丁酸型產(chǎn)氫細(xì)菌WN9利用谷糠發(fā)酵的產(chǎn)氫特征

王霜傲，張 震，葉思岑，劉 茹，楊 靜，趙 鑫，2

（1.東北大學(xué) 資源與土木工程學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110819；2.東北大學(xué) 智慧水利與資源環(huán)境科技創(chuàng)新中心，遼 寧 沈 陽(yáng) 110819）

0 引言

氫氣，因其獨(dú)特的環(huán)境友好性和優(yōu)秀的能量攜帶能力（1.42×105J/g），被廣大科研和商業(yè)機(jī)構(gòu)認(rèn)為是亟待大力開發(fā)和推廣的新型能源[1]。除了傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法外，還可以采用微生物發(fā)酵的方式來(lái)制取氫氣，即生物制氫技術(shù)。生物制氫技術(shù)具有制氫過(guò)程溫和穩(wěn)定、能耗低、可以利用很多廉價(jià)的有機(jī)廢棄物、可實(shí)現(xiàn)有機(jī)廢水和廢棄物的質(zhì)能轉(zhuǎn)化等優(yōu)點(diǎn)。雖然生物制氫技術(shù)具有很多優(yōu)點(diǎn)，但是，在生物制氫技術(shù)工程化的道路上仍存在著菌種的氫轉(zhuǎn)化效率有待提升、底物選擇范圍有待拓寬和轉(zhuǎn)化效率有待增強(qiáng)等問(wèn)題。

針對(duì)產(chǎn)氫菌氫轉(zhuǎn)化效率有待提升的問(wèn)題，研究人員開展了高效產(chǎn)氫菌株的篩選以及工程菌株的構(gòu)建等研究，并取得一些進(jìn)展。目前，已分離獲得的高效產(chǎn)氫菌株主要來(lái)自Clostridium，Enterobacter和Ethanoligenens等 菌 屬[2]。其 中，關(guān)于Clostridium菌屬的研究最多，Clostridium菌屬的產(chǎn)氫菌株的產(chǎn)氫效率也相對(duì)更高[3]，[4]。張?jiān)鲁蛛x了1株具有異化鐵還原能力的產(chǎn)氫菌C.bifermentans EZ-1，以葡萄糖為底物時(shí)，最大比產(chǎn)氫率（以單位摩爾質(zhì)量的葡萄糖計(jì)）為1.11 mol/mol[5]。Noparat P從油棕汁液中分離了可以利用多種碳源發(fā)酵產(chǎn)氫的C.beijerinckii PS-3，其最大比產(chǎn)氫率（以單位質(zhì)量的總糖計(jì)）為140.9 mL/g[6]。Zhang J N從牛糞堆中分離了可以高效轉(zhuǎn)化纖維素的產(chǎn)氫細(xì)菌C.sartagoforme FZ11，以10 g/L微晶纖維素和羧甲基纖維素鈉為底物時(shí)，最大比產(chǎn)氫率（以單位 質(zhì) 量 的TS計(jì)）分 別 為77.2，64.6 mL/g[7]。

在我國(guó)，小米主要種植在黃河以北，年產(chǎn)量巨大，隨之產(chǎn)生的谷糠（分為外殼谷糠和內(nèi)殼谷糠，其中，外殼谷糠是谷子粗加工時(shí)的副產(chǎn)物，內(nèi)殼谷糠是谷子加工成小米時(shí)的副產(chǎn)物）處置問(wèn)題也亟待進(jìn)一步解決[8]。如果能夠使用發(fā)酵產(chǎn)氫微生物，進(jìn)一步利用谷糠中的纖維素和剩余淀粉，將其轉(zhuǎn)化為可被利用的氫氣，將為谷糠處置和資源化提供新的思路。

本研究嘗試從富含有機(jī)沉淀物的河道底泥中分離獲得高效產(chǎn)氫菌株，并對(duì)產(chǎn)氫效率最高的菌株進(jìn)行生理生化和系統(tǒng)發(fā)育鑒定，確定其系統(tǒng)發(fā)育地位；在初步了解產(chǎn)氫菌株比產(chǎn)氫率等特性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討其以谷糠為底物時(shí)的產(chǎn)氫特征，從而為后續(xù)開展谷糠類底物的發(fā)酵產(chǎn)氫研究提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 產(chǎn)氫菌的富集與分離篩選

PYG培 養(yǎng) 基（g/L）:葡 萄 糖10，蛋 白 胨3，酵 母浸 粉1，Na2HPO4·12H2O 21.5，KH2PO4·2H2O 8.1，MgCl2·6H2O 0.2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1，L-cysteine 0.3。

培養(yǎng)基定容后加熱至100℃，使用注射器轉(zhuǎn)移至厭氧管中，高純氮?dú)獯得摎埩羧芙庋?，橡膠塞封口，121℃滅菌15 min備用。

產(chǎn)氫菌富集物為牡丹江江濱公園富含有機(jī)沉淀物的河道底泥。稱取1 g底泥樣品裝入4 mL滅菌離心管，加入3 mL無(wú)菌生理鹽水，渦旋振蕩1 min，再靜止1 min，使用無(wú)菌注射器取0.5 mL上清液，轉(zhuǎn)接入?yún)捬醯腜YG培養(yǎng)基中。在恒溫?fù)u床中于35℃培養(yǎng)48 h，富集產(chǎn)物經(jīng)3代轉(zhuǎn)接，對(duì)生物氣進(jìn)行色譜檢測(cè)，對(duì)氫氣產(chǎn)量最高的富集樣本使用Hungate滾管技術(shù)進(jìn)行厭氧細(xì)菌分離。挑取單菌落轉(zhuǎn)至新的PYG液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，并持續(xù)檢測(cè)氣體含量，將產(chǎn)氣能力好的富集菌利用Hungate滾管技術(shù)純化至純培養(yǎng)細(xì)菌。

1.2 生理生化與系統(tǒng)生物學(xué)鑒定

利用Olympus BX51型光學(xué)顯微鏡和Hitachi 7500型透射電子顯微鏡觀察所篩選菌株的形態(tài)學(xué)特征[9]。革蘭氏染色觀察使用標(biāo)準(zhǔn)方法操作。使用北京索萊寶公司的小量細(xì)菌基因組提取試劑盒抽提基因組DNA，16S rRNA基因全長(zhǎng)使用通用引物BSF 8/27和BSR 1525/1541擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[9]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的細(xì)菌信息進(jìn)行比對(duì)分析。使用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 細(xì)菌產(chǎn)氫能力研究

通過(guò)在100 mL的厭氧瓶中進(jìn)行批次實(shí)驗(yàn)來(lái)研究細(xì)菌的產(chǎn)氫能力，分裝50 mL工作體積的PYG培養(yǎng)基，其余操作與富集培養(yǎng)時(shí)一致。按5%的體積比接種對(duì)數(shù)期的產(chǎn)氫菌，35℃恒溫氣浴震蕩培養(yǎng)，24 h后使用排水法測(cè)定生物氣體積。葡萄糖含量通過(guò)上海榮盛公司的葡萄糖測(cè)定試劑盒檢測(cè)。生物量以細(xì)菌烘干恒重的細(xì)胞干重計(jì)算[10]。實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵生物氣組分和揮發(fā)酸含量使用氣相色譜Agilent 7890A進(jìn)行測(cè)定，色譜柱為GSGASPRO和DB-FFAP[11]。

1.4 以谷糠為底物時(shí)的產(chǎn)氫特征研究

谷糠取自遼寧省朝陽(yáng)縣。內(nèi)/外殼谷糠分別自然風(fēng)干后粉粹，經(jīng)40目分樣篩過(guò)篩后備用。為了確定產(chǎn)氫菌以內(nèi)、外殼谷糠作為唯一碳源時(shí)的產(chǎn)氫能力，將谷糠投加量設(shè)定為0～70 g/L；同時(shí)，探討初始pH為4.0～9.0時(shí)，產(chǎn)氫菌利用谷糠產(chǎn)氫的能力。使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值（使用S220型pH計(jì)測(cè)定）。批次實(shí)驗(yàn)在100 mL的厭氧瓶中完成，分裝50 mL使用谷糠替代葡萄糖的PYG液體培養(yǎng)基，其余操作與之前相同。按5%的體積比接種對(duì)數(shù)期的產(chǎn)氫菌，35℃恒溫氣浴震蕩培養(yǎng)，48 h后使用排水法測(cè)定生物氣體積。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株分離與生長(zhǎng)特征

經(jīng)過(guò)初步富集與分離，共獲得9株具有較好產(chǎn)氫能力的菌株，其產(chǎn)氫能力如表1所示。其中，編號(hào)為WN9的菌株產(chǎn)氫能力最高，在富集培養(yǎng)基中，比產(chǎn)氫率（以單位摩爾質(zhì)量的葡萄糖計(jì)）可達(dá) 到1.69 mol/mol。

表1 初步分離菌株的產(chǎn)氫能力比較Table 1 H2 production capacity of different strains

菌株WN9嚴(yán)格厭氧，在PYG液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～48 h后呈乳白色，渾濁但無(wú)凝結(jié)沉淀。在固體培養(yǎng)基表面可形成直徑為2～3 mm的乳白色不透明菌落，有明顯邊緣，表面光滑，略粘稠。光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，菌株WN9呈短桿狀，可運(yùn)動(dòng)，革蘭氏陽(yáng)性，可產(chǎn)芽孢。圖1為菌株WN9的透射電子顯微鏡照片。從圖1可以看出，菌株WN9周身有 多 根 鞭 毛，菌 體 大 小 為0.5～1.0μm×2.0～2.5μm。

圖1 菌株WN9的透射電鏡顯微照片F(xiàn)ig.1 TEM micrograph of strain WN9

2.2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育特征

菌株WN9的16S rRNA基因序列大小為1 455 bp。與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已有的模式菌序列的比對(duì)結(jié)果顯示，菌株WN9與丁酸梭菌模式菌株C.butyricum JCM 1391T（NR1132441）的 相 似 性 最高，為99.9%。結(jié)合生理生化特征，確定菌株WN9為丁酸梭菌屬的新菌株，命名為C.butyricum WN9。

2.3 菌株WN9以葡萄糖為底物時(shí)的產(chǎn)氫特征

在進(jìn)一步探討菌株WN9利用其他底物產(chǎn)氫的能力之前，先在35℃的恒溫條件下，對(duì)其以10 g/L葡萄糖為底物的發(fā)酵產(chǎn)氫能力進(jìn)行了研究。經(jīng)過(guò)24 h的培養(yǎng)，菌株WN9對(duì)葡萄糖的利用率為91.7%，細(xì)胞干重為1.04 g/L，終點(diǎn)pH值為4.10，比產(chǎn)氫率（以單位摩爾質(zhì)量的葡萄糖計(jì)）為1.89 mol/mol，較原始培養(yǎng)提升了11.8%；菌株WN9的氣相末端產(chǎn)物為H2和CO2（體積分?jǐn)?shù)分別約為52.9%和47.1%），液相末端產(chǎn)物為丁酸（約 為2 300 mg/L）、乙 酸（約 為2 200 mg/L）、乙 醇（約為13 mg/L）和丙酸（約為11 mg/L）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連續(xù)轉(zhuǎn)代和對(duì)數(shù)期接種可以進(jìn)一步提升菌株的生長(zhǎng)活性，提升其代謝效率，有助于提高產(chǎn)氫菌的底物轉(zhuǎn)化利用能力，提高系統(tǒng)的產(chǎn)氫效率。

2.4 菌株WN9以谷糠為底物時(shí)的產(chǎn)氫特征

谷糠中含有較多的纖維素和少量的淀粉，可供微生物生長(zhǎng)使用。為了探討菌株WN9以其為底物進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)氫的可能性，分別研究了谷糠濃度和初始pH對(duì)菌株WN9產(chǎn)氫效率的影響。

2.4.1 谷糠濃度對(duì)菌株WN9產(chǎn)氫的影響

為探尋最適的谷糠使用量，在溫度為35℃，初始pH值為7.0的條件下，選擇內(nèi)、外殼谷糠的投加量（底物濃度）均為0～70 g/L，然后進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 底物濃度對(duì)比產(chǎn)氫率的影響Fig.2 Effects of substrate concentration on H2 production yield

從圖2可以看出，以內(nèi)、外殼谷糠為底物時(shí)，隨著底物濃度的逐漸增大，比產(chǎn)氫率（以單位質(zhì)量的TS計(jì)，下同）均表現(xiàn)出先增加后降低的變化趨勢(shì)，但最大比產(chǎn)氫率并不同時(shí)獲得。以外殼谷糠為底物時(shí)，比產(chǎn)氫率隨著底物濃度的增加而增長(zhǎng)，并在底物濃度為30 g/L時(shí)獲得最大值 （12.7 mL/g），隨后，隨著底物濃度的繼續(xù)增加，比產(chǎn)氫率則逐步降低。以內(nèi)殼谷糠為底物時(shí)，獲得的比產(chǎn)氫率明顯高于外殼谷糠。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0 g/L時(shí)，比產(chǎn)氫率為15.0 mL/g；隨著底物濃度的逐漸增加，比產(chǎn)氫率也逐漸增加，并在底物濃度為50 g/L時(shí)獲得最大值（20.1 mL/g）；隨著底物濃度的繼續(xù)增加，比產(chǎn)氫率隨之下降。以內(nèi)殼谷糠為底物時(shí)獲得的最高比產(chǎn)氫率是以外殼谷糠為底物時(shí)的1.58倍。

底物濃度對(duì)產(chǎn)氫系統(tǒng)終點(diǎn)pH值（簡(jiǎn)稱為終點(diǎn)pH值）的影響如圖3所示。從圖3可以看出，隨著底物濃度的逐漸增加，以內(nèi)、外殼谷糠為底物時(shí)的終點(diǎn)pH值均表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，且以內(nèi)殼谷糠為底物時(shí)的終點(diǎn)pH值的下降趨勢(shì)更加明顯。以外殼谷糠為底物時(shí)，隨著底物濃度的逐漸增加，終點(diǎn)pH值緩慢降低，從pH 6.55（底物濃度為10 g/L）緩慢降低至pH 5.97（底物濃度為70 g/L）；而相同條件下，以內(nèi)殼谷糠為底物時(shí)，終點(diǎn)pH值快速地從pH 6.43降低至pH 5.14。

圖3 底物濃度對(duì)終點(diǎn)pH值的影響Fig.3 Effects of substrate concentration on endpoint pH

小米谷糠中含有較多硬殼 （纖維素和半纖維素含量很高），這些硬殼很難被細(xì)菌直接利用。特別是外殼谷糠，可被利用的有機(jī)物更少，而內(nèi)殼谷糠中除含有纖維素和半纖維素外，還含有少量的淀粉和多糖。因此，以外殼谷糠為底物時(shí)，菌株WN9的發(fā)酵產(chǎn)氫效率明顯低于以內(nèi)殼谷糠為底物時(shí)。當(dāng)外殼谷糠濃度增加至30 g/L時(shí)，比產(chǎn)氫率獲得最大值。雖然，隨著外殼谷糠濃度繼續(xù)增加，有機(jī)物濃度增加，但是，可被利用的底物有限，由于底物的限制，總體的比產(chǎn)氫率明顯降低。內(nèi)殼谷糠的硬殼含量較低，含有更多的可被利用的淀粉和多糖，因此，以內(nèi)殼谷糠為底物時(shí)，菌株WN9的產(chǎn)氫量明顯優(yōu)于外殼谷糠。當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂?0 g/L，比產(chǎn)氫率的變化不明顯，僅在底物濃度為50 g/L時(shí)獲得最大值，隨后，又略有下降。比產(chǎn)氫率變化不大，說(shuō)明絕大多數(shù)底物中的可利用有機(jī)質(zhì)都被用于細(xì)菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)氫，這與揮發(fā)酸產(chǎn)量增加，終點(diǎn)pH值始終保持勻速下降的趨勢(shì)相吻合。

2.4.2 初始pH值對(duì)谷糠發(fā)酵產(chǎn)氫的影響

產(chǎn)氫系統(tǒng)的初始pH值（簡(jiǎn)稱為初始pH值）是影響發(fā)酵產(chǎn)氫的重要因素之一。為了探尋菌株WN9以谷糠為底物發(fā)酵產(chǎn)氫的最佳初始pH值，在溫度為35℃，內(nèi)、外殼谷糠濃度均為50 g/L的條件下，選擇初始pH值為4.0～9.0進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 初始pH值對(duì)比產(chǎn)氫率的影響Fig.4 Effects of initial pH on H2 production yield

從圖4可以看出，分別以內(nèi)、外殼谷糠為底物時(shí)，隨著初始pH值的逐漸升高，比產(chǎn)氫率均表現(xiàn)出先增高后降低的變化趨勢(shì)。以外殼谷糠為底物時(shí)，比產(chǎn)氫率隨初始pH值的逐漸升高而緩慢增加，并在初始pH值為6.0時(shí)獲得最大值（15.5 mL/g）；當(dāng)初始pH值繼續(xù)升高時(shí)，比產(chǎn)氫率迅速降低，并明顯低于初始pH值為4.0時(shí)的比產(chǎn)氫率。以內(nèi)殼谷糠為底物時(shí)，比產(chǎn)氫率隨初始pH值的逐漸升高而明顯增長(zhǎng)，并在初始pH值為6.0時(shí)獲得最大值（21.5 mL/g）；當(dāng)初始pH值繼續(xù)增加至7.0時(shí)，比產(chǎn)氫率緩慢降低，之后隨初始pH值的升高而迅速下降。

初始pH值對(duì)終點(diǎn)pH值的影響如圖5所示。從圖5可以看出，分別以內(nèi)、外殼谷糠為底物時(shí)，終點(diǎn)pH值均隨著初始pH值的升高而升高。但是，以外殼谷糠為底物時(shí)的終點(diǎn)pH值始終略高于以內(nèi)殼谷糠為底物時(shí)，特別是在初始pH值為6.0～7.0時(shí)，終點(diǎn)pH值的差別更明顯。這說(shuō)明以內(nèi)殼谷糠為底物更適宜產(chǎn)氫菌生長(zhǎng)，從而產(chǎn)生更多的揮發(fā)酸，降低了體系的終點(diǎn)pH值。

圖5 初始pH值對(duì)終點(diǎn)pH值的影響Fig.5 Effects of initial pH on the endpoint pH

有研究表明，過(guò)低或過(guò)高的初始pH值均會(huì)降低微生物的活性，或直接抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致產(chǎn)氫效率受到影響[13]。但是，與其他研究明顯不同的是，在本研究中，當(dāng)初始pH值為4.0～6.0時(shí)，菌株WN9可以獲得比初始pH值為7.0～9.0時(shí)更高的比產(chǎn)氫率，特別是以外殼谷糠為底物時(shí)。因此，可以推斷，較低的初始pH值可以幫助破壞谷糠硬殼部分的纖維素和半纖維素結(jié)構(gòu)，有利于釋放其中的有機(jī)質(zhì)，從而更好地被產(chǎn)氫菌株利用，菌株自身代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸，進(jìn)一步加快了這一過(guò)程，提高了底物的轉(zhuǎn)化效率。當(dāng)體系的初始pH值＞7.0時(shí)，對(duì)底物沒(méi)有酸解作用，其中的有機(jī)質(zhì)很難被釋放并利用，因此，比產(chǎn)氫率明顯較低。由于外殼谷糠中的硬殼部分比內(nèi)殼谷糠多，因此，這一現(xiàn)象更加明顯。

3 結(jié)論

本研究從牡丹江河道底泥中分離了1株丁酸型發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌C.butyricum WN9，該細(xì)菌以葡萄糖為底物進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，液相末端產(chǎn)物為乙酸、丁酸、乙醇和丙酸，氣相末端產(chǎn)物為H2和CO2，比產(chǎn)氫率為1.89 mol/mol。以小米內(nèi)、外殼谷糠為唯一碳源時(shí)，最適宜的底物濃度分別為50，30 g/L，且內(nèi)殼谷糠更易被產(chǎn)氫菌利用，最大比產(chǎn)氫率為20.1 mL/g。低pH條件（pH＜6）有利于酸解外殼谷糠，釋放其中的有機(jī)質(zhì)，提高產(chǎn)氫效率。以內(nèi)、外殼谷糠為底物時(shí)，最適初始pH值均為6.0，最大比產(chǎn)氫率分別為21.5，15.5 mL/g。