澤瀉湯加味方對鹽敏感性高血壓Dahl大鼠腎臟NADPH氧化酶表達的影響?

張婷婷， 吳鑫宇， 陸雪健， 滕 堯， 張樹峰， 蔣希成△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱 150040； 2.寧波大榭開發(fā)區(qū)醫(yī)院， 浙江 寧波 315800；3.承德醫(yī)學院， 河北 承德 067000)

《黃帝內經》中有“咸者，脈弦也”和“咸傷腎”的記載，對鹽與血壓及腎臟的關系有所闡述?！吨袊哐獕悍乐沃改?第三版)》提出食鹽攝入量與高血壓發(fā)生密切相關，高血壓中鹽敏感性高血壓 (salt-sensitive hypertension，SSH)占60%[1]。SSH是由高鹽攝入引起的血壓升高，其發(fā)生與生理、環(huán)境、人口和遺傳因素有關，腎的水鈉代謝障礙與內皮功能障礙被認為是SSH發(fā)生的主要機制[2]。

現代研究表明，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH氧化酶)是血管緊張素II(AngiotensinII, AngII)對血壓和血管炎癥反應的關鍵決定因素。NOX4是NADPH氧化酶主要在腎臟表達的亞型，p22phox、p47phox是NADPH氧化酶的亞基。實驗研究表明，調控NADPH氧化酶亞基的表達對調控血壓及腎保護具有重要意義。本實驗通過高鹽飲食誘導SSH動物模型，研究澤瀉湯加味方對腎臟NOX4、p22phox和p47phox表達的影響，分析其對血壓的調控與腎臟的保護機制。本研究已通過黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查，倫理學批準號2016050601。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性4周齡Dahl大鼠60只，體質量80～100 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物使用許可證號SCXK(津)2012-0001。飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全評價中心，環(huán)境溫度(20±2)℃，相對濕度(40～42)%，各組大鼠自由覓食飲水，規(guī)律光照。

1.2 飼料及造模

8%NaCl高鹽純化飼料(批號16030601(A2)，購自開源動物飼料(常州)有限公司；正常飼料(SPF級)購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司)。除空白對照組給予正常飼料外，其余5組均給予8 %NaCl高鹽純化飼料，喂養(yǎng)4周后造模。經過4周造模成功給予正常飼料。

1.3 藥物

澤瀉湯加味方組成：澤瀉21 g，麩炒白術9 g，澤蘭15 g，石菖蒲15 g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院中藥飲片局。

1.4 分組及給藥

60只Dahl大鼠隨機分為空白對照組、模型組、纈沙坦組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組6組各10只。澤瀉湯加味方前期研究選用L9(34)正交表，得出組方最佳配比[3]，濃縮制成濃度為1∶1水煎劑，根據人與大鼠給藥劑量比例進行等效轉換，中藥低劑量組5.4 g·kg-1·d-1灌胃，中藥中劑量組10.8 g·kg-1·d-1灌胃，中藥高劑量組21.6 g·kg-1·d-1灌胃，纈沙坦組給予纈沙坦7.2 mg·kg-1·d-1灌胃，空白對照組及模型組給予等體積5% CMC-Na溶液灌胃，每日1次連續(xù)給藥4周。

1.5 主要試劑與儀器

纈沙坦(批號H20040217)，北京諾華制藥有限公司；phox-p22抗體(bs-3879)，美國Bioss公司；phox-p47抗體(bs-6966)，美國Bioss公司；NOX4抗體(14347-1)，武漢三鷹生物技術有限公司；NC膜，美國 Millipore公司；PBS磷酸鹽緩沖，北京博奧拓科技有限公司；二甲苯，天津永大化學試劑有限公司；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、戊二醛、水合蘇木素、無水乙醇、95 %乙醇，天津市福晨化學試劑廠。

BP-6動物無創(chuàng)血壓測試儀、BP-420F通用4通道生物機能系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；2135型組織切片機、EMUC7超薄切片機(德國Leica公司)；TECNAI G2透射電鏡(美國FEI公司)；ABI7500熒光定量PCR儀、Multiskan MK3酶標儀、Nano Drop 2000分光光度計 (美國Thermo公司)；電泳儀、半干槽(美國Bio-Rad公司)；Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；Mini P-4電泳槽、濕轉電泳槽(北京凱元信瑞儀器有限公司)；水平脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)等。

1.6 體質量及血壓測量

造模成功后，各組大鼠于給藥前和給藥1、2、3、4周末各測定1次體質量和血壓。采用無創(chuàng)尾套法測定清醒大鼠尾部收縮壓(SBP)，每次灌藥后2 h開始測量SBP，記錄3次并取平均值。

1.7 腎臟標本采集及固定

10 %水合氯醛腹腔內給藥麻醉，取大鼠雙側腎臟稱重，計算腎重/體質量指數，用刀片自腎門處冠狀切面對半剖開，一部分放入95 %乙醇中，過碘酸-雪夫氏(PAS)染色，中性樹膠封固，每組選取4個標本(× 400)，光鏡下觀察腎臟病理組織形態(tài)改變。另取部分腎組織置于3 %戊二醛中，乙醇脫水丙酮包埋，每組選取4個標本(×20000)，在透射電鏡下觀察腎臟病理組織超微結構變化。其余腎組織剖開后裝入5 mL凍存管，立即放入液氮凍存，用于蛋白及mRNA檢測備用。

1.8 Western blot 檢測p22phox、p47phox和NOX4蛋白表達

將腎組織剪碎進行總蛋白提取，預冷RIPA蛋白抽提試劑加入蛋白酶抑制劑。細胞計數，以細胞數量1×107加入1 ml裂解液，冰上孵育20 min，4 ℃ 13000 rpm離心20 min，取上清分裝保存待測。進行核蛋白提取，充分混勻后冰上放置40 min，1 4000 rpm4 ℃離心15 min，上清即為胞核蛋白。應用 BCA法蛋白定量酶標儀讀取OD值。以RIPA調整蛋白濃度，加入5×還原樣品緩沖液后樣品終濃度煮沸變性5 min。根據目的蛋白p22phox、p47phox和NOX4的分子量，配制12%分離膠，濃縮膠濃度為5 %，10 μg每孔上樣，通過預染蛋白Marker 確定電泳停止時間，然后進行轉膜和染色并觀察轉膜效果。用3 % BSA-TBST稀釋p22phox、p47phox和NOX4蛋白，濃度為1∶500，內參蛋白GAPDH濃度為1∶2000，室溫孵育10 min，4 ℃過夜封閉。第2天膜處理后曝光，顯影2 min定影，拍照保存圖像，分析軟件測定條帶光密度值，以光密度值代表蛋白的相對表達量。

1.9 RT-PCR檢測p22phox、p47phox和NOX4 mRNA表達

采用Trizol總RNA提取試劑進行樣本RNA提取，實驗操作按產品說明書進行，把組織放入已預冷的研缽中進行研磨處理備用。用紫外吸收測定法檢測濃度和純度，變性瓊脂糖凝膠電泳制膠，準備RNA樣品進行電泳，進行紫外透射光下觀察并拍照，對RNA質量進行檢測。表1示，設計p22phox、p47phox和NOX4 mRNA引物，采用 GAPDH 作內參。實驗操作嚴格按產品說明書進行擴增，逆轉錄合成cDNA，60～95 ℃進行融解曲線分析，儀器自動繪制出對應的內參基因和目的基因標準曲線。將所有的cDNA樣品分別配置RT-PCR反應體系，混合溶液5000 rpm短暫離心，加樣后進行PCR反應。各樣品的目的基因和內參分別進行反應，每個樣本檢測3個復孔，數據采用2-△△ CT法進行分析。

表1 RT-PCR各基因引物序列

1.10 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組不同時間SBP

表2示，與空白對照組比較，模型組給藥前和給藥1、2、3、4周后SBP升高(P<0.05)，提示造模成功；與模型組比較，纈沙坦組給藥2、3、4周后SBP降低 (P<0.05)，中藥高、中、低劑量組給藥3、4周后SBP降低(P<0.05)。

表2 各組Dahl大鼠不同時間SBP變化比較

2.2 各組大鼠體質量、腎重、腎重/體質量

表3示，與空白對照組比較，模型組腎重、腎重/體質量升高 (P<0.05)；與模型組比較，中藥中劑量組腎重、腎重/體質量降低(P<0.05)，各組間體質量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 各組Dahl大鼠干預4周體質量、腎重、腎重/體質量變化比較

2.3 腎臟病理組織學變化

2.3.1 PAS染色觀察腎臟病理組織形態(tài) PAS染色下纈沙坦組及中藥高、中、低劑量組腎臟病理組織改變較模型組輕，以中藥中劑量組明顯。圖1示，空白對照組腎小球大小和結構基本正常，未見明顯深染區(qū)域呈弱染色。模型組大鼠腎小球體積明顯增大且呈分葉狀，系膜細胞增生，PAS陽性物質增多深染，間質增生。與模型組比較，纈沙坦組和各中藥組腎小球體積減小，PAS陽性物質減少，基底膜增厚減輕。

注：a.空白對照組；b.模型組；c.纈沙坦組；d.中藥低劑量組；e.中藥中劑量組；f.中藥高劑量組

2.3.2 透射電鏡觀察腎臟病理組織超微結構變化 透射電鏡下，纈沙坦組及各中藥組腎臟病理組織超微結構改變較模型組輕，腎小球、腎小管結構完整度好于模型組。圖2示，空白對照組腎小球可見毛細血管內皮細胞呈扁平梭形，粗面內質網、線粒體等結構完整，基底膜連續(xù)完整，結構清晰完整，足細胞未見異常；腎小管上皮細胞未見腫脹，細胞器結構完整。模型組腎小球基底膜結構界限不清晰并有破壞，膜腫脹不均，增厚變硬明顯增生，線粒結構破壞，可見足細胞融合；腎小管細胞核內染色質邊集，胞內溶酶體增多變性，線粒體亦出現腫脹及嵴結構消失呈空泡變性。纈沙坦組及各中藥組可見腎小球少量基底膜呈節(jié)段性增厚，但膜結構連續(xù)足突基本正常，系膜細胞及基質未見明顯增生，細胞內細胞器結構好于模型組，線粒體腫脹但嵴結構存在；部分腎小管可見胞質內溶酶體增多，其余部分未見明顯異常。

注：a.空白對照組；b.模型組；c.纈沙坦組；d.中藥低劑量組；e.中藥中劑量組；f.中藥高劑量組

2.4 澤瀉湯加味方對p22phox、p47phox和NOX4蛋白表達的影響

圖3表4示，與空白對照組比較，模型組p22phox、p47phox和NOX4蛋白表達升高 (P<0.05)；與模型組比較，纈沙坦組及各中藥組p22phox、p47phox和NOX4蛋白表達降低，中藥中劑量組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 各組Dahl大鼠腎組織p22phox、p47phox和NOX4 蛋白表達

圖3 各組腎組織p22phox、p47phox和NOX4 蛋白免疫印跡圖

2.5 澤瀉湯加味方對p22phox、p47phox和NOX4 mRNA表達的影響

表5示，與空白對照組比較，模型組p22phox、p47phox和NOX4 mRNA表達升高 (P<0.05)；與模型組比較，纈沙坦組及各中藥組p22phox、p47phox和NOX4蛋白表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表5 各組Dahl大鼠腎組織p22phox、p47phox和NOX4 mRNA表達比較

3 討論

澤瀉湯加味方具有利水泄?jié)?、健脾化痰、活血化瘀之功效。中醫(yī)理論認為，上述4味藥合煎共奏利水泄?jié)?、祛痰開竅之功效。SSH屬于中醫(yī)水濕內停、痰濁壅盛之證。《景岳全書·腫脹》闡明了腎臟是水腫病之本，腎氣對參與水液代謝臟腑有一定的促進作用，最終將各臟腑形體官竅代謝后所產生的濁液下輸于腎及膀胱，在腎氣的蒸化作用下分為清濁，清者再次參與水液代謝，濁者為尿液排出體外，腎氣與肺、脾、三焦共同協(xié)同運化水液?，F代藥理研究表明，利尿劑為治療高血壓的重要藥物，澤瀉湯加味方的降壓作用可能與其利水泄?jié)峁π芮邢嚓P。

腎臟既是血壓調節(jié)的重要器官，同時又是高血壓損害的主要靶器官之一。Dahl大鼠是一種具有高血壓遺傳特性的近交系大鼠，這種品系的大鼠對鹽負荷敏感，此類動物模型能復制出臨床對鹽敏感患者的情況。近期研究表明，鹽、AngII和活性氧(reactive oxygen species，ROS)可促進慢性腎臟疾病的進展，且驗證高鹽攝入會產生特定的ROS。病理情況下，ROS過表達可引起細胞氧化損傷，如腎小球系膜細胞增殖，腎小管血管內皮功能障礙或損傷，血管壁中膜肥厚，腎纖維化及出現炎癥反應，發(fā)生腎損害性高血壓[4]。NADPH 氧化酶抑制劑可有效抑制大鼠腎組織中 ROS 的產生，減少蛋白尿并改善腎組織病理改變[5]。

NADPH氧化酶家族有7個亞型，NOX4是腎臟較高表達的亞型，通過激活多種信號通路參與高血壓腎病等腎臟疾病的氧化還原過程。研究表明，AngII-NADPH-ROS 信號通路的活化在SSH中發(fā)揮關鍵作用[6，7]。NADPH氧化酶被激活后，通過p47phox的絲氨酸磷酸化，然后與p67phox形成復合物，移位到細胞膜與p22phox結合形成具有活性的NADPH氧化酶復合物[8]。有研究證實，抑制p47phox可以減輕氧化應激，降低高血壓和心血管重塑的發(fā)生[9]。p22phox在體內外缺氧反應中的調控作用與ROS生成有關，并對血壓的調節(jié)起關鍵作用，大腦穹下器官中NADPH氧化酶可以通過p22phox調節(jié)血壓和血管炎癥[10，11]。研究表明，NADPH氧化酶抑制劑治療相關疾病具有重要的研究意義，雷公藤紅素和紅杉醇分別可以抑制p47phox、p22phox位點，進而特異性地抑制NOX4的表達[12，13]。因此，抑制NADPH氧化酶的相關分子表達阻斷激活ROS可以成為治療SSH的思路。

本研究結果顯示，高鹽飲食誘導高血壓動物模型復制成功。澤瀉湯加味方干預治療3周后血壓顯著下降，隨著治療時間的增加血壓持續(xù)下降，證明中藥澤瀉湯加味方具有降低Dahl大鼠SBP的功效。中藥中劑量組大鼠腎重及腎重/體質量顯著降低，說明澤瀉湯加味方能降低腎負荷。觀察腎臟病理組織形態(tài)，PAS染色可見各中藥組大鼠腎小球體積、系膜細胞及基底膜結構較好于模型組大鼠。透射電鏡下觀察超微結構變化，各中藥組大鼠腎小球基底膜、線粒體結構及腎小管上皮細胞均優(yōu)于模型組大鼠，表明澤瀉湯加味方能明顯改善大鼠腎臟病理組織學改變，具有腎保護作用。前期研究表明，澤瀉湯加味方能夠減少模型大鼠血清尿素氮、血肌酐的含量[14]。綜上結果證實，澤瀉湯加味方具有降低血壓和腎保護作用。

澤瀉湯加味方能下調大鼠腎臟組織中p22phox、p47phox和NOX4蛋白及mRNA的表達，中藥中劑量組對蛋白的表達下調作用明顯，中藥3個劑量組均對mRNA的表達下調作用顯著。其作用機制可能為澤瀉湯加味方抑制Dahl大鼠腎臟組織中的NADPH氧化酶NOX4活化，通過抑制p47phox的磷酸化，影響p22phox結合形成有活性的NADPH 氧化酶復合物，進而抑制ROS的產生。AngII-NADPH-ROS通路是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin angiotensin aldosterone system，RAAS)的相關信號通路，其異常被認為是SSH發(fā)生的重要機制之一，其中NADPH氧化酶介導的ROS在高血壓中樞神經系統(tǒng)信號傳導中具有重要作用[15]。ROS在腎臟疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，腎小球中主要的ROS產生者是p47phox亞單位，作為關鍵調節(jié)因子其表達和磷酸化在腎損傷過程中的上調已被證實會加重腎損傷[16]。實驗組已證實，澤瀉湯加味方能顯著減低大鼠腎小球系膜細胞HBZY21的ROS 表達水平[7]，可知澤瀉湯加味方能通過下調ROS表達發(fā)揮腎臟保護作用。本研究中，澤瀉湯加味方可能通過抑制p22phox、p47phox和NOX4的表達，抑制ROS的產生，通過阻斷NADPH氧化酶信號傳導，進而起到降低血壓和腎保護作用。此作用機制可為澤瀉湯加味方臨床治療SSH提供分子依據。