移植BMSC來源的Leydig樣細胞對DEHP損傷小鼠睪丸功能的修復(fù)作用及其機制

康永明，方琨，宋攀，楊璐辰，劉正歡，王臨春，史率克，董強*

1四川大學華西醫(yī)院泌尿外科，成都 610041；2四川遂寧市中心醫(yī)院泌尿外科，四川遂寧 627000

鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯[di(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP]是塑料制品生產(chǎn)中常用的增塑劑[1]，廣泛存在于人類接觸物中，如包裝袋、醫(yī)療器械及裝修材料等[2-3]。DEHP經(jīng)接觸、攝入或吸入等途徑進入體內(nèi)，對人類和動物的激素合成、分泌及代謝產(chǎn)生影響[4-5]。睪酮是一種主要由睪丸產(chǎn)生的類固醇激素，由睪丸間質(zhì)細胞(Leydig細胞)合成并分泌[6]。DEHP可損傷雄性生殖系統(tǒng)的主要靶器官睪丸[7]，使睪酮分泌降低。研究發(fā)現(xiàn)，DEHP可誘導肝細胞[8]、卵巢顆粒細胞[9]及精母細胞[10]等發(fā)生凋亡。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，DEHP可誘導睪丸組織發(fā)生氧化應(yīng)激，當活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)基團產(chǎn)生蓄積時，細胞器受到破壞后功能受損，可影響溶酶體活性，最終導致細胞死亡[11]。目前，雄激素低下的治療常采用外源性睪酮補充、干細胞移植及Leydig細胞移植等方法[12-14]，可促進受損睪丸功能的恢復(fù)[15]，但存在不符合睪酮生理節(jié)律需求、種子細胞來源不足、排異反應(yīng)及倫理等相關(guān)問題。本課題組對DEHP損傷Leydig細胞功能的機制進行了探索[16]，并在體外實驗中成功誘導骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)向Leydig樣細胞分化[17-18]。此類細胞具有表面突起、胞質(zhì)豐富、核仁清晰的特征，且具備分泌睪酮的功能。本研究旨在通過移植BMSCs來源的Leydig樣細胞，探討其對DHEP受損睪丸功能的修復(fù)作用及相關(guān)機制，以期為細胞移植治療雄激素低下提供新的選擇并奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 33只4周齡清潔級健康雄性C57小鼠(合格證號：202008224)，體重10～20 g，平均15 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于四川大學華西科技園動物實驗中心。實驗過程符合國家及單位有關(guān)動物管理和使用的規(guī)定。

1.2 DEHP損傷C57小鼠模型建立及指標檢測 將6只青春期C57小鼠適應(yīng)環(huán)境1周，隨機分為DEHP組與對照組，按10 ml/(kg.d)計算玉米油灌胃量，DEHP組選用DEHP[900 mg/(kg.d)試劑溶解于玉米油中]灌胃[16]，對照組則以等量玉米油灌胃，共4周。灌胃結(jié)束后獲取小鼠眶靜脈血行血清睪酮檢測；獲取雙側(cè)睪丸，行HE及TUNEL染色以了解睪丸組織病理變化；ELISA檢測睪丸組織中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性；Western blotting檢測睪丸組織中caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax及Bcl-2蛋白表達情況。

1.3 C57染毒小鼠分組及細胞移植 將27只4周齡C57小鼠給予DEHP[900 mg/(kg.d)]喂養(yǎng)4周。使用Percoll液分離法及全骨髓貼壁法提取并純化小鼠BMSCs，對提取的BMSCs進行鑒定后，體外誘導BMSCs分化為Leydig樣細胞并鑒定其功能。隨機將DEHP染毒小鼠分為Leydig樣細胞移植組(注射BMSC來源的Leydig樣細胞懸液)、BMSC移植組(注射第3代BMSCs細胞懸液)及對照組(注射等量生理鹽水)，每組9只。調(diào)整Leydig樣細胞及BMSCs的密度為1×106/ml；麻醉下陰囊皮膚消毒，使用微量注射器吸取細胞懸液，每側(cè)睪丸直接注射細胞懸液0.2 ml。細胞移植完成后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 移植后睪酮、凋亡蛋白及氧化應(yīng)激指標檢測

在移植后7、14、21 d獲取小鼠眶靜脈血進行血清睪酮測定。獲取雙側(cè)睪丸，行ELISA檢測MDA、GSH含量及SOD、GSH-Px活性。獲取移植后7 d的睪丸行HE、TUNEL染色觀察小鼠睪丸生精小管及細胞凋亡情況，睪丸勻漿后采用Western blotting檢測caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax及Bcl-2蛋白的表達情況。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，血清睪酮、凋亡蛋白、氧化應(yīng)激指標符合正態(tài)分布，DEHP組與對照組間比較采用t檢驗。細胞移植后Leydig樣細胞移植組、BMSC移植組及對照組的凋亡蛋白、氧化應(yīng)激指標符合正態(tài)分布，組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較時采用LSD-t檢驗；細胞移植后血清睪酮水平組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 C57小鼠DEHP染毒后睪酮、睪丸病理組織學、細胞凋亡及氧化應(yīng)激指標變化

2.1.1 血清睪酮變化情況 DEHP染毒組小鼠眶靜脈血清睪酮水平較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義[(0.508±0.087) ng/mlvs. (1.819±0.049) ng/ml，P＜0.01]。

2.1.2 睪丸病理組織學改變 HE染色結(jié)果顯示，對照組睪丸中未見空泡形成，曲細精管排列密集、層次清晰，曲細精管之間的Leydig細胞散在分布；DEHP染毒組睪丸組織中出現(xiàn)空泡，曲細精管膨脹、排列紊亂，可見生精細胞脫落，Leydig細胞呈團簇狀或瘤樣聚集(圖1)。

圖1 DEHP組與對照組小鼠睪丸組織病理學改變(HE染色)Fig.1 Testicular histopathology of mice in DEHP and control groups (HE staining)

2.1.3 睪丸組織細胞凋亡情況 TUNEL染色結(jié)果顯示，DEHP組睪丸組織可見部分細胞核呈碎塊狀，凋亡小體形成，呈細胞凋亡的特征性改變，對照組睪丸組織未見細胞核碎裂及凋亡小體(圖2)。

圖2 DEHP組與對照組小鼠睪丸組織TUNEL染色結(jié)果(×400)Fig.2 TUNEL staining of mouse testes in DEHP and control groups (×400)

2.1.4 DEHP對小鼠睪丸組織MDA、GSH-Px、SOD、GSH的影響 ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，DEHP組小鼠睪丸組織中MDA含量明顯增高(P＜0.01)，GSH含量明顯降低(P＜0.01)，SOD、GSH-Px活性亦明顯降低(P＜0.001，表1)。

表1 DEHP組與對照組小鼠睪丸組織MDA、GSH-Px、SOD、GSH比較(±s, n=3)Tab.1 Comparison of MDA, GSH-Px, SOD and GSH of mouse testes in DEHP and control groups (±s, n=3)

表1 DEHP組與對照組小鼠睪丸組織MDA、GSH-Px、SOD、GSH比較(±s, n=3)Tab.1 Comparison of MDA, GSH-Px, SOD and GSH of mouse testes in DEHP and control groups (±s, n=3)

DEHP. 鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯；MDA. 丙二醛；GSH-Px. 谷胱甘肽過氧化物酶；SOD. 超氧化物歧化酶；GSH. 谷胱甘肽

組別 GSH[μg/(mg prot)] MDA(nmol/mg) GSH-Px[U/(mg prot)] SOD[U/(mg prot)]對照組 80.659±1.894 1.158±0.075 19.301±0.460 125.168±3.675 DEHP組 31.954±1.988 8.053±0.339 6.116±0.178 59.132±1.538 t 28.71 30.72 46.34 34.40 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.1.5 DEHP對小鼠睪丸組織凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，DEHP組睪丸組織內(nèi)caspase-3、caspase-8、caspase-9及Bax蛋白表達水平升高，Bcl-2蛋白表達水平下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01，圖3)。

圖3 DEHP對小鼠睪丸組織凋亡相關(guān)蛋白表達的影響Fig.3 Effect of DEHP on apoptosis protein in mouse testes

2.2 細胞移植后檢測

2.2.1 血清睪酮水平測定 ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組及BMSC移植組比較，Leydig樣細胞移植組7、14、21 d時血清睪酮水平均明顯升高(P＜0.05)；而BMSC移植組則在14、21 d時睪酮水平明顯高于對照組(P＜0.05)(表2)。

表2 細胞移植后各組不同時間點血清睪酮水平比較(ng/ml, ±s, n=3)Tab.2 Comparison of serum testosterone levels in each group at different time points after cell transplantation (ng/ml, ±s, n=3)

表2 細胞移植后各組不同時間點血清睪酮水平比較(ng/ml, ±s, n=3)Tab.2 Comparison of serum testosterone levels in each group at different time points after cell transplantation (ng/ml, ±s, n=3)

與對照組比較，(1)P＜0.05；與BMSC移植組比較，(2)P＜0.05。

組別 7 d 14 d 21 d對照組 0.379±0.030 0.341±0.057 0.424±0.034 BMSC移植組 0.532±0.039 0.617±0.016(1) 0.677±0.012(1)Leydig樣細胞移植組 1.735±0.080(1)(2) 2.284±0.056(1)(2) 2.502±0.248(1)(2)

2.2.2 各組睪丸組織病理學改變 細胞移植后7 d，HE染色結(jié)果顯示，對照組中睪丸組織中可見空泡形成、曲細精管膨脹；Leydig樣細胞移植組與BMSC移植組的細胞形態(tài)恢復(fù)未見明顯差異，均可見生精細胞層數(shù)增多，排列規(guī)則，未見空泡，層次分明(圖4)。

圖4 細胞移植后7 d各組睪丸組織病理學改變(HE ×400)Fig.4 Pathological changes of testicular tissue 7 days after cell transplantation in each group (HE ×400)

2.2.3 睪丸組織細胞凋亡情況 細胞移植7 d后TUNEL染色結(jié)果顯示，與對照組(2.52%±0.56%)比較，Leydig樣細胞移植組(0.62%±0.10%)及BMSC移植組(0.91%±0.12%)細胞凋亡率均明顯降低(P＜0.01)，且Leydig樣細胞移植組細胞凋亡率較BMSC移植組更低(P＜0.01，圖5)。

圖5 移植后7 d各組睪丸組織細胞凋亡情況(TUNEL)Fig.5 Changes of testicular tissue apoptosis 7 days after transplantation (TUNEL)

2.2.4 細胞移植后小鼠睪丸組織氧化應(yīng)激指標比較

ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，移植后7、14、21 d，Leydig樣細胞移植組及BMSC移植組睪丸組織內(nèi)SOD、GSH-Px活性明顯增強，MDA含量明顯降低，細胞內(nèi)GSH含量明顯增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01或P＜0.05)；且與BMSC移植組比較，Leydig樣細胞移植組在各檢測時間點SOD、GSH-Px活性明顯增強，GSH含量明顯增高，MDA含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(圖6)。

圖6 移植后各組不同時間點睪丸組織氧化應(yīng)激指標比較Fig.6 Oxidative stress of testis tissue at different time points after cell transplantation in each group of mice

2.2.5 各組小鼠移植后睪丸組織中凋亡相關(guān)蛋白表達水平比較 細胞移植后7 d Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，Leydig樣細胞移植組睪丸內(nèi)caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax蛋白表達水平均明顯降低，Bcl-2蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05)；與對照組比較，BMSCs細胞移植組睪丸內(nèi)caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白表達水平均明顯降低，Bcl-2蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05)；而Leydig樣細胞移植組睪丸內(nèi)caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax蛋白表達水平明顯低于BMSCs細胞移植組，Bcl-2蛋白表達水平則明顯高于BMSCs細胞移植組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(圖7)。

圖7 移植后7 d各組小鼠睪丸組織中凋亡蛋白表達水平比較Fig.7 Apoptotic proteins of testes tissue 7 days after cell transplantation in each group of mice

3 討 論

隨著塑料制品等的廣泛使用，DEHP對環(huán)境的污染日益嚴重[19]。人和動物通過皮膚、消化、呼吸等方式接觸DEHP后可出現(xiàn)免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等的相關(guān)毒性反應(yīng)。雄性生殖系統(tǒng)的主要靶器官睪丸也受到了DEHP的影響[7]。睪丸的兩大主要功能是合成分泌雄激素和產(chǎn)生精子，其中Leydig細胞合成分泌雄性激素，生精細胞產(chǎn)生精子；而支持細胞為間質(zhì)細胞提供營養(yǎng)，調(diào)節(jié)精子產(chǎn)生并參與構(gòu)成血睪屏障，還可誘導免疫豁免，從而對精子發(fā)生和間質(zhì)細胞功能進行調(diào)控[20]。動物實驗表明，DEHP染毒后會損害雄性生殖系統(tǒng)的發(fā)育及功能，Radke等[19]及Skinner等[21]發(fā)現(xiàn)，孕期DEHP暴露后的第一代雄性仔鼠會出現(xiàn)隱睪，同時可能出現(xiàn)附睪損害、青春期發(fā)育延遲。Barakat等[22]發(fā)現(xiàn)，DEHP染毒后可出現(xiàn)精子數(shù)量減少、密度降低。Abdel-Maksoud等[23]發(fā)現(xiàn)，DEHP可導致大鼠睪丸發(fā)育異常，曲細精管膨脹，且睪丸系數(shù)與DEHP劑量存在相關(guān)性。多種因素和多個基因可調(diào)控睪丸間質(zhì)細胞凋亡，其中caspase通路在Leydig細胞凋亡中起重要作用[24]。線粒體、死亡受體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路均為caspase的活化途徑。線粒體通路的關(guān)鍵蛋白為caspase-9，對內(nèi)源性凋亡通路的激活起關(guān)鍵作用，最終引起一系列反應(yīng)而導致細胞凋亡[24]。Sun等[11]發(fā)現(xiàn)，小鼠DEHP染毒后睪丸組織內(nèi)caspase-3、caspase-8、Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，表明DEHP可誘導小鼠睪丸組織細胞出現(xiàn)凋亡。Ha等[25]發(fā)現(xiàn)，在DEHP干預(yù)下細胞Bax基因表達上調(diào)和Bcl-2基因表達下調(diào)，可加速支持細胞的凋亡。Sun等[11]發(fā)現(xiàn)，DEHP染毒后的精子細胞內(nèi)caspase-3、caspase-8及Bax蛋白水平明顯升高，Bcl-2蛋白水平明顯降低，提示精子細胞發(fā)生凋亡與DEHP染毒有關(guān)。本研究對C57小鼠進行DEHP染毒后，睪丸組織TUNEL染色結(jié)果顯示睪丸間質(zhì)細胞凋亡，且Western blotting檢測結(jié)果顯示睪丸組織中caspase-3、caspase-8、caspase-9及Bax蛋白水平明顯升高，Bcl-2蛋白水平明顯降低，提示DEHP染毒后睪丸組織細胞凋亡增加；此外，DEHP染毒后睪丸組織MDA含量明顯增加，GSH水平明顯降低，SOD、GSH-Px活性受到抑制，提示DEHP染毒后睪丸組織發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，血清睪酮水平降低，提示睪丸功能出現(xiàn)毒性損害，與多數(shù)學者的研究結(jié)果一致[11]。

目前，治療性腺功能減退癥主要通過藥物及細胞移植兩種途徑實現(xiàn)[26]。本研究通過移植BMSC來源的Leydig樣細胞至DEHP染毒C57小鼠睪丸內(nèi)，觀察睪丸功能修復(fù)情況，從組織細胞凋亡及氧化應(yīng)激的角度探討細胞移植后睪丸功能的修復(fù)機制。Peak等[27]指出BMSCs及脂肪組織來源干細胞(adipose-derived stem cells，ADSC)等移植到鼠睪丸內(nèi)可存活并表現(xiàn)出Leydig細胞功能。Yang等[15]在D-半乳糖衰老大鼠模型中注入脂肪來源間充質(zhì)干細胞，發(fā)現(xiàn)睪丸間質(zhì)細胞凋亡減少，睪酮分泌增加，提示ADSC可阻止ROS產(chǎn)生，并使睪丸間質(zhì)細胞凋亡減少。Wang等[28]發(fā)現(xiàn)，大劑量DEHP可使雄性SD大鼠血清促卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(luteinising hormone，LH)和睪酮水平下降，抑制GSH-Px及SOD活性，且使凋亡蛋白Bax、caspase-3的mRNA表達明顯升高。本研究通過移植BMSC來源的Leydig樣細胞至DEHP染毒小鼠睪丸，發(fā)現(xiàn)細胞移植后睪丸組織學上表現(xiàn)為生精細胞形態(tài)恢復(fù)，排列逐漸規(guī)則，TUNEL染色提示睪丸組織細胞凋亡減少；細胞移植后血清睪酮水平逐漸升高，細胞凋亡信號通路相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9及Bax表達水平明顯降低，而Bcl-2表達水平明顯升高，提示細胞移植后睪丸組織凋亡情況得到改善；此外，氧化應(yīng)激指標MDA含量降低，GSH含量升高，GSH-Px及SOD活性恢復(fù)，提示細胞移植后氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕。以上結(jié)果均提示BMSC來源的Leydig樣細胞移植能夠修復(fù)DEHP染毒小鼠睪丸功能，并減輕睪丸組織的凋亡及氧化應(yīng)激，下一步本課題組將繼續(xù)研究睪丸功能改變及修復(fù)的基因機制。

綜上所述，DEHP可引起青春期C57小鼠睪丸損傷，導致睪丸組織細胞凋亡增加，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強。BMSC來源的Leydig樣細胞作為一種新的Leydig細胞來源，移植至DEHP染毒C57小鼠睪丸后，可恢復(fù)睪丸的睪酮分泌功能，使睪丸組織細胞凋亡減少、氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕，并修復(fù)DEHP引起的睪丸損傷。因此，移植BMSC來源的Leydig樣細胞有望成為一種治療睪丸功能低下的新方法。