紫草素抑制ERK1/2-NF-κB通路對大鼠心房顫動的改善作用

舒禮良，黃功成，郝爽，黃辰，朱效華，徐敬

鄭州大學第一附屬醫(yī)院心血管外科，鄭州 450052

心房顫動(簡稱房顫)是心臟疾病患者常見的一種臨床表現(xiàn)，目前其治療仍是世界難題[1-2]。心肌纖維化造成的心房重構(gòu)是導致房顫的主要原因之一[3]，可能成為房顫干預的重要切入點。紫草素(shikonin)是從紫草科植物紫草中提取的一種萘醌類化合物，具有多種藥理學作用，如抑制腫瘤細胞增殖、遷移和浸潤，減輕四氯化碳(CCl4)誘導的肝纖維化，以及博來霉素誘導的肺纖維化等[4-7]，但是否能改善大鼠房顫仍需進一步研究。本研究探討紫草素對大鼠心肌纖維化、房顫的影響，旨在為紫草素作為臨床治療房顫的藥物成分提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡健康清潔級雄性SD大鼠30只，體重180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2017-0011]。實驗過程符合國家和單位有關(guān)實驗動物管理和使用的規(guī)定。

1.2 試劑與儀器 紫草素(純度≥98%)、乙酰膽堿(ACh)、CaCl2購自美國Sigma-Aldrich公司；兔抗鼠膠原蛋白Ⅰ(Collagen Ⅰ，Col Ⅰ)、細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase 1/2，ERK1/2)、p-ERK1/2、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB) p65、p-NF-κB p65、GAPDH一抗購自英國Abcam公司；HRP標記的山羊抗兔二抗購自美國Sigma公司；蘇木精-伊紅(HE)試劑盒、Masson染色試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；TGL-16M高速離心機購自湖南長沙湘儀儀器廠；EN61010-1水平電泳儀購自美國Bio-Rad公司；電子心電圖機購自成都泰盟科技有限公司。

1.3 分組與處理 30只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后，隨機分為正常對照組、模型組、紫草素組，每組10只。紫草素組大鼠按照紫草素4 mg/kg(溶于0.2%DMSO)的劑量灌胃給藥[8]，正常對照組、模型組大鼠灌胃等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d；1周后，紫草素組和模型組大鼠按照1 ml/kg的劑量尾靜脈注射ACh-CaCl2混合液(66 μg ACh+10 mg/ml CaCl2溶于0.9%的NaCl)，1次/d，連續(xù)注射7 d，正常對照組大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水，7 d后取材進行下一步實驗。

1.4 心電圖數(shù)據(jù)采集 末次尾靜脈注射ACh-CaCl2混合液的同時，以1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，固定于鼠板上，電子心電圖機進行肢體導聯(lián)，記錄各組大鼠心電圖。模型組和紫草素組大鼠給藥后發(fā)生陣發(fā)性房顫，以出現(xiàn)f波及p波消失為發(fā)生房顫的標志，以f波消失及p波出現(xiàn)為房顫終止的標記[9]。記錄房顫的誘發(fā)時間和持續(xù)時間。

1.5 超聲心動圖檢測心功能 心電圖記錄完畢后，進行超聲心動圖檢測。大鼠胸部脫毛，采用彩色多普勒超聲診斷儀檢測各組大鼠左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室縮短分數(shù)(left ventricular fractional shortening，LVFS)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular endsystolic diameter，LVESD)、左心室傳張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)。

1.6 HE染色觀察心肌組織病理學變化 超聲心動圖檢測完成后，30只大鼠脫頸處死，剝離心臟，生理鹽水清洗后切取部分心房組織，保存于-196 ℃液氮中，用于蛋白提取。其余心房組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，脫水、包埋后做石蠟切片，每張切片的厚度為4 μm。嚴格按照試劑盒說明書進行HE染色，光學顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)。

1.7 Masson染色檢測心肌組織纖維化 石蠟切片經(jīng)60 ℃烤片30 min后，常規(guī)脫蠟，蘇木精染色5 min，酸性乙醇分化，酸性品紅溶液染色3 min，磷鉬酸染色10 min，苯胺藍溶液染色10 min，酸性乙醇分化，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片。待中性樹膠凝固后，光學顯微鏡下觀察大鼠心肌細胞間隙膠原沉積情況。每張切片隨機選取5個視野，采用Image J軟件測定每個視野藍染區(qū)域面積，計算膠原面積百分比。膠原面積百分比(%)=藍染區(qū)面積/整個視野面積×100%。

1.8 Western blotting檢測心肌組織中Col Ⅰ、p-ERK1/2、ERK1/2、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白表達水平 取出液氮中的心房組織，勻漿后，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入溴酚藍后煮沸使蛋白穩(wěn)定。每孔加入20 μl蛋白樣品，恒壓120 V電泳，待溴酚藍電泳至凝膠底部時，停止電泳。0.3 A恒流濕轉(zhuǎn)，2 h后結(jié)束(采用PVDF膜)。TBST洗膜5 min×3次，封閉1 h。加入Col Ⅰ、ERK1/2、NF-κB p65、p-ERK1/2、p-NF-κB p65和GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5 min×3次，加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜5 min×3次后ECL顯色。ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 紫草素對房顫的影響 正常對照組大鼠心電圖可見明顯p波，模型組和紫草素組大鼠尾靜脈注射ACh-CaCl2混合液后則出現(xiàn)典型房顫改變：f波出現(xiàn)，p波消失(圖1)。模型組房顫誘發(fā)時間和持續(xù)時間分別為(4.53±0.41) s、(6.83±0.72) s，與模型組比較，紫草素組房顫誘發(fā)時間[(7.57±0.58) s]明顯延長，持續(xù)時間[(3.82±0.81) s]明顯縮短(P＜0.05)。

圖1 正常及房顫大鼠心電圖表現(xiàn)Fig.1 The ECG of normal rats and typical atrial fibrillation rats

2.2 紫草素對房顫大鼠心功能的影響 超聲心動圖檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組及紫草素組LVEF、LVFS降低，LVESD、LVEDD增高(P＜0.05)；與模型組比較，紫草素組LVEF、LVFS升高，LVESD、LVEDD縮短(P＜0.05)，差異均有統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 各組超聲心動圖參數(shù)比較(±s, n=10)Tab.1 Comparison of echocardiographic parameters in each group of rats (±s, n=10)

表1 各組超聲心動圖參數(shù)比較(±s, n=10)Tab.1 Comparison of echocardiographic parameters in each group of rats (±s, n=10)

LVEF. 左心室射血分數(shù)；LVFS. 左心室縮短分數(shù)；LVESD. 左心室收縮末期內(nèi)經(jīng)；LVEDD. 左心室舒張末期內(nèi)經(jīng)；與正常對照組比較，(1)P＜0.05；與模型組比較，(2)P＜0.05。

組別 LVEF (%) LVFS (%) LVESD (mm) LVEDD (mm)正常對照組 69.73±8.22 45.13±6.54 3.29±0.61 6.34±0.77模型組 50.79±6.41(1) 25.09±5.23(1) 7.01±0.77(1) 9.71±0.84(1)紫草素組 61.40±5.06(1)(2) 36.51±5.00(1)(2) 4.15±0.52(1)(2) 7.15±0.78(1)(2)F 20.136 31.870 92.106 48.683 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 紫草素對房顫大鼠心肌細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響 HE染色結(jié)果顯示，正常對照組大鼠心肌細胞排列致密、整齊；模型組大鼠心肌細胞出現(xiàn)排列紊亂、肥大、細胞間隙增寬；紫草素組大鼠心肌細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)損傷程度較模型組有所改善(圖2)。

圖2 各組心肌細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的HE染色結(jié)果(×400)Fig.2 Myocardial cell morphology and structure of rats in each group (HE ×400)

2.4 紫草素對房顫大鼠心肌纖維化的影響 Masson染色結(jié)果顯示，與正常對照組(1.02%±0.11%)比較，模型組及紫草素組大鼠心肌組織膠原面積百分比(分別為3.57%±0.42%、2.33%±0.30%)均明顯增加(P＜0.05)；與模型組比較，紫草素組大鼠心肌組織膠原面積百分比減小(P＜0.05)(圖3)。

圖3 各組心肌組織Masson染色結(jié)果(×400)Fig.3 Myocardial tissue of rats in each group (Masson ×400)

2.5 紫草素對房顫大鼠心肌組織蛋白表達的影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組及紫草素組Col Ⅰ、p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達明顯升高(P＜0.05)；與模型組比較，紫草素組Col Ⅰ、p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達明顯降低(P＜0.05)；各組間ERK1/2、NF-κB p65蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(圖4)。

圖4 各組心肌組織蛋白表達情況(n=10)Fig.4 Protein expressions of myocardial tissue of rats in each group (n=10)

3 討 論

房顫是導致患者卒中發(fā)生率及病死率明顯增高的原因之一[10]。目前認為，房顫主要是由心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)、心房肌電重構(gòu)以及自主神經(jīng)失調(diào)引起，心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)包括心房肌細胞凋亡、心臟成纖維細胞增殖或炎癥等異常生理過程造成的細胞外基質(zhì)沉積導致的心房纖維化等改變。發(fā)生纖維化時，正常心肌細胞周圍包繞膠原纖維，心肌細胞間電傳導的連續(xù)性被破壞，導致心房相鄰肌束之間解偶聯(lián)，局部電傳導被阻滯，傳導異質(zhì)性增強，且傳導速度減慢，電傳導在心房內(nèi)形成折返環(huán)，從而引發(fā)房顫[11]。因此，心肌纖維化可能是房顫治療的一個潛在關(guān)鍵因素和生物標志物[12-13]。紫草素在抑制炎癥反應(yīng)和纖維化中的作用已有報道，但紫草素能否減輕房顫模型大鼠心肌纖維化，改善心功能尚需進一步研究。因此，本研究探討了紫草素對ACh-CaCl2混合液引起的房顫大鼠的保護作用及其可能的機制。

ACh作用于心房肌膽堿能M型受體，激活ACh依賴性K+通道，K+外流增加，使心房肌細胞快速復極，動作電位時長和有效不應(yīng)期縮短，致使房顫持續(xù)時間延長。心肌細胞外Ca2+濃度增加，使心肌細胞膜上鈣通道關(guān)閉，而L型鈣通道在動作電位平臺期可將Ca2+由膜外轉(zhuǎn)至膜內(nèi)，一旦鈣通道關(guān)閉將導致Ca2+內(nèi)流減少，心房肌細胞動作電位除極緩慢，則可促發(fā)房顫。因此，本研究采用ACh-CaCl2混合液尾靜脈注射建立房顫大鼠模型，然后通過灌胃給藥研究紫草素對房顫的影響。心電圖結(jié)果顯示，與模型組比較，紫草素治療后f波出現(xiàn)時間延長，持續(xù)時間縮短。超聲心動圖檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組LVEF、LVFS降低，LVESD、LVEDD增高，大鼠心功能嚴重損傷；與模型組比較，紫草素組LVEF、LVFS升高，LVESD、LVEDD降低，心功能改善，提示大鼠發(fā)生房顫時，心肌細胞損傷嚴重，心肌組織出現(xiàn)明顯纖維化，而紫草素治療后可明顯減輕心肌細胞損傷，并抑制心肌纖維化，與季佳文等[14]的研究結(jié)果一致。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，紫草素可抑制多種臟器如肝臟[15]、腎臟[16]等的纖維化。因此，紫草素可能通過抑制心肌纖維化而改善房顫大鼠的心電功能。

NF-κB是一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，參與了大鼠心肌細胞凋亡、脂多糖誘導的炎癥反應(yīng)、腫瘤細胞增殖及遷移等多種下游基因的調(diào)控，與多種疾病的發(fā)展過程有關(guān)[17-19]。NF-κB家族由P50、P52、P65、c-Rel和ReIB 5個成員組成，其中P65是NF-κB家族中主要的轉(zhuǎn)錄因子，在腎臟、肝臟、肺臟等器官的纖維化中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[20-21]。ERK1/2-NF-κB信號通路在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過程中具有重要作用，李霞等[22]發(fā)現(xiàn)，復方鉤藤降壓片可通過抑制NF-κB信號通路降低自發(fā)性高血壓大鼠的炎癥反應(yīng)。姜京植等[23]發(fā)現(xiàn)，葫蘆素E可通過抑制ERK1/2-NF-κB信號通路發(fā)揮抑炎作用，從而減輕哮喘小鼠的氣道炎癥。在外界因素刺激下，ERK1/2被激活發(fā)生磷酸化，而磷酸化的ERK1/2作用于NF-κB，使NF-κB二聚體解體并發(fā)生磷酸化后從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位入細胞核，進一步介導炎癥反應(yīng)。李小兵等[24]發(fā)現(xiàn)，房顫大鼠心肌組織中ERK1/2-NF-κB信號通路被激活，炎性細胞浸潤，炎性因子升高，心肌細胞外膠原沉積。心肌細胞外大量膠原沉積造成心肌纖維化，而心肌纖維化可破壞心房組織的結(jié)構(gòu)和功能，導致房顫的發(fā)生發(fā)展。適量的炎性因子可促進心肌成纖維細胞增殖并合成膠原，有利于壞死組織修復，但炎性因子的持續(xù)分泌則可開啟并放大炎癥反應(yīng)級聯(lián)效應(yīng)，合成大量膠原并沉積，最終導致心肌纖維化。Wang等[25]發(fā)現(xiàn)，紫草素抑制ERK/NF-κB信號通路可減輕過敏性氣道重塑。Yang等[26]發(fā)現(xiàn)，紫草素可通過抑制NF-κB信號通路在脂多糖誘導的乳腺炎中發(fā)揮抗炎作用。本研究通過紫草素灌胃治療房顫模型大鼠，并采用Western blotting檢測ERK1/2-NF-κB信號通路相關(guān)蛋白及纖維化標志性膠原蛋白Col Ⅰ的表達，結(jié)果顯示，房顫大鼠心房組織中Col Ⅰ、p-ERK1/2及p-NF-κB p65蛋白表達水平升高，而紫草素治療后，大鼠心房組織中Col Ⅰ、p-ERK1/2及p-NF-κB p65蛋白表達水平降低，提示紫草素可通過抑制ERK1/2-NF-κB p65信號通路減少細胞外膠原沉積，減輕心肌纖維化，改善房顫大鼠的心功能。

綜上所述，紫草素可通過抑制ERK1/2-NF-κB信號通路減輕心肌纖維化，抑制房顫的發(fā)生，并改善心功能。但本研究仍存在一些不足之處：纖維化是一個多因素網(wǎng)格化相互作用的過程，本研究僅探討了ERK1/2-NF-κB信號通路在此過程中的作用；此外本研究缺乏ERK1/2-NF-κB信號通路激活引起纖維化后加重房顫的直接證據(jù)。本研究為臨床治療房顫提供了新的思路和方向，但后續(xù)仍需進一步探討更具體、全面的作用機制。