藤梨根制劑抑制白介素8誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的分子機(jī)制

杜英杰， 趙印濤， 張雨涵， 李曉軍， 吳金洋

(承德醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

隨著人類飲食結(jié)構(gòu)的改變，心血管疾病逐漸成為威脅人類健康的主要疾病。動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生的最關(guān)鍵因素[1]。新生血管形成是粥樣硬化斑塊特征之一，可引發(fā)易損斑塊的發(fā)展，增加斑塊破裂的風(fēng)險(xiǎn)[2]。血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移是血管新生過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和侵襲可有效抑制新血管的生成。藤梨根是獼猴桃科獼猴屬植物硬毛中華獼猴桃的根，性味苦、寒，具有清熱、解毒、活血等功效。研究顯示，藤梨根制劑可抑制結(jié)直腸癌[4]、胃癌[5]等腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，具有較好的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。但目前，還未見藤梨根制劑影響血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的相關(guān)報(bào)道。白介素8(interleukin 8，IL-8)是趨化性細(xì)胞因子，主要由單核巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，參與炎癥和免疫反應(yīng)[6]。近年來研究顯示，IL-8也是介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的重要因子[7]。因此，本研究采用IL-8誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，探討藤梨根制劑對(duì)HUVECs遷移的影響和分子機(jī)制。

1 材料

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs，批號(hào)20181215，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。藤梨根、水楊梅、茯苓等藥材，河北安國東方藥城。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，批號(hào)20181211，浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM培養(yǎng)基，批號(hào)20190116，北京索萊寶科技有限公司；四甲基噻唑藍(lán)(methylthiazoletrazolium，MTT)(批號(hào)298-93-1)和胰蛋白酶(批號(hào)20180629)，美國Sigma公司；LipofectamineTM2000試劑盒，批號(hào)20190111，美國Invitrogen公司；鼠抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(批號(hào)20181027)、單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemotactic factor-1，MCP-1)(批號(hào)20181119)單克隆抗體，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；趨化因子受體1(chemokine receptor 1，CXCR1)(批號(hào)20181105)和趨化因子受體2(chemokine receptor 2，CXCR2)(批號(hào)20181219)多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司；二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒，批號(hào)20190216，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CXCR1、CXCR2過表達(dá)載體及對(duì)照，上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司。YDS-20-50液氮罐，新鄉(xiāng)市鑫鴻低溫容器制造有限公司；超凈工作臺(tái)，四川天利和科技有限公司；CCL-170B-8-UV型ESCO CO2培養(yǎng)箱，北京中豪萊伯科技發(fā)有限公司；FlexA-200全自動(dòng)酶標(biāo)儀，杭州奧盛儀器有限公司；Transwell小室，美國Millipore公司；IX70倒置顯微鏡，日本Olympus公司；165-8033小型垂直電泳儀、ChemiDoc Touch成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 藤梨根制劑制備 稱取藤梨根30 g、水楊梅根30 g、虎杖根30 g、茯苓20 g、黨參20 g、白術(shù)15 g、薏苡仁30 g，甘草10 g，粉碎并過200目篩，加1 000 mL水煎煮2 h，抽濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至20 mL左右，置于真空干燥箱中干燥，得到干燥產(chǎn)物59.7 g。精密稱取10 mg，DMEM培養(yǎng)基溶解并定容至10 mL，配成1 g/L母液，0.45 μL濾頭過濾除菌，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)，培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

2.2 HUVECs培養(yǎng) 從液氮罐中取出裝有HUVECs的凍存管，迅速置于37 ℃水浴中融化，超凈工作臺(tái)內(nèi)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入適量預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，混勻，1 000 r/min離心5 min，吸棄上清，沉淀再次加入適量PBS清洗細(xì)胞，吸棄上清，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、 5%CO2、相對(duì)濕度97%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d更換1次新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

2.3 細(xì)胞分組 HUVECs分為對(duì)照組、IL-8組、不同劑量藤梨根制劑+IL-8組，對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，IL-8組細(xì)胞用含100 ng/mL[8]的IL-8誘導(dǎo)，不同劑量藤梨根制劑+IL-8組分別用含3.2、16、80、160 mg/L[9]藤梨根制劑及100 ng/mL IL-8的培養(yǎng)基共同作用。

2.4 MTT檢測(cè)藤梨根制劑對(duì)IL-8誘導(dǎo)HUVECs存活率的影響 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs接種于96孔板中，每孔5×103個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)2 h后，按照“2.3”項(xiàng)下方法分組處理。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)繼續(xù)孵育4 h。吸棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜，反應(yīng)5 min，結(jié)晶紫溶解后混勻，全自動(dòng)酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定每孔的吸光度值(absorbance，A)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 Transwell檢測(cè)藤梨根制劑對(duì)IL-8誘導(dǎo)HUVECs遷移和侵襲 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整濃度為5×104個(gè)/mL，將帶有8 μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室(美國Millipore公司)置于24孔板中，上室加入100 μL細(xì)胞懸液，下室加入500 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)2 h后，上室細(xì)胞分為對(duì)照組、IL-8組、不同劑量藤梨根制劑+IL-8組，其中對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，IL-8組細(xì)胞用含100 ng/mL的IL-8的培養(yǎng)基培養(yǎng)，不同劑量藤梨根制劑+IL-8組分別用含3.2、16、80 mg/L藤梨根制劑與100 ng/mL IL-8的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)；下室均為500 μL含10% FBS的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)基，取出小室，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，0.4%結(jié)晶紫室溫染色15 min，PBS清洗至無色，自然晾干后置于倒置顯微鏡觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，對(duì)穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)。預(yù)冷Matrigel基質(zhì)膠用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基以1∶8比例稀釋后鋪于Transwell上室，自然晾干，然后加入100 μL細(xì)胞懸液，后續(xù)步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藤梨根制劑對(duì)IL-8誘導(dǎo)HUVECs劃痕愈合率 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs接種于6孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)2 h后，用移液器在6孔板上劃兩條直線，預(yù)冷PBS洗去刮下的脫落細(xì)胞。按“2.3”項(xiàng)下方法分組處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)0、24 h后，在顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)位置測(cè)量細(xì)胞劃痕寬度，Image J 軟件計(jì)算劃痕愈合率，公式為劃痕愈合率=(1-24 h空白區(qū)域面積/0 h空白區(qū)域面積)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 蛋白印跡(Western blot)法檢測(cè)藤梨根制劑對(duì)IL-8誘導(dǎo)HUVECs中VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2蛋白表達(dá) 加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，提取細(xì)胞中總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白，100 ℃煮沸5 min，變性后每孔取30 μg蛋白行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至聚偏乙烯二氟膜，于5%脫脂牛奶中封閉1 h，分別置于VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2抗體孵育液中，4 ℃孵育過夜。洗膜后，置于辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗孵育液中，室溫孵育1 h，滴加化學(xué)發(fā)光試劑ECL避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。以β-actin為內(nèi)參，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

2.8 過表達(dá)CXCR1/2對(duì)藤梨根制劑干預(yù)的HUVECs遷移、侵襲及VEGF和MCP-1蛋白表達(dá)的影響 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs接種于6孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合至60%時(shí)，更換不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基。參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書，分別轉(zhuǎn)染CXCR1過表達(dá)載體(pcDNA-CXCR1)、CXCR2過表達(dá)載體(pcDNA-CXCR2)、共轉(zhuǎn)染CXCR1與CXCR2過表達(dá)載體(pcDNA-CXCR1/2)及陰性對(duì)照(pcDNA)至HUVECs。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞均用含16 mg/L藤梨根制劑與100 ng/mL IL-8的培養(yǎng)基共同作用，并依次記為藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR1組、藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR2組、藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR1/2組和藤梨根制劑+IL-8+pcDNA組。分別采用Transwell、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞遷移和侵襲、劃痕愈合率及細(xì)胞中VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2蛋白表達(dá)，方法同“2.5”“2.6”和“2.7”項(xiàng)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 藤梨根制劑對(duì)IL-8誘導(dǎo)HUVECs存活的影響 與對(duì)照組比較，IL-8組細(xì)胞存活率無明顯變化(P>0.05)；與IL-8組比較，3.2、16、80 mg/L藤梨根制劑+IL-8組細(xì)胞存活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，160 mg/L藤梨根制劑+IL-8組細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，見表1。

表1 藤梨根制劑對(duì)IL-8誘導(dǎo)HUVECs存活的影響

3.2 藤梨根制劑對(duì)IL-8誘導(dǎo)HUVECs遷移和侵襲 與對(duì)照組比較，IL-8組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)、細(xì)胞愈合率升高(P<0.05)；與IL-8組比較，不同劑量藤梨根制劑+IL-8組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)、細(xì)胞愈合率降低(P<0.05)，見表2、圖1。

表2 藤梨根制劑對(duì)IL-8誘導(dǎo)HUVECs遷移和侵襲的影響

注：A為Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲，B為劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移。圖1 藤梨根制劑對(duì)IL-8誘導(dǎo)HUVECs遷移和侵襲的影響

3.3 藤梨根制劑對(duì)IL-8誘導(dǎo)HUVECs中VEGF和MCP-1表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，IL-8組細(xì)胞VEGF和MCP-1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與IL-8組比較，不同劑量藤梨根制劑+IL-8組細(xì)胞VEGF和MCP-1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 Western blot檢測(cè)HUVECs中VEGF、MCP-1蛋白表達(dá)

表3 藤梨根制劑對(duì)IL-8誘導(dǎo)HUVECs中VEGF、MCP-1蛋白表達(dá)的影響

3.4 藤梨根制劑對(duì)IL-8誘導(dǎo)HUVECs中IL-8受體CXCR1/2表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，IL-8組細(xì)胞CXCR1和CXCR2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與IL-8組比較，不同劑量藤梨根制劑+IL-8組細(xì)胞CXCR1和CXCR2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 Western blot檢測(cè)HUVECs中CXCR1和CXCR2蛋白的表達(dá)

表4 藤梨根制劑對(duì)IL-8誘導(dǎo)HUVECs中CXCR1和CXCR2蛋白表達(dá)的影響

3.5 過表達(dá)CXCR1/2部分逆轉(zhuǎn)藤梨根制劑對(duì)IL-8誘導(dǎo)HUVECs遷移和侵襲的抑制作用 與藤梨根制劑+IL-8+pcDNA組比較，藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR1組、藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR2組細(xì)胞CXCR1、CXCR2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)、細(xì)胞愈合率升高(P<0.05)；與藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR1組、藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR2組比較，藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR1/2組細(xì)胞CXCR1、CXCR2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)、細(xì)胞愈合率升高(P<0.05)。見圖4～5、表5。

圖4 Western blot檢測(cè)HUVECs中CXCR1、CXCR2蛋白表達(dá)

注：A為Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲，B：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移。圖5 過表達(dá)CXCR1/2逆轉(zhuǎn)藤梨根制劑對(duì)IL-8誘導(dǎo)HUVECs遷移和侵襲的影響

表5 過表達(dá)CXCR1/2逆轉(zhuǎn)藤梨根制劑對(duì)IL-8誘導(dǎo)HUVECs中CXCR1、CXCR2蛋白表達(dá)及細(xì)胞遷移和侵襲的影響

3.6 過表達(dá)CXCR1/2逆轉(zhuǎn)藤梨根制劑對(duì)IL-8誘導(dǎo)HUVECs中VEGF、MCP-1蛋白的抑制作用 與藤梨根制劑+IL-8+pcDNA組比較，藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR1組、藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR2組細(xì)胞VEGF、MCP-1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR1組、藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR2組比較，藤梨根制劑+IL-8+pcDNA-CXCR1/2組細(xì)胞VEGF、MCP-1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見圖6、表6。

圖6 Western blot檢測(cè)HUVECs中VEGF、MCP-1蛋白表達(dá)

4 討論

IL-8屬于趨化因子家族CXC亞家族成員，與細(xì)胞上的CXCR受體具有高度親和力。CXCR受體是一種G蛋白偶合體。內(nèi)皮細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)CXCR1和CXCR2兩種受體，這兩種受體均可與IL-8特異性結(jié)合[10]。IL-8通過激活CXCR1和CXCR2受體后，引起細(xì)胞收縮及細(xì)胞與細(xì)胞間隙增加，提高細(xì)胞基底膜通透性，促進(jìn)血管生成[11]。VEGF是目前公認(rèn)的功能最強(qiáng)的新生血管生成促進(jìn)因子，可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體，通過一系列信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖和遷移[12]。MCP-1屬于CC趨化因子家族成員，主要參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、腫瘤生長(zhǎng)及血腦屏障[13]。研究顯示，MCP-1通過趨化因子受體2誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞遷移[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-8誘導(dǎo)HUVECs后，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)、劃痕愈合率升高，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致，提示IL-8促進(jìn)了HUVECs遷移和侵襲。本研究還顯示，IL-8誘導(dǎo)HUVECs后，細(xì)胞中VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2蛋白表達(dá)增加，提示IL-8可能通過與CXCR1和CXCR2受體結(jié)合激活其表達(dá)以及上調(diào)細(xì)胞中VEGF和MCP-1表達(dá)促進(jìn)HUVECs遷移。

近年來，我國傳統(tǒng)中藥具有多治療靶點(diǎn)、藥性溫和、毒副作用低等優(yōu)點(diǎn)，成為疾病治療研究的熱點(diǎn)。藤梨根制劑是以我國特有種中華獼猴桃的根為君藥，以水楊梅根、虎杖根為臣藥，加之黨參、白術(shù)等組成的祛除解毒、扶助正氣的復(fù)方藥。目前，對(duì)藤梨根制劑功效的研究多為抗腫瘤作用研究。如復(fù)方藤梨根制劑可能通過下調(diào)乙酰肝素酶表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抗胃癌作用[15]。藤梨根制劑可抑制小鼠體內(nèi)結(jié)腸癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移[16]，其聯(lián)合伊立替康與卡培他濱可改善晚期結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移患者生存質(zhì)量和免疫功能，減輕化療毒副反應(yīng)[17]。藤梨根制劑可能通過下調(diào)卵巢癌A2708細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)及上調(diào)TIMP-1表達(dá)抑制卵巢癌A2780細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[18]。復(fù)方藤梨根制劑能抑制腫瘤生長(zhǎng)，減少CT26瘤體中MVD，具有抗腫瘤血管生成作用[19]。但藤梨根制劑能否抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移還未見相關(guān)研究。

本研究顯示，藤梨根制劑在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)IL-8誘導(dǎo)HUVECs活性無顯著影響，而濃度升高時(shí)可抑制HUVECs存活。選擇對(duì)HUVECs活性無顯著影響濃度的藤梨根制劑，觀察其對(duì)IL-8誘導(dǎo)HUVECs遷移及VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，藤梨根制劑作用后，IL-8誘導(dǎo)HUVECs遷移和侵襲數(shù)、劃痕愈合率及VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2蛋白表達(dá)均降低，提示藤梨根制劑可能通過抑制VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2蛋白表達(dá)抑制IL-8誘導(dǎo)HUVECs遷移。本研究還顯示，過表達(dá)CXCR1或CXCR2可逆轉(zhuǎn)藤梨根制劑對(duì)IL-8誘導(dǎo)HUVECs遷移的抑制作用，且同時(shí)過表達(dá)CXCR1和CXCR2的逆轉(zhuǎn)作用更強(qiáng)，進(jìn)一步說明藤梨根制劑通過抑制CXCR1和CXCR2蛋白表達(dá)來抑制IL-8誘導(dǎo)HUVECs遷移。

綜上所述，藤梨根制劑可能通過抑制CXCR1和CXCR2蛋白表達(dá)來抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，為動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供了新途徑。