血涂片自動圖像掃描及識別系統(tǒng)在瘧疾檢測中的應(yīng)用

吳 健 陳 嘉 顏 杰 張建明（通信作者） 廣州國際旅行衛(wèi)生保健中心（廣東，廣州，510635）

鄧卓暉 裴福全 林榮幸 廣東省疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病研究所（廣東，廣州，511430）

瘧疾是嚴(yán)重危害人類健康的重要寄生蟲病，2020 年世界衛(wèi)生組織《瘧疾報告》［1］數(shù)據(jù)顯示2019年全球瘧疾感染病例2.29 億，死亡病例40.9 萬。

瘧疾預(yù)防的關(guān)鍵在于病例早發(fā)現(xiàn)、早治療。 隨著技術(shù)的不斷進步， 新的瘧疾檢測方法應(yīng)運而生，但也存在一定的局限性，相對而言人工顯微鏡檢查法成本低、準(zhǔn)確度高，可以進行蟲種鑒定，在瘧疾的診斷和治療中仍然有著不可替代的作用，一直是瘧疾診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”［2］。但是，顯微鏡檢查需要技術(shù)人員經(jīng)過專業(yè)的訓(xùn)練，積累長期的經(jīng)驗，具備純熟的技能，而且人工顯微鏡檢勞動強度大，技術(shù)人員易產(chǎn)生疲勞而導(dǎo)致檢測結(jié)果受到影響。 本項目應(yīng)用人工智能技術(shù)，開發(fā)可用于瘧原蟲血涂片自動掃描存儲圖像信息、自動識別瘧原蟲的自動圖像掃描和識別系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 瘧原蟲自動圖像掃描及識別系統(tǒng)（以下簡稱系統(tǒng)）

1.1.2 瘧原蟲陰性及陽性薄血膜涂片 收集2017-2020 年10 月期間廣東省疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病研究所保存的來源于廣東省內(nèi)瘧疾確診病例的薄血膜涂片434 張，包括陽性薄血膜392 張，陰性薄血膜42 張。 陽性薄血膜包含惡性瘧原蟲252 例、卵形瘧原蟲73 例、間日瘧原蟲51 例、三日瘧原蟲8例以及混合感染8 例。

1.2 方法

1.2.1 薄血膜涂片自動圖像采集 推片染色制作好的薄血膜涂片放置到專用玻片架上，在掃描區(qū)域滴加鏡油，玻片架每次可放5 張，設(shè)置相應(yīng)的掃描視野數(shù)，放入玻片架，啟動設(shè)備，自動進行圖像對焦、掃描和存儲。

1.2.2 薄血膜自動識別 系統(tǒng)利用人工智能軟件對所掃描的圖像進行自動識別，對判斷為瘧原蟲的圖像進行標(biāo)注， 包括不同發(fā)育時期的瘧原蟲形態(tài)（環(huán)狀體、滋養(yǎng)體、裂殖體、配子體），并根據(jù)判斷結(jié)果進行如下提示：

1）目標(biāo)物少，需人工審閱；

2）可確定為pf；

3）pf 可能性較大；

4）pv 或po 可能性較大；

5）無提示。

其中，提示第2）至4）即可判斷為鏡檢陽性。

（注：pf 指惡性瘧原蟲，pv 指間日瘧原蟲，po 指卵形瘧原蟲，pm 指三日瘧原蟲）

1.2.3 人工閱片

1.2.3.1 人工鏡下閱片： 由閱片經(jīng)驗豐富的專業(yè)技術(shù)人員按照常規(guī)方法進行人工鏡下閱片，判斷是否感染瘧原蟲及所感染瘧原蟲種類。

1.2.3.2 圖像人工審閱 調(diào)取系統(tǒng)自動采集的每個薄血膜視野的圖像信息進行人工審閱，首先審閱系統(tǒng)標(biāo)注且顯示出的瘧原蟲形態(tài)，其次逐個審閱系統(tǒng)拍攝的每個視野圖像信息，綜合驗證系統(tǒng)對瘧原蟲檢測的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 閱片數(shù)量及無效原因

人工及系統(tǒng)分別閱片434 張，其中有效薄血膜涂片308 張，無效薄血膜涂片126 張。 無效的原因主要為血涂片本身質(zhì)量問題， 最多見的是溶血，其次是薄血膜厚薄不均勻、染色過深造成染料團塊沉積或過淺細(xì)胞未著色、雜質(zhì)過多、甲醇不純，細(xì)胞固定不佳、樣本保存不當(dāng)，薄血膜劃痕較多等。

2.2 系統(tǒng)自動掃描時間

經(jīng)統(tǒng)計，系統(tǒng)自動掃描時間為每張薄血膜涂片掃描500 個視野用時6min， 掃描1000 個視野用時9min。 系統(tǒng)自動掃描時間包含了薄血膜涂片自動圖像采集和薄血膜自動識別時間。

人工鏡下閱片時間根據(jù)薄血膜中瘧原蟲的密度、分布范圍、感染情況而有所不同，每張薄血膜涂片閱片時間可在3-30min 不等。

2.3 系統(tǒng)對瘧原蟲識別的準(zhǔn)確性

以人工鏡下閱片的診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)置系統(tǒng)每張薄血膜自動掃描500 個視野，并對識別出的瘧原蟲蟲體形態(tài)進行標(biāo)注，人工審閱系統(tǒng)標(biāo)注的陽性圖像，認(rèn)為所有的標(biāo)注中，只要出現(xiàn)一個標(biāo)注是瘧原蟲即視為陽性，比較人工鏡下閱片與系統(tǒng)閱片的結(jié)果，見表1。

表1 人工鏡下閱片與系統(tǒng)閱片結(jié)果比較

經(jīng)卡方檢驗，人工鏡下閱片與系統(tǒng)閱片兩種方式對瘧原蟲陽性涂片檢出結(jié)果一致，兩種閱片方式檢出結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異（Χ2=198.31，P=0.258），系統(tǒng)閱片對瘧原蟲陽性涂片的檢出率為96.3%。

圖1 拍攝20×25 共500 個視野的總覽，“點擊獲取實時識別信息”可看到四種標(biāo)注形態(tài)。

圖1 鏡下標(biāo)記瘧原蟲圖像

圖2 為惡性瘧原蟲環(huán)狀體，系統(tǒng)對拍攝到的視野進行識別，自動標(biāo)注出環(huán)狀體形態(tài)，以左側(cè)小圖顯示，點擊小圖可顯示大圖，如右側(cè)圖，紅框處為該環(huán)狀體。 系統(tǒng)支持回到該視野功能，點擊“回到”可返回視野位置，通過顯微鏡人工觀察。

圖2 鏡下標(biāo)標(biāo)球狀體及放大圖

2.4 系統(tǒng)對瘧原蟲蟲種識別的準(zhǔn)確性

結(jié)果見表2。經(jīng)卡方檢驗，系統(tǒng)對不同種類瘧原蟲的蟲種鑒定能力有統(tǒng)計學(xué)差異 （Χ2=14.328，P<0.001）， 其中對惡性瘧原蟲的識別和蟲種鑒定能力最強，鑒定正確率可達到90.9%。

表2 系統(tǒng)對瘧原蟲蟲種的識別結(jié)果

2.5 不同掃描視野數(shù)的檢測結(jié)果

取低密度（密度小于1000/μL）瘧原蟲陽性薄血膜22 張，陰性薄血膜10 張，分別進行500 視野/片和1000 視野/片掃描，結(jié)果如表3。

表3 不同掃描視野數(shù)的檢測結(jié)果

經(jīng)卡方檢驗， 進行500 和1000 視野/片兩種不同視野數(shù)的掃描時，瘧原蟲的陽性檢出率無統(tǒng)計學(xué)差異（Χ2=54.824，P=0.657）。

3 討論

隨著計算機技術(shù)的發(fā)展，借助其快速、自動的優(yōu)勢，結(jié)合數(shù)字圖像處理和模式識別的自動識別研究正成為病原學(xué)臨床輔助診斷的新興方向。 自動圖像識別系統(tǒng)是將傳統(tǒng)的人工識別與計算機圖像處理及模式識別相結(jié)合的技術(shù)，通過采集大量圖像信息，對目標(biāo)圖像的顏色、紋理、形狀、染色特性等圖像特征進行自動提取和分析，根據(jù)人工智能算法進行數(shù)據(jù)處理形成的一套識別系統(tǒng)，可實現(xiàn)對各類病原體鏡下圖像的自動分類識別。 在寄生蟲卵、抗酸桿菌等的臨床輔助診斷方面已有初步應(yīng)用［3-4］。

瘧原蟲的自動圖像識別系統(tǒng)通過自動而快速地識別被瘧原蟲感染的細(xì)胞并鑒定所感染的瘧原蟲種類，在人力條件不允許的情況下，可以及時有效地檢出瘧疾病例，極大減少瘧疾診斷對技術(shù)人員的依賴，有利于有效控制瘧疾傳播，對瘧疾防控具有重要意義。 國外學(xué)者較早開展了相關(guān)研究，其研究表明通過利用專門的圖像處理和模式識別算法對顯微圖像進行自動處理是一種可行的自動化診斷方法［5-8］。 國內(nèi)，殷竹君等較早對100 張瘧原蟲血液涂片進行識別簽定，總體識別率達90%［9］。

本研究通過對大量即往瘧疾病例的薄血膜圖像掃描，分析提取其不同蟲種、蟲種不同生活周期的形態(tài)特征，應(yīng)用人工智能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的自我學(xué)習(xí)功能，建立起一套瘧原蟲自動識別系統(tǒng)。

從檢測結(jié)果可以看出，自動識別系統(tǒng)可以較為準(zhǔn)確地抓取到瘧原蟲的各類圖像，其陽性檢出率可達到96.3%；從瘧原蟲蟲種識別情況看，系統(tǒng)對各種瘧原蟲的辨識能力各不相同，其中以對惡性瘧原蟲的蟲種鑒定能力最強，可以達到90%左右，但是對于間日瘧、卵形瘧、三日瘧、混合感染的鑒定能力不足，分析原因可能因為：惡性瘧原蟲感染在全球范圍內(nèi)都占絕大多數(shù)（90%以上），卵形瘧、間日瘧及三日瘧感染病例數(shù)占比很少，尤其三日瘧，因此能夠獲得的陽性涂片數(shù)量不足，可供系統(tǒng)學(xué)習(xí)的圖像數(shù)量有限。

因為薄血膜中的瘧原蟲蟲體形態(tài)特征明顯，易于識別和分辨， 而在厚血膜中形態(tài)特征不明顯，且因溶血而缺少了血細(xì)胞的參照， 更給識別增加難度，因此本研究主要針對薄血膜進行，國內(nèi)外的研究也多是如此。 但Kaewkamnerd 等［10］也曾報道針對厚血膜開發(fā)的瘧原蟲自動識別軟件，主要利用惡性瘧原蟲與間日瘧原蟲染色質(zhì)的大小進行區(qū)分，結(jié)果其間日瘧鑒定準(zhǔn)確性為75%，惡性瘧鑒定準(zhǔn)確性則可達到90%。

如何減少因薄血膜靈敏度低而造成的假陰性，尤其是血涂片中瘧原蟲密度低時（<1000/μL），是需要思考和解決的問題。 我們選取部分密度較低的血涂片，分別進行500 視野與1000 視野的掃描，結(jié)果表明在增加掃描視野后， 檢出陽性率略有提高，但是經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果不具有顯著性差異，但不排除掃描視野數(shù)再增加后可能發(fā)生的變化。

在對大量血涂片的圖像掃描研究中發(fā)現(xiàn)，不同實驗室的血涂片質(zhì)量參差不齊，所采用的染色方法也存在瑞氏染色和姬姆薩染色兩種不同，為圖像自動識別帶來不便。 前期血涂片制備的標(biāo)準(zhǔn)化可明顯改善圖像的質(zhì)量，提高圖像識別的敏感性、準(zhǔn)確性，因此集合制片、染片和圖像掃描于一體的自動化標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)備是本項目后續(xù)的研究方向。