沙格列汀對1 型糖尿病小鼠GLP-1、胰高血糖素表達及胰島α 細胞增殖、凋亡的影響①

吳美芬 潘海燕 劉裕曉 黃興麗 韋曉丹 武 革

（廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院內分泌科，湛江524001）

糖尿病是世界范圍內的常見病，長期易引發(fā)并發(fā)癥，危害患者健康，近年其發(fā)病率逐漸升高。1 型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus，T1DM）是自身免疫介導引起胰島β 細胞破壞、凋亡增加的自身免疫性疾病，在糖尿病中所占比例低于T2DM，但其臨床癥狀較嚴重，多累及年輕人[1］。研究發(fā)現(xiàn)，T1DM 患者的高血糖往往與高血糖素血癥有關，而胰高血糖素由胰島α 細胞分泌[2］。胰高糖素樣肽1（glucagonlike peptide-1，GLP-1）是一種促胰島素肽，能促進胰島β 細胞增殖并抑制其凋亡，主要由腸道L 細胞分泌，近年被發(fā)現(xiàn)可通過胰島α 細胞合成胰高糖素原途徑產生[3-5］。二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）抑制劑是近年廣泛應用于糖尿病治療的一類降糖藥物，通過抑制GLP-1降解及胰高糖素分泌，增加體內胰島素分泌發(fā)揮降糖作用[6］。沙格列汀是DPP4 抑制劑的一種，既往多用于治療T2DM，臨床療效好，安全性高[7］。本研究將通過注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導建立T1DM 小鼠模型，研究沙格列汀對T1DM 小鼠GLP-1、胰高血糖素表達及胰島α 細胞增殖、凋亡的影響，以期為臨床治療T1DM提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級健康C57BL/6小鼠55只，8～10 周齡，體重25～30 g（南方模式生物研究中心），嚴格按照小鼠飼養(yǎng)規(guī)則進行喂養(yǎng)，溫度為25℃，濕度為50%，光照時間為8：00～20：00，飲用蒸餾水，飼養(yǎng)期間保持飼養(yǎng)房間整潔、通風，定時對鼠籠進行清理。實驗動物及飼養(yǎng)條件符合《實驗動物管理條例》要求。小鼠適應性飼養(yǎng)2周后用于后續(xù)實驗。

1.1.2 主要試劑與儀器 STZ 自行配制：枸櫞酸滴定生理鹽水至pH值為4.2，然后進行高壓滅菌，臨用前以無菌酸化生理鹽水將STZ 配制成2% 工作液。胰島素（貨號：0215504401）購自諾和公司；人GLP-1、人胰高血糖素ELISA 試劑盒、增殖細胞核抗原（pro‐liferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體、Ki-67 抗體、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體、GAPDH 抗體（貨號：ab41969、ab267567、ab92552、ab15580、ab32503、ab181602）購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（貨號：0295G-HRP）購自美國Santa 公司；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：KFS197-SLG）購自北京百奧萊博科技有限公司；沙格列汀（貨號：H20160088）購自阿斯利康制藥有限公司；血糖儀（型號：HGM-114）購自達而泰（天津）實業(yè)有限公司；酶標儀（型號：MOD‐EL550）、化學發(fā)光成像系統(tǒng)（型號：ChemiDocXRS）購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 隨機抽取45 只小鼠造模，剩余10 只作為正常組。造模前小鼠禁食不禁水12 h，稱取空腹體重，按130 mg/kg STZ 給予小鼠單次腹腔注射。正常組小鼠同時間腹腔注射等量生理鹽水。結束注射藥物1 周后采集小鼠尾靜脈血，測小鼠禁食6 h后血糖。連續(xù)2次血糖≥11.1 mmol/L診斷為T1DM。 造模期間未連續(xù)2 次血糖≥11.1 mmol/L 者4 只，死亡1 只，造模成功的40 只小鼠繼續(xù)后續(xù)實驗。

1.2.2 動物分組及給藥方法 造模成功的小鼠隨機分為模型組、胰島素組、沙格列汀低劑量組、沙格列汀高劑量組（10 只/組）。胰島素組皮下注射1 U胰島素；沙格列汀低、高劑量組分別灌胃1、3 mg/（kg·d）沙格列汀，正常組、模型組小鼠均灌胃等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)治療4周。

1.2.3 血糖儀檢測各組小鼠給藥前后血糖水平

造模后各組小鼠于給藥前、后禁食不禁水6 h 后采集尾靜脈血，血糖儀檢測血糖水平。

1.2.4 ELISA 法檢測各組小鼠GLP-1 和胰高血糖素水平 給藥結束后，麻醉小鼠進行心臟采血，收集的血樣靜置3 h 分離血清。ELISA 法檢測小鼠血清GLP-1 和胰高血糖素水平，操作方法均按照試劑盒說明書進行。使用酶標儀測定吸光度值，波長為450 nm，取3次重復平均值，根據(jù)標準液吸光度結果與標準液濃度繪制標準曲線，得出換算方程，計算GLP-1和胰高血糖素水平。

1.2.5 免疫組化檢測各組小鼠胰島α 細胞增殖情況 取血后斷頸處死，立即分離出胰腺組織，以體積分數(shù)0.9% 的冰生理鹽水沖洗，用濾紙吸干殘留水分。取近胰頭的1/2 置于4% 多聚甲醛溶液中固定，24 h 后常規(guī)脫水透明，石蠟包埋，切片。將石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，檸檬酸緩沖液修復抗原，滴加3%H2O2封閉內源性過氧化物酶，10% 山羊血清室溫濕盒封閉，加入PCNA一抗（1∶6000）4℃孵育過夜，PBS 沖洗，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1∶5000）常溫孵育1 h，PBS 沖洗，DAB 顯色，水洗，蘇木素復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。利用ImageProPlus 圖像分析系統(tǒng)采集圖像，每張片子取5個高倍視野（×400），計算增殖指數(shù)，增殖指數(shù)=增殖細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.2.6 TUNEL 法檢測各組小鼠胰島α 細胞凋亡情況 將石蠟切片脫蠟至水，檸檬酸緩沖液修復抗原，滴加3%H2O2封閉內源性過氧化物酶，滴加50 μl TUNEL 反應液，置于濕盒中，37℃孵育1 h，PBS 沖洗，滴加3%H2O2反應10 min，PBS溶液沖洗后，用含DAPI 的抗淬滅封片劑封片。利用ImageProPlus 圖像分析系統(tǒng)采集圖像，每張片子取5 個高倍視野（×400），計算凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.2.7 Western blot 檢測各組小鼠胰腺組織中Ki-67、Bax 蛋白表達 RIPA 裂解液裂解胰腺組織，4℃離心后提取蛋白并定量，電泳、轉膜、封閉后加入Ki-67、Bax、GAPDH 一抗（1∶500），4℃孵育過夜，TBST洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1∶5000），室溫孵育1 h，免疫反應化學發(fā)光法顯色，Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍攝圖像并分析條帶灰度，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參GAPDH灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)處理采用SPSS24.0統(tǒng)計學軟件。計量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。當P<0.05時，差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠給藥前后血糖水平 胰島素組、沙格列汀低、高劑量組給藥后血糖水平均顯著低于給藥前（P<0.05）。給藥前，與正常組相比，模型組小鼠血糖水平均顯著升高（P<0.05）；模型組、胰島素組、沙格列汀低、高劑量組小鼠血糖水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。給藥后，與對照組相比，模型組小鼠血糖水平均顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，胰島素組、沙格列汀低、高劑量組小鼠血糖水平均顯著降低（P<0.05）；胰島素組與沙格列汀低劑量組小鼠血糖水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與胰島素組、沙格列汀低劑量組相比，沙格列汀高劑量組小鼠血糖水平顯著降低（P<0.05）。見表1。

表1 各組小鼠給藥前后血糖水平比較（±s，n=10，mmol/ L）Tab.1 Comparison of blood glucose levels before and af?ter administration（±s，n=10，mmol/ L）

表1 各組小鼠給藥前后血糖水平比較（±s，n=10，mmol/ L）Tab.1 Comparison of blood glucose levels before and af?ter administration（±s，n=10，mmol/ L）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with insulin group，3）P<0.05；compared with low dose group of saxagliptin，4）P<0.05；com‐pared with before administration，5）P<0.05.

Groups Normal Model Insulin Saxagliptin low dose Saxagliptin high dose F P Before administration 5.46±0.8217.57±1.241）17.32±1.331）17.68±1.411）17.63±1.291）191.6680.000 After administration 5.73±0.8817.98±1.351）15.16±1.181）2）5）15.74±1.201）2）5）13.56±0.971）2）3）4）5）172.9350.000

2.2 各組小鼠血清GLP-1 和胰高血糖素水平 與正常組相比，模型組小鼠血清GLP-1水平顯著降低，胰高血糖素水平顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，胰島素組、沙格列汀低、高劑量組小鼠血清GLP-1水平顯著升高，胰高血糖素水平顯著降低（P<0.05）；胰島素組和沙格列汀低劑量組小鼠血清GLP-1、胰高血糖素水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與胰島素組、沙格列汀低劑量組相比，沙格列汀高劑量組小鼠血清GLP-1 水平顯著升高，胰高血糖素水平顯著降低（P<0.05）。見表2。

表2 各組小鼠血清GLP-1、胰高血糖素水平比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of serum GLP-1 and glucagon levels in each group（±s，n=10）

表2 各組小鼠血清GLP-1、胰高血糖素水平比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of serum GLP-1 and glucagon levels in each group（±s，n=10）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with insulin group，3）P<0.05；com‐pared with saxagliptin low dose group，4）P<0.05.

Groups Normal Model Insulin Saxagliptin low dose Saxagliptin high dose F P GLP-1（mmol/ L）15.22±1.185.94±0.821）7.91±0.961）2）7.66±1.041）2）10.85±1.131）2）3）4）74.5480.000 Glucagon（pg/ ml）48.18±2.6466.84±2.851）59.59±2.881）2）62.02±2.951）2）54.68±2.731）2）3）4）38.6830.000

2.3 各組小鼠胰島α 細胞增殖情況 與正常組相比，模型組小鼠胰島α 細胞增殖指數(shù)顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，胰島素組、沙格列汀低、高劑量組小鼠胰島α 細胞增殖指數(shù)顯著降低（P<0.05）；胰島素組和沙格列汀低劑量組小鼠胰島α細胞增殖指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與胰島素組、沙格列汀低劑量組相比，沙格列汀高劑量組小鼠胰島α細胞增殖指數(shù)顯著降低（P<0.05）。見圖1、表3。

圖1 免疫組化檢測各組小鼠胰島α細胞增殖情況（×400）Fig.1 Proliferation of islet α cells was detected by immu?nohistochemistry（×400）

表3 各組小鼠胰島α細胞增殖指數(shù)比較（±s）Tab.3 Comparison of proliferation index of islet α cells in each group（±s）

表3 各組小鼠胰島α細胞增殖指數(shù)比較（±s）Tab.3 Comparison of proliferation index of islet α cells in each group（±s）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with insulin group，3）P<0.05；com‐pared with the low dose group of saxagliptin，4）P<0.05.

Groups Normal Model Insulin Saxagliptin low dose Saxagliptin high dose FP n 1010101010? ?Proliferation index（%）24.87±1.3344.63±1.421）35.16±1.151）2）34.57±1.281）2）30.44±1.321）2）3）4）310.2340.000

2.4 各組小鼠胰島α 細胞凋亡情況 與正常組相比，模型組小鼠胰島α 細胞凋亡指數(shù)顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，胰島素組、沙格列汀低、高劑量組小鼠胰島α 細胞凋亡指數(shù)顯著升高（P<0.05）；胰島素組和沙格列汀低劑量組小鼠胰島α細胞凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與胰島素組、沙格列汀低劑量組相比，沙格列汀高劑量組小鼠胰島α細胞凋亡指數(shù)顯著升高（P<0.05）。見圖2、表4。

圖2 TUNEL法檢測各組小鼠胰島α細胞凋亡情況（×400）Fig.2 Apoptosis of islet α cells was detected by TUNEL method（×400）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with insulin group，3）P<0.05；com‐pared with low dose group of saxagliptin，4）P<0.05.

2.5 各組小鼠胰腺組織中Ki-67、Bax 蛋白表達情況 與正常組相比，模型組小鼠胰腺組織中Ki-67蛋白表達水平顯著升高，Bax 蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，胰島素組、沙格列汀低、高劑量組小鼠胰腺組織中Ki-67 蛋白表達水平顯著降低，Bax 蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）；胰島素組和沙格列汀低劑量組小鼠胰腺組織中Ki-67、Bax 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與胰島素組、沙格列汀低劑量組相比，沙格列汀高劑量組小鼠胰腺組織中Ki-67 蛋白表達水平顯著降低，Bax 蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。見圖3、表5。

表5 各組小鼠胰腺組織中Ki-67、Bax 蛋白表達水平比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of Ki-67 and Bax protein expression levels in pancreas of mice in each group（±s，n=10）

表5 各組小鼠胰腺組織中Ki-67、Bax 蛋白表達水平比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of Ki-67 and Bax protein expression levels in pancreas of mice in each group（±s，n=10）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with insulin group，3）P<0.05；com‐pared with low dose group of saxagliptin，4）P<0.05.

Groups Normal Model Insulin Saxagliptin low dose Saxagliptin high dose F P Ki-67/ GAPDH 0.24±0.040.93±0.151）0.62±0.131）2）0.69±0.121）2）0.44±0.081）2）3）4）54.8790.000 Bax/ GAPDH 0.88±0.140.35±0.051）0.49±0.061）2）0.46±0.061）2）0.67±0.071）2）3）4）63.2310.000

圖3 各組小鼠胰腺組織中Ki-67、Bax蛋白表達水情況Fig.3 Expressions of Ki-67 and Bax proteins in pancreas of mice in each group

3 討論

糖尿病是一種嚴重的非傳染性慢性疾病，是重要的公共衛(wèi)生問題，分為T1DM、T2DM、妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）及特殊類型糖尿病4個類型。近年來，以兒童青少年為主的T1DM發(fā)病率逐年升高，在美國，T1DM 患者高達2500 多萬人，相關治療費用帶來的潛在社會、經濟負擔越來越重[8-11］。目前T1DM 的發(fā)病機制尚未完全闡明，多認為是胰島細胞受到自身免疫系統(tǒng)攻擊而減少或損傷，從而導致一系列不可逆的破壞[12］。既往研究治療對T1DM 胰島細胞的影響主要集中在胰島β細胞，針對胰島α 細胞的研究較少[13］。本研究通過研究沙格列汀對胰島α細胞增殖、凋亡的影響，以期為T1DM的臨床治療提供新思路。

本研究結果顯示，模型組小鼠血糖水平較正常組顯著升高，沙格列汀低、高劑量組小鼠血糖水平較模型組顯著降低，提示沙格列汀可降低T1DM 小鼠血糖。GLP-1 是胰高血糖素原經剪切后的產物，作用于胰島β 細胞可促進胰島素的轉錄、合成與分泌，刺激胰島β細胞的增殖和分化并抑制其凋亡，從而增加胰島β 細胞數(shù)量[14-15］。胰高血糖素可促進血糖升高，正常情況下與胰島素相互拮抗共同維持血糖穩(wěn)定，胰高血糖素拮抗劑在臨床應用中可有效維持血糖穩(wěn)態(tài)、改善β細胞功能，延緩甚至逆轉糖尿病病程[16］。王進紅等[17］研究發(fā)現(xiàn)，沙格列汀可通過阻斷GLP-1 降解調節(jié)胰島素分泌，加強機體對葡萄糖的利用及對血糖水平的控制。本研究結果顯示，與正常組相比，模型組小鼠血清GLP-1水平顯著降低，胰高血糖素水平顯著升高；與模型組相比，胰島素組、沙格列汀低、高劑量組小鼠血清GLP-1水平顯著升高，胰高血糖素水平顯著降低，提示T1DM 的發(fā)生與GLP-1、胰高血糖素水平有關，沙格列汀治療T1DM 可能通過影響GLP-1、胰高血糖素實現(xiàn)，與胰島素作用效果一致，且高劑量沙格列汀治療效果優(yōu)于胰島素。

胰島α 細胞可通過分泌GLP-1 進而影響胰島α細胞的增殖及功能，也可通過分泌胰高血糖素加速糖尿病進展[18-19］。本研究結果顯示，與正常組相比，模型組小鼠胰島α 細胞增殖指數(shù)顯著升高，凋亡指數(shù)顯著降低；與模型組相比，胰島素組、沙格列汀低、高劑量組小鼠胰島α細胞增殖指數(shù)顯著降低，凋亡指數(shù)顯著升高。Ki-67、Bax分別與細胞增殖、凋亡有關[20］。與正常組相比，模型組小鼠胰島α 細胞中Ki-67 蛋白水平顯著升高，Bax 蛋白水平顯著降低；與模型組相比，胰島素組、沙格列汀低劑量組、沙格列汀高劑量組小鼠胰島α 細胞中Ki-67 蛋白水平顯著降低，Bax 蛋白水平顯著升高，提示T1DM 可導致小鼠胰島α 細胞增殖、凋亡異常，沙格列汀、胰島素均可通過抑制T1DM 小鼠胰島α 細胞增殖并誘導其凋亡，推測沙格列汀可能通過影響胰島α細胞增殖、凋亡進而影響GLP-1、胰高血糖素分泌，最終導致胰島β細胞功能恢復正常，達到治療T1DM的目的。

綜上所述，沙格列汀可降低T1DM 小鼠血糖水平，可能是通過促進胰島α細胞凋亡并抑制其增殖，進而促進血清GLP-1 表達，并抑制胰高血糖素表達發(fā)揮作用的。