對(duì)照品溶液，精密吸取5 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以地骨皮乙素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程為Y=4.185 4X-1.267 3(r=0.999 97)，在40.0～480 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液各5 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6次，測(cè)得地骨皮乙素峰面積 RSD 為0.27%、0.26%、0.40%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品(批號(hào)YC20190101)約0.2 g，精密稱定，平行6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得地骨皮乙素含量RSD為0.78%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品(批號(hào)YC20190101)約0.2 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得地骨皮乙素峰面積RSD為1.69%，表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 取9份含量已知的樣品(批號(hào)YC20190101)約0.1 g，精密稱定，分別按80%、100%、120%水平加入對(duì)照品溶液，各平行3份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。測(cè)得地骨皮乙素加樣回收率95%～105%，平均加樣回收率為100.8%，RSD為2.36%。

2.6 地骨皮含量測(cè)定 按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)表3。由此表明，21批地骨皮中地骨皮乙素含量范圍為0.13%～5.24%，建議在2020年版《中國(guó)藥典》中增加地骨皮含量測(cè)定項(xiàng)，即按干燥品計(jì)算，本品含該成分不低于1.0%。

表3 地骨皮乙素含量測(cè)定結(jié)果

3 地骨皮指紋圖譜建立

3.1 供試品溶液制備 取各批藥材粉末(過(guò)4號(hào)篩)約0.2 g，精密稱定，置50 mL離心管中，精密加入流動(dòng)相溶液25 mL，超聲(350 W)處理30 min，離心10 min(約4 000×g)，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得[11]。

3.2 色譜條件 同“2.1”項(xiàng)。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(批號(hào)YC20190101)5 μL，在“3.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6次，以共有峰的3號(hào)峰(地骨皮乙素)作為內(nèi)標(biāo)[13]，測(cè)得共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD分別為0.05%～0.45%、1.22%～2.30%，表明儀器精密度良好。

3.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品(批號(hào)YC20190101)6份，按“3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“3.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以共有峰的3號(hào)峰(地骨皮乙素)作為內(nèi)標(biāo)[13]，測(cè)得共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD分別為0.06%～0.32%、1.21%～2.81%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液(批號(hào)YC20190101)，于0、2、4、8、12、24 h在“3.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以共有峰的3號(hào)峰(地骨皮乙素)作為內(nèi)標(biāo)[13]，測(cè)得共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD分別為0.05%～1.36%、0.40%～ 2.70%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4 圖譜生成 取21批供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“3.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，色譜圖見(jiàn)圖2。

3.地骨皮乙素 4.地骨皮甲素圖2 21批樣品對(duì)照?qǐng)D譜及HPLC指紋圖譜

3.5 相似度分析 將各批藥材的HPLC色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2.0版)[13]，生成對(duì)照?qǐng)D譜(圖2)，標(biāo)定了5個(gè)特征峰。利用中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果各批樣品相似度均大于0.97。張永等[14]在研究肉桂指紋圖譜時(shí)發(fā)現(xiàn)，桂皮醛過(guò)高的峰面積使得不同年限肉桂藥材的相似度沒(méi)有明顯差別，故本研究剔除最大峰地骨皮乙素重新計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表4。由此可知，除編號(hào)S18、S19相似度小于0.80外，其余各批相似度均大于0.8。

表4 剔除地骨皮乙素后21批樣品相似度分析

3.6 聚類分析 聚類分析是以一定分析手段將關(guān)系相近的研究對(duì)象進(jìn)行合理的分類的綜合性手段之一[15]。將上述21批樣品5個(gè)特有峰的峰面積導(dǎo)入SPSS 21.0軟件，采用組間平均數(shù)連接法和夾角余弦對(duì)21批樣品的5個(gè)特征峰進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖3，可知結(jié)果與相似度分析一致。

圖3 21批地骨皮系統(tǒng)聚類分析圖

4 地骨皮灰分檢測(cè)

總灰分指藥材經(jīng)加熱熾灼灰分遺留下的無(wú)機(jī)物，稱定質(zhì)量，判斷是否符合限度規(guī)定，它是生理灰分與外來(lái)灰分之和[16]。組織中含草酸鈣較多的藥材，需要測(cè)定酸不溶性灰分，可以更準(zhǔn)確地反映出外來(lái)雜質(zhì)的量[16]。

灰分測(cè)定參照2015年版《中國(guó)藥典》四部通則測(cè)定法進(jìn)行，取21批藥材粉末(過(guò)2號(hào)篩)，每批約4.0 g，精密稱定，置于恒定質(zhì)量的空坩堝中，放入馬弗爐中程序升溫，灰化完全后取出，冷卻后記錄數(shù)據(jù)，復(fù)烘0.5 h，直至數(shù)據(jù)達(dá)到恒重的要求，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 21批樣品灰分測(cè)定結(jié)果

2015年版《中國(guó)藥典》一部地骨皮項(xiàng)下規(guī)定，灰分不得大于11%，酸不溶性灰分不得大于3%[1]。表5顯示，20批樣品灰分均大于11%，僅1批(YC20191104)合格，但是該批有效成分含量低(0.33%)，可能是過(guò)度水洗導(dǎo)致?！断愀壑兴幉臉?biāo)準(zhǔn)》第六冊(cè)地骨皮項(xiàng)下[12]規(guī)定，總灰分不得多于19%，酸不溶性灰分不得多于4.5%；第17版《日本藥典》地骨皮項(xiàng)下[17]規(guī)定，總灰分不得多于20.0%，酸不溶性灰分不得多于3.0%。地骨皮灰分與有效成分含量的關(guān)系，見(jiàn)圖4，由S13～S21數(shù)據(jù)可知，當(dāng)?shù)毓瞧ぶ锌偦曳趾退岵蝗苄曰曳纸档蜁r(shí)，地骨皮乙素含量顯著降低，故建議2020年版《中國(guó)藥典》對(duì)地骨皮灰分限量進(jìn)行調(diào)整，總灰分不超過(guò)19.0%，酸不溶性灰分不多于4.5%。

圖4 地骨皮灰分與地骨皮乙素含量的關(guān)系

5 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選用了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%三氟乙酸、甲醇-0.1%磷酸作為流動(dòng)相進(jìn)行考察，最終確定“2.1”項(xiàng)下條件，色譜圖上各色譜峰分離良好，保留時(shí)間適中，峰型對(duì)稱。

由于2015版《中國(guó)藥典》上對(duì)地骨皮灰分做了控制，但是并沒(méi)有對(duì)其指標(biāo)性成分進(jìn)行說(shuō)明。因?yàn)榈毓瞧ね馄ぞ哂休^厚的糠磷皮，其中有細(xì)密的組織小孔及不規(guī)則裂紋，很容易吸附灰塵，所以灰分不容易達(dá)標(biāo)，但浸泡或多次洗滌又會(huì)顯著降低其有效成分含量。本實(shí)驗(yàn)建立了地骨皮樣品中地骨皮乙素含量測(cè)定方法，建議2020年版《中國(guó)藥典》中增加地骨皮含量測(cè)定項(xiàng)，按干燥品計(jì)算，本品含地骨皮乙素(C28H42N4O6)不低于1.0%，并對(duì)其灰分限量進(jìn)行調(diào)整，總灰分不超過(guò)19.0%，酸不溶性灰分不多于4.5%。

本實(shí)驗(yàn)建立了地骨皮藥材的對(duì)照指紋圖譜，確定了5個(gè)共有峰作為基本特征峰。在相似度分析時(shí)，應(yīng)剔除對(duì)指紋圖譜貢獻(xiàn)率較大的地骨皮乙素峰，以利于指紋圖譜的綜合評(píng)價(jià)，根據(jù)聚類分析結(jié)果，將21批樣品劃分為2大類，具體分類形成原因有待進(jìn)一步研究。