β-環(huán)糊精包合羚珠散的制備工藝及其抗驚厥活性分析

薛 錚，杜丹陽(yáng)，劉嫣蓉，楊 琰，劉 瑩，劉 康，石心紅（通訊作者）

（中國(guó)藥科大學(xué) 江蘇 南京 211198）

羚珠散作為一種兒科散劑，常用于治療小兒發(fā)熱驚厥。在2015版藥典之前，散劑不允許添加輔料。石菖蒲油和冰片是羚珠散中揮發(fā)性成分，不穩(wěn)定[1]，致使其在制劑生產(chǎn)和貯存過程中損失較大[2]。中醫(yī)治療癇癥有長(zhǎng)久的歷史。羚珠散在治療癲癇時(shí)起效緩慢，但作用時(shí)間持久，可以有效遏制腦細(xì)胞異常放電而引起的熱性驚厥[3]。因此，本研究采用環(huán)糊精包合的技術(shù)，有效提高其穩(wěn)定性的同時(shí)，保證該方的藥效。本實(shí)驗(yàn)采用研磨法制備β-環(huán)糊精（β-CD）包合物，通過正交設(shè)計(jì)法研究冰片和石菖蒲油的包合最佳工藝條件。此外，通過戊四氮（PTZ）致癇小鼠模型[4]，考察羚珠散原方及優(yōu)化方對(duì)小鼠癲癇樣行為的影響，探究其抗癇的生理機(jī)制。

1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與設(shè)備

MT5超微量級(jí)天平（METTLER TOLEDO公司），BT 125D電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，LQ-C50001電子天平（深圳市飛亞衡器有限公司），KH-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市禾創(chuàng)超聲波儀器有限公司），YL-100B實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（深圳市億利源水處理設(shè)備有限公司），DZF-6090真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠），DIONEX UltiMate 3000 Autosampler UHPLC液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司），GC-2010氣相色譜儀（日本島津公司）。

1.2 藥品與試劑

石菖蒲油、冰片、朱砂和羚珠散（由雷允上藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，批號(hào)：8-030725、BP1807003-180821、20181202-181224和SAob003），環(huán)糊精（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20161215），β-細(xì)辛醚（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：112018-201601），龍腦（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110881-201709），戊四氮（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：A20J10 L91178），苯妥英鈉（安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：180419 6B），甲醇（色譜純，美國(guó)天地有限公司）。其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí) 雄 性ICR小 鼠（3～4周），體 重14～18 g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)碼SCXK（滬）2018-0006。所有實(shí)驗(yàn)操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)要求（倫理審批號(hào)：CPU2019021）。

2.混合揮發(fā)性成分β-CD包合物的制備及藥效學(xué)評(píng)價(jià)

2.1 HPLC法測(cè)定包合物中β-細(xì)辛醚的含量

PRAZIS Absolute? C18色譜柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（60:40）；檢測(cè)波長(zhǎng)：253 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：10 μL。理論塔板數(shù)以β-細(xì)辛醚計(jì)算應(yīng)不低于6 000。

2.2 GC法測(cè)定包合物中龍腦的含量

以WONDACAP 1為固定相的毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.53 mm，1.50 μm）；氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）；柱溫：100℃保持1 min，10℃/min程序升溫至250℃；氣化室溫度：270℃；檢測(cè)器溫度：270℃；載氣：He；色譜柱流量：6.89 mL/min；尾吹氣：N2，30.0 mL/min；氫氣流量：40.0 mL/min；空氣流量：400 mL/min；分流比：10:1；進(jìn)樣量：1 μL。理論塔板數(shù)以龍腦計(jì)算應(yīng)不低于6 000。

2.3 包合工藝的優(yōu)化

精密稱取適量β-CD置于研缽中，加入適量純水研磨均勻。精密稱取冰片和石菖蒲油，加入無(wú)水乙醇溶液混勻。將上述溶液滴入研缽中，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)連續(xù)研磨至糊狀。先用少量水洗，再用少量乙酸乙酯洗，于45℃真空干燥5 h，精密稱定包合物質(zhì)量，通過下列計(jì)算包合物得率。采用正交試驗(yàn)優(yōu)化混合β-CD包合物的包合工藝，選取影響因素較大的研磨時(shí)間（A）、揮發(fā)油與β-CD的比例（B）及揮發(fā)油與水的比例（C）。

包合物得率=包合物質(zhì)量/（揮發(fā)性成分投入量+環(huán)糊精投入量）×100%

2.4 包合物的包合率和含油率測(cè)定

精密稱定包合物粉末100 mg，置50 mL容量瓶中，加入甲醇，充分振搖，超聲處理1.5 h，放冷，定容至刻度線，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液1。取包合物粉末約100 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入無(wú)水乙醇，充分振搖，超聲處理60 min，放冷，定容至刻度線，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液2。精密吸取供試品溶液1按照“2.1”，供試品溶液2按照“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定β-細(xì)辛醚和龍腦的峰面積。通過下列公式計(jì)算包合物中包合率和含油率。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，方差分析見表2。

表1 正交試驗(yàn)表

表2 方差分析表

包合率=稱取樣品中揮發(fā)性成分的重量/[揮發(fā)性成分投入量×（稱取樣品的重量/包合物總重量）×空白回收率]×100%

含油率=稱取樣品中揮發(fā)性成分的重量/[（揮發(fā)性成分投入量+環(huán)糊精投入量）×空白回收率]×100%

方差分析結(jié)果顯示，影響包合物包合效果的主次關(guān)系為環(huán)糊精與水比例>研磨時(shí)間>揮發(fā)油與環(huán)糊精的比例。最優(yōu)參數(shù)為：研磨時(shí)間35 min，投料比1:8，溶劑比1:1。其中投料比和溶劑比對(duì)工藝都有顯著影響。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按篩選出的最佳包合工藝進(jìn)行驗(yàn)證。分別制備3批包合物，包合物得率、包合率和含油率平均值分別為97.78%、98.23%、4.50%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

2.6 戊四氮誘導(dǎo)小鼠驚厥

取ICR小鼠按體重隨機(jī)分組，每組10只，共6組：模型組，陽(yáng)性藥組（苯妥英鈉50 mg/kg），羚珠散原方高低劑量組（1.0、0.5 g/kg），羚珠散優(yōu)化方高低劑量組（1.0、0.5 g/kg）。每天給藥組灌胃給予不同劑量藥液（0.1 mL/kg），模型組給予0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)3 d，末次給藥前禁食不禁水12 h。末次給藥后1 h，腹腔注射PTZ（110 mg/kg）。觀察小鼠發(fā)作時(shí)的行為變化，按Racine分級(jí)[5]，記錄其從注射PTZ到發(fā)生驚厥的陣攣潛伏期、強(qiáng)直潛伏期、死亡時(shí)間。相比于模型組，各組強(qiáng)直潛伏期和死亡時(shí)間都有明顯延長(zhǎng)，且呈劑量依賴性。陽(yáng)性藥組和優(yōu)化方高低劑量組的強(qiáng)直潛伏期和死亡時(shí)間，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。經(jīng)Fisher確切概率法檢驗(yàn)，提示死亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過組間的兩兩比較，陽(yáng)性組、優(yōu)化方高低劑量組與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明這三組能顯著抑制戊四氮導(dǎo)致的小鼠死亡。提示羚珠散中揮發(fā)性成分的包合是有意義的，見表3。

表3 羚珠散原方及優(yōu)化方對(duì)戊四氮致癇小鼠的影響（±s, n=10）

表3 羚珠散原方及優(yōu)化方對(duì)戊四氮致癇小鼠的影響（±s, n=10）

注：與空白組比較，*P＜0.05；**P＜0.01。

組別 陣攣潛伏期/s 強(qiáng)直潛伏期/s 死亡時(shí)間/s 死亡率/%模型組 41.80±7.35 281.30±147.62 314.60±149.57 100.00陽(yáng)性藥組 52.20±5.81 1 800.00±0.00* 1 800.00±0.00* 0.00*原方低劑量組45.90±5.45 510.60±453.88 603.60±442.99 90.00原方高劑量組47.60±7.39 614.40±432.44 646.60±418.92 90.00優(yōu)化方低劑量組 48.10±11.13 1 051.90±536.81*1 338.40±496.86*50.00*優(yōu)化方高劑量組 57.20±15.25 1 212.60±521.90*1 445.00±475.13*40.00*

3.討論

本實(shí)驗(yàn)基于羚珠散中揮發(fā)性成分不穩(wěn)定而展開，從企業(yè)的生產(chǎn)條件和工藝技術(shù)的成熟程度考慮，本研究選擇將石菖蒲油和冰片制備成β-CD包合物。β-CD的空腔大小適合包合揮發(fā)油這類相對(duì)分子質(zhì)量較小的成分，且成本較低。研磨法因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單，且包合率較高，在生產(chǎn)上被廣泛使用。正交試驗(yàn)結(jié)果說明優(yōu)化后的包合物制備方法簡(jiǎn)單可行、重復(fù)性好。

驚厥實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羚珠散在包合后能顯著延長(zhǎng)驚厥小鼠的存活時(shí)間，降低死亡率，且比未包合的組方抗驚厥效果更優(yōu)，為羚珠散包合工藝研究提供了理論基礎(chǔ)。石菖蒲油的抗癲癇作用在臨床上已有較多文獻(xiàn)報(bào)道。而石菖蒲油和冰片的“引藥上行”作用，也使得這兩味藥作為佐使藥，在治療癲癇時(shí)被廣泛配伍使用[6]。因此，這兩味藥在羚珠散的抗癲癇活性中起到重要作用。本研究初步驗(yàn)證了包合物的體內(nèi)抗驚厥活性，但關(guān)于其抗驚厥作用的分子機(jī)制及其在體外是否也有較好的抗驚厥作用等尚不清楚，需要更深入的研究。