薔薇屬黑斑病抗性與葉片結(jié)構(gòu)及酶活性研究

郭艷紅，張 顥，陳宇春，蹇洪英，陳 敏，唐開學(xué)，邱顯欽

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，云南 昆明 650205；2.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650091；3國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650205)

【研究意義】月季(Rosahybrid)是薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa)的植物，是中國十大名花之一的“花中皇后”，世界四大鮮切花之一，具有極高的觀賞價值[1]。薔薇盤二孢及細極鏈格孢(Alternariatenuisima)侵染會引發(fā)月季黑斑病[2]，主要病理表現(xiàn)在月季葉片、嫩莖、花梗等部位。葉片染病初期，正面出現(xiàn)黑褐色小斑點，隨著染病病情的加重，黑褐色逐漸變?yōu)榘岛稚?，斑點不斷擴大，一般表現(xiàn)為不規(guī)則或圓形的病斑，借助雨水、風(fēng)以及昆蟲傳染到其它葉片上，其病害嚴重時會引起葉片大量脫落，甚至導(dǎo)致月季死亡[3]。嫩莖和花梗染病后，病斑呈現(xiàn)出紫黑色的條形或長橢圓形的斑點，病斑會下陷。現(xiàn)代月季種非常豐富，日常生活隨處可見，但黑斑病病原菌容易產(chǎn)生各類生理小種，降低月季的抗病性，進而影響月季的產(chǎn)量及觀賞性，因此急需引入更優(yōu)良的薔薇遺傳資源[4]。中國薔薇屬野生資源十分豐富，調(diào)查顯示：中國薔薇屬野生種質(zhì)資源，約占全球總數(shù)的48%，其中有近50%的資源集中在中國西南地區(qū)[5]。而眾多的野生薔薇屬優(yōu)秀種質(zhì)資源目前抗病研究匱乏，較少被開發(fā)利用[6]?！厩叭搜芯窟M展】目前對于黑斑病的抗性鑒定主要集中在核桃(Caryacathayensis)、黃瓜(Cucumissativus)、甘薯(Dioscoreaesculenta)以及胡蘿卜(Daucuscarotavar.sativa)等作物[7]上。張雪輝等[8]發(fā)現(xiàn)紅衣主教、大衛(wèi)、薩曼莎等現(xiàn)代月季高抗品種可有效抵御黑斑病；王瓊[8]找到了篝火、金瑪麗、洛麗塔、芳純4個高抗品種。采用抗病品種是防治植物病害最經(jīng)濟的方法之一，抗病性鑒定和抗病種質(zhì)資源的篩選是抗病育種的基礎(chǔ)。柳麗娜等[9]對不同茶用菊品種進行電鏡掃描，發(fā)現(xiàn)抗病品種表皮毛密度普遍高于感病品種，氣孔密度小于感病品種。徐東生[10]發(fā)現(xiàn)月季抗病品種嫩葉SOD活性高于感病品種；與老葉相比，病葉SOD、PPO活性上升，POD活性有降有升?！颈狙芯壳腥朦c】以云南省農(nóng)科院雨樹村花卉基地46份薔薇屬野生種為材料，對葉片發(fā)病率、病情指數(shù)以及相對病情指數(shù)等進行分析，最后利用相對抗病性指數(shù)進行綜合評價。篩選免疫與高感野生種，測定SOD、PPO、POD酶活性并對葉表皮結(jié)構(gòu)應(yīng)用掃描電子顯微鏡進行觀察?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過評價薔薇屬野生種質(zhì)資源對黑斑病的抗病性，篩選具有優(yōu)良抗病基因的薔薇屬植物種質(zhì)資源，不僅為培育具有黑斑病抗性的月季新品種奠定理論基礎(chǔ)，并且具有重要的生態(tài)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

月季由云南省農(nóng)科院雨樹村花卉基地的芹葉組、薔薇組和桂味組等9個組提供共計46份野生種(表1)。黑斑病菌源采自云南省農(nóng)科院雨樹村花卉基地大棚。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑斑病的分離、純化 采集具有明顯黑斑病癥狀的野生月季病葉，后用清水洗凈，接著用次氯酸鈉消毒2 min，再用無菌蒸餾水沖洗4次，2次重復(fù)。吸去表面水分，沿著病斑將病葉切成小塊，移至PDA平板，置于溫度25 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。2 d后，挑取菌絲，移到PDA平板上，繼續(xù)放于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d，孢子大量產(chǎn)生時，挑取單孢子置于PDA平板培養(yǎng)基上25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。7～10 d后，將培養(yǎng)的月季黑斑病菌落挑至試管中，經(jīng)消毒的解剖針搗碎，加入適量的無菌水，混勻，靜置5～8 min，保留上清液，鏡檢并調(diào)成孢子含量為2×105mL-1的孢子懸浮液，待用。

1.2.2 黑斑病抗性室內(nèi)鑒定試驗 采集具有4～5對復(fù)葉的月季小枝條，摘除頂端葉片，保留剩余的新鮮、健康的葉片，用自來水洗凈并吸去表面水分。將紗布放入培養(yǎng)皿中，加入7 mL滅菌水，葉片正面朝上放入皿內(nèi)，每片葉片加入40 μL的孢子懸浮液[11]。用封口膜封嚴培養(yǎng)皿后，放入25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后，用吸水紙將接種的孢子懸浮液吸去，補加無菌水，接著用封口膜將培養(yǎng)皿封嚴，放入25 ℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，中途注意觀察，及時補加無菌水。7 d后進行病情統(tǒng)計，記錄病斑直徑大小。試驗設(shè)3個重復(fù)。

1.2.3 黑斑病抗性的田間接種鑒定試驗 選取大棚內(nèi)健康還未感染蟲害病害的鮮嫩葉片，將孢子懸浮液均勻噴灑在供試葉片上，每株噴1 mL孢子懸浮液，用扎有小洞的薄膜迅速覆蓋，1 d后，揭除薄膜。3次重復(fù)。調(diào)查接種后第15天[12]的發(fā)病率、病情指數(shù)，劃分各品種的抗病性。

1.2.4 病情調(diào)查 室內(nèi)鑒定病情的分級標準[11]為1級，0 mm；2級，0～2.0 mm；3級，2.0～3.0 mm；4級，3.0～4.0 mm；5級，4.0～4.5 mm；6級，4.5～5.0 mm；7級，>5 mm。田間接種鑒定病情的分級標準[12]為0級，不發(fā)??；1級，發(fā)病葉片占總?cè)~片的1/4以下；2級，發(fā)病葉片占總?cè)~片的1/4～1/2以下；3級，發(fā)病葉片占總?cè)~片的1/2～3/4以下；4級，發(fā)病葉片占總?cè)~片的3/4以上(含3/4)。

發(fā)病率(%)=感染黑斑病葉片數(shù)/調(diào)查總?cè)~片數(shù)×100

病情指數(shù)(%)=∑[(病級株數(shù)×病級)/(總株數(shù)×最高病級)]×100

1.2.5 抗性劃分標準 采用相對抗病性方法評價其抗病程度[11]，抗病程度分為免疫(I)、高抗(HR)、中抗(MR)、中感(MS)、高感(HS)5類，相對抗病指數(shù)分別為1.00、0.70～0.99、0.40～0.69、0.20～0.39和0.20以下。

相對抗病性指數(shù)= 1-相對病情指數(shù)

相對病情指數(shù)=鑒定品種病情指數(shù)/對照種病情指數(shù)(病情指數(shù)最高者為對照種)

1.2.6 酶活性測定 采摘展葉4 d左右未染病的正常葉片以及自然感病、病斑明顯的病葉。參照徐東生[10]的方法，測定SOD、POD和PPO活性，3次重復(fù)。其中SOD以抑制光還原反應(yīng)50%為1個酶活性單位；POD以每分鐘的OD值變化0.01為1個過氧化物酶活性單位；PPO以每分鐘OD值變化0.01為1個多酚氧化酶活性單位。

1.2.7 電子掃描顯微鏡觀察 選取鑒定為免疫及高感的野生種各1份，于冬季，裁剪一小段的枝條，枝條上含肉眼看起來生長良好的、未染病的葉片。將采摘帶枝條的葉片用蒸餾水洗凈后。用潔凈刀片切取約4 mm×4 mm長的葉片，用電導(dǎo)膠粘于樣品臺上，觀察面朝上，放入干燥器中干燥5 min左右，在ETD-2000型離子濺射儀中鍍金膜3 min，然后置于型號為Quanta-200的掃面電鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑斑病抗性鑒定

如表1～2所示，室內(nèi)鑒定和田間鑒定的結(jié)果基本一致，大部分的接種葉片均不同程度感病。室內(nèi)鑒定46份野生資源中，黑斑病免疫種2份，分別為百葉薔薇和金櫻子；黑斑病高抗種13份，分別為白薔薇、黃刺玫、細梗薔薇、亮葉月季、月季花、大花香水月季、白玉堂、伍茲薔薇、白木香花、小果薔薇、刺梨、中甸刺玫和碩苞薔薇；黑斑病中抗種5份，分別為玫瑰、絹毛薔薇、光葉薔薇、復(fù)傘房薔薇和川滇薔薇；黑斑病中感種13份，分別為毛葉薔薇、中甸薔薇、大葉薔薇、多苞薔薇、鈍葉薔薇、西南薔薇、野薔薇、麗江薔薇、懸鉤子薔薇、卵果薔薇、長尖葉薔薇、毛萼薔薇和狗薔薇；黑斑病高感種13份，分別為峨眉薔薇、單瓣黃刺玫、大馬士革薔薇、彎刺薔薇、多腺小葉薔薇、刺薔薇、粉蕾木香、香水月季、粉紅香水月季、七姊妹、銀粉薔薇、單瓣白木香和黃木香花。

表1 薔薇屬野生資源抗黑斑病鑒定結(jié)果

峨眉薔薇、多腺小葉薔薇和刺薔薇的室內(nèi)鑒定均為中感，但是其田間鑒定均為高感；毛葉薔薇、西南薔薇的室內(nèi)鑒定均為高感，但是田間鑒定均為中感。高抗野生種主要集中在小葉組和碩苞組；高感主要集中在桂味組。

2.2 酶活性測定

通過對金櫻子和粉紅香水月季葉片的生理指標的測定，研究發(fā)現(xiàn)3種酶活性存在一定的差異。如表3所示，2份野生種感病后3種酶活性均呈現(xiàn)上升狀態(tài)，其中以粉紅香水月季POD活性的升高最明顯，達到了254.00 U·min-1·g-1，免疫材料金櫻子正常葉片與病葉的SOD、POD和PPO活性均比高感材料粉紅香水月季高，更有益于抵御病害。高感材料酶活性上升率高于免疫材料，感病野生種粉紅香水月季POD活性上升最明顯，達到767.78%，抗病野生種金櫻子SOD活性上升幅度最小僅為7.84%。

表2 薔薇屬野生資源抗黑斑病分布

表3 2份薔薇屬野生種酶活性變化

2.3 葉片結(jié)構(gòu)電鏡掃描

免疫材料金櫻子及高感材料粉紅香水月季葉片直觀觀察沒有較大的區(qū)別，葉片光滑，葉脈清晰，均未見明顯刺毛。電鏡掃描結(jié)果如圖1所示，免疫材料金櫻子葉片正面蠟質(zhì)層密質(zhì)均勻，角質(zhì)層細胞明顯且排列緊密，細胞間的間隙被填滿，其葉片背面的角質(zhì)層細胞明顯且排列緊密，氣孔較小且開度小，氣孔周圍未見明顯絲狀物；高感材料粉紅香水月季葉片正面蠟質(zhì)層疏散不均勻，角質(zhì)層細胞排列疏松，其葉背面的角質(zhì)層細胞模糊，氣孔較大且開度也較大，氣孔周圍有明顯的絲狀物。

3 討 論

月季黑斑病是月季重要病害之一，目前防治病害主要依靠化學(xué)藥劑，例如采用嘧菌酯懸浮劑和氟吡菌胺·霜霉威懸浮劑對低等真菌進行防治[13]，但藥劑成本高且容易殘留于土壤，對生態(tài)環(huán)境造成破壞。黑斑病的防治要推行以防為主，藥劑為輔，著重于選擇高抗月季品種。馬燕等[14]利用月季與野生薔薇雜交，得到了月季抗病新品種—刺玫月季。因此通過挖掘野生薔薇屬抗性種質(zhì)資源，進行遠緣雜交育種，進而獲得新的抗病月季品種顯得尤為重要。植物抗病受到諸多因素的影響，包括環(huán)境因子、外源物、病原菌與植物的互作等，對于黑斑病抗性鑒定方法通常采用田間鑒定和室內(nèi)鑒定。劉麗等[15]對12份大白菜品種進行抗黑斑病田間鑒定，發(fā)現(xiàn)高抗病品種5份。劉郵洲等[16]采用田間鑒定和人工接種鑒定相結(jié)合對16份梨品種進行黑斑病抗性鑒定，篩選出4份高抗黑斑病的梨品種‘華酥’、‘早美酥’、‘黃花’和‘豐水’。通過對現(xiàn)有的野生薔薇屬資源9個組的46份野生種的抗黑斑病資源的篩選顯示：百葉薔薇和金櫻子為黑斑病免疫材料，占鑒定野生種的4.3%；黃刺玫、腺梗薔薇等13份野生種是黑斑病高抗的材料，占鑒定野生種的28.3%。

月季感染黑斑病后，各種生理生化水平變化顯著。徐東生[10]以2份現(xiàn)代月季抗黑斑病品種和3份感病品種為材料，測定了其SOD、POD及PPO的含量，發(fā)現(xiàn)抗病品種的3種酶活性均比感病品種高，高酶活性可以消除病原菌侵染帶來的影響，因此低酶活性的感病野生種必須通過大幅度提高酶活性才能抵抗病原物帶來的影響。源朝政等[17]認為目前尚未發(fā)現(xiàn)完全抗黑斑病的月季品種，但本次實驗在月季野生種中發(fā)現(xiàn)了免疫材料。目前對于野生種百葉薔薇和金櫻子的抗病研究較少，研究較多的是重視于百葉薔薇的香氣品質(zhì)和油用價值以及金櫻子果實的藥用價值。氣孔是葉片與外界環(huán)境物質(zhì)交換的重要通道，金櫻子葉片革質(zhì)光滑，相較于高感野生種粉紅香水月季的氣孔器密度小且氣孔開度也較小，蠟質(zhì)層密質(zhì)均勻，雨水與昆蟲等不易著附其上，減少了病原菌的傳播，對植物本身起到了極好的保護作用。李海英等[18]研究表明，大豆高抗灰斑病品種葉表皮氣孔密度明顯少于感病品種，與本研究結(jié)果一致。高抗野生種中黃刺玫和細梗薔薇等與孫憲芝[19]研究結(jié)果一致，彎刺薔薇卻有所差異，這一結(jié)果可能與鑒定地點的小氣候及該種適應(yīng)性等因素有關(guān)。王芳[20]發(fā)現(xiàn)黑暗與弱光、溫度25 ℃、堿性土壤更有益于黑斑病原菌的生長。室內(nèi)鑒定結(jié)果與田間鑒定的差異，究其原因是田間抗性鑒定更容易受到外界環(huán)境條件和土壤微生物等因素的影響。免疫材料和高抗材料可作為雜交育種手段的優(yōu)選品種，同時為抗性基因的篩選提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

通過對46份薔薇屬野生種質(zhì)資源的抗黑斑病評價，共發(fā)現(xiàn)免疫野生種2份，高抗野生種13份，中抗野生種5份，中感野生種13份，高感野生種13份。不同抗病和感病月季品種在感染黑斑病后，其體內(nèi)的酶含量會表現(xiàn)明顯變化，研究表明，月季葉片受到黑斑病侵染時SOD、POD和PPO活性均有明顯的上升趨勢。通過電鏡掃描免疫及高感材料葉片組織結(jié)構(gòu)顯示：葉表面具有均勻蠟質(zhì)層，角質(zhì)層細胞排列緊密，氣孔密度小等特質(zhì)的葉片結(jié)構(gòu)更有益于預(yù)防黑斑病原菌。通過雜交育種及分子育種等手段將百葉薔薇和金櫻子等免疫和高抗黑斑病抗性基因滲透到現(xiàn)代月季基因組中，加速培育出新型抗病月季品種，不僅防控黑斑病中避免化學(xué)藥劑的過度使用，同時有助于推進月季綠色產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。