基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS的湖南新冠2號方的化學(xué)成分研究

向鋒 周宜 廖小娟 鄒菊英 王竹鑫

〔摘要〕 目的 建立湖南新冠2號方的超高效液相色譜串聯(lián)四級桿軌道阱質(zhì)譜（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）定性分析方法，系統(tǒng)闡明湖南新冠2號方中的化學(xué)成分。方法 使用ACQUITY UPLC[R][○] BEH C18色譜柱（2.1 mm × 100 mm， 1.7 μm），以0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）為流動相，梯度洗脫，流速0.3 mL/min，柱溫 35 ℃，進(jìn)樣量 2 μL，采用電噴霧離子源，在Full Scan MS/dd-MS2掃描模式下采集數(shù)據(jù)。結(jié)果 通過分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)、查閱相關(guān)文獻(xiàn)以及參考相關(guān)數(shù)據(jù)庫，從湖南新冠2號方中共鑒定出64個化學(xué)成分，其中包括34個黃酮類化合物、10個有機(jī)酚酸類化合物、10個三萜類化合物、3個環(huán)烯醚萜苷類、3個核苷類、2個氨基酸類化合物和2個脂肪酸類。結(jié)論 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術(shù)可全面快速分析湖南新冠2號方中的化學(xué)成分，為進(jìn)一步研究湖南新冠2號方抗新型冠狀病毒肺炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制提供一定的理論依據(jù)。

〔關(guān)鍵詞〕 湖南新冠2號方;新型冠狀病毒肺炎;超高效液相色譜串聯(lián)四級桿軌道阱質(zhì)譜;化學(xué)成分;黃酮

〔中圖分類號〕R284.1? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.09.001

Study on Chemical Constituents of Hunan No.2 Prescription of COVID-19 Based on

UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS

XIANG Feng， ZHOU Yi， LIAO Xiaojuan， ZOU Juying， WANG Zhuxin*

（The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China）

〔Abstract〕 Objective To establish a qualitative analysis method of Hunan No.2 Prescription of COVID-19 by ultra high performance liquid chromatography tandem four stage rod orbital trap mass spectrometry （UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）， and to systematically elucidate the chemical constituents of Hunan No.2 Prescription of COVID-19. Methods The ACQUITY UPLC[R][○] BEH C18 chromatographic column （2.1 mm × 100 mm， 1.7 μm） was used with 0.1% formic acid in water （A）-acetonitrile （B） as mobile phase for gradient elution. The volume flow rated was 0.3 mL/min， the column temperature was 35 ℃， and the injection volume was 2 μL. The data were collected by electrospray ionization in Full Scan MS/dd-MS2 scan mode. Results A total of 64 chemical constituents were identified from Hunan No.2 Prescription of COVID-19 by analyzing mass spectrometry data， consulting related literatures and referring to related databases， including 34 flavonoids， 10 organic phenolic acids， 10 triterpenoids， 3 iridoid glycosides， 3 nucleosides， 2 amino acids and 2 fatty acids. Conclusion UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS technology can comprehensively and quickly analyze the chemical constituents of Hunan No.2 Prescription of COVID-19， which provided a certain theoretical basis for further research on the pharmacological substance basis and quality control of Hunan No.2 Prescription of COVID-19 against COVID-19.

〔Keywords〕 Hunan No.2 Prescription of COVID-19; COVID-19; UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS; chemical constituents; flavonoids

由新型冠狀病毒引起的肺炎正肆虐全球，嚴(yán)重危害各國人民的身心健康、社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展及醫(yī)療公共衛(wèi)生系統(tǒng)，人類社會面臨著前所未有的危機(jī)。自疫情爆發(fā)以來，國內(nèi)外許多藥企和科研單位還沒有研發(fā)出用于治療新型冠狀病毒肺炎（corona virus

disease 2019， COVID-19）的特效藥，但中醫(yī)藥在阻斷新冠肺炎病情進(jìn)展、縮短病程、提高臨床療效等方面發(fā)揮了重要作用，為了充分發(fā)揮中醫(yī)藥的特色優(yōu)勢，各省市相繼推出了中藥預(yù)防方劑，得到了許多專家及權(quán)威人士的認(rèn)可與肯定[1-2]。2020年2月10日，湖南省中醫(yī)藥管理局公布推廣2個中藥預(yù)防新冠肺炎處方，處方由多位醫(yī)學(xué)藥學(xué)專家經(jīng)過反復(fù)分析論證制定，供全省機(jī)關(guān)、企事業(yè)單位、大專院校、中小學(xué)預(yù)防使用，其中湖南新冠2號方為體虛易感冒者、老年人、兒童的預(yù)防用藥，處方由黃芪、山銀花、陳皮、大棗、甘草5味常見中藥組成[3]。趙譚軍等[4]應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究湖南新冠2號方通過增強(qiáng)機(jī)體免疫力防治COVID-19感染的作用與機(jī)制，為老年人、兒童和免疫力低下者使用中醫(yī)藥方法防治COVID-19 感染提供理論依據(jù)。然而，作為湖南省預(yù)防COVID-19的防疫預(yù)防藥方，湖南新冠2號方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。

明確中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是推動和實(shí)現(xiàn)中藥復(fù)方制劑現(xiàn)代化的關(guān)鍵和核心[5]。近年來，單味中藥的化學(xué)成分已有較多報道，但中藥復(fù)方因其成分復(fù)雜、類別多樣等特點(diǎn)，其成分分離及鑒定具有一定的難度，關(guān)于湖南新冠2號方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究尚無報道，因此，全面系統(tǒng)地分析湖南新冠2號方的化學(xué)成分對于明確其活性成分、作用機(jī)制以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究具有重要意義。本研究首次采用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿軌道阱質(zhì)譜（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）技術(shù)對中藥復(fù)方湖南新冠2號方中的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，以為其質(zhì)量控制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料

Thermo Q-Exactive Focus四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、Dionex UltiMate 3000戴安高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）;PL203電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）;RE-5023旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;Mighty-10超純水機(jī)（上海礫鼎水處理設(shè)備有限公司）。

黃芪（批號200601）、山銀花（批號200207）、陳皮（批號200501）、大棗（批號200402）、甘草（批號200207）均購自湖南新匯制藥股份有限公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院王竹鑫主任藥師鑒定為合格藥材;對照品綠原酸（批號110753-201314）、柚皮苷（批號110722-200610）、咖啡酸（批號110885-201703）、異槲皮苷（批號111908-201804）、甘草苷（批號111610-201607）均購自中國食品藥品檢定研究院，甘草酸（批號1405-86-3）購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司;甘草素（批號PB0840-0005GM）購自成都普思生物科技股份有限公司;蘆?。ㄅ?153-18-4）購自北京盛世康普化工技術(shù)研究所，純度均大于98%;甲醇、乙腈（Macklin公司）、甲酸（賽默飛世爾科技有限公司）均為色譜純。

2 方法

2.1? 供試品溶液制備

按原方黃芪30 g、山銀花15 g、陳皮9 g、大棗5枚、甘草7 g稱取藥材，配比10倍量水煎煮3次，每次煎煮1 h，過濾，合并濾液，濃縮至一定體積，精密移取 1 mL至 50 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液，置于4 ℃冰箱中保存。

2.2? 對照品溶液制備

取各標(biāo)準(zhǔn)品2 mg，置于10 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶解定容至刻度，配制成濃度為200 μg/mL的對照品儲備液，-20 ℃冰箱中保持備用。檢測前精密移取1 mL于10 mL容量瓶中，加入50%甲醇將對照品儲備液稀釋10倍，取適量溶液過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3? 色譜條件

ACQUITY UPLC[R][○] BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm， 1.7 μm），流動相A為0.1%甲酸水，B為乙腈，梯度洗脫條件為：（0～22 min， 2%～50% B; 22～25 min， 50%～95% B; 25～27 min， 95% B; 27～27.1 min， 95%～2% B; 27.1～30 min， 2% B），流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量2 μL。

2.4? 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI）;正、負(fù)離子模式下掃描，掃描模式為Full Scan MS/dd-MS2;質(zhì)量掃描范圍為100～1 200 m/z;分辨率為35 000;噴霧電壓為3.0 kV;鞘氣流速為30 arb;輔助氣流速為10 arb;毛細(xì)管溫度為320 ℃;S-lens RF為50。

3 結(jié)果與分析

3.1? 湖南新冠2號方中化學(xué)成分的鑒定

取供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件和“2.4”項(xiàng)質(zhì)譜條件下對湖南新冠2號方進(jìn)行分析，使用Thermo Xcalibur 4.0軟件對湖南新冠2號方的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到湖南新冠2號方在正離子和負(fù)離子模式下的總離子流圖。見圖1。

根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰提供的相對分子質(zhì)量，使用Xcalibur軟件計算其分子式，選擇理論值與實(shí)測值的偏差小于10 ppm的分子式，并根據(jù)從二級質(zhì)譜圖中獲得的化合物相應(yīng)的碎片離子信息，分析化合物的裂解情況，然后結(jié)合參考文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)庫以及對照品裂解規(guī)律進(jìn)一步推測核實(shí)湖南新冠2號方中的化學(xué)成分。從湖南新冠2號方中共鑒定和推斷出64個化學(xué)成分，其中包括34個黃酮類化合物、10個有機(jī)酚酸類化合物、10個三萜類化合物、3個環(huán)烯醚萜苷類、3個核苷類、2個氨基酸類化合物和2個脂肪酸類。結(jié)果見表1。

3.2? 各類化學(xué)成分的鑒定及裂解特點(diǎn)

3.2.1? 黃酮類化合物的鑒定及裂解特點(diǎn)? 本實(shí)驗(yàn)共鑒定了34個黃酮類化合物，是湖南新冠2號方中檢出最多的一類化學(xué)成分。研究[11-12]發(fā)現(xiàn)此類化合物的質(zhì)譜有一定的結(jié)構(gòu)專屬性，黃酮苷類化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)主要是與葡萄糖、蕓香糖等糖基縮合形成氧苷，在質(zhì)譜高能碰撞下發(fā)生苷鍵的斷裂，丟失糖基，生成高豐度的黃酮苷元碎片;黃酮苷元主要裂解方式有C環(huán)發(fā)生RDA裂解以及CO、CO2、H2O、C2H2O等中性小分子的丟失，含有甲氧基的苷元還會發(fā)生CH3的丟失。黃酮類化合物C環(huán)斷裂后形成的含有完整A環(huán)和B環(huán)的碎片離子對該類化合物的鑒定具有重要參考價值。以化合物22為例進(jìn)行分析，該化合物在負(fù)離子模式下產(chǎn)生 m/z 417.117 1 [M-H]-的分子離子峰，使用Xcalibur軟件計算其分子式為C21H22O9，該化合物在二級質(zhì)譜圖中丟失一分子葡萄糖得到高豐度的碎片離子m/z 255，該碎片為甘草苷的苷元碎片離子;隨后苷元碎片離子通過RDA裂解形成含有A環(huán)的碎片離子m/z 135和含有B環(huán)的碎片離子m/z 119;m/z 135和m/z 119是判斷該化合物為黃酮類成分的特征性碎片。通過分析該化合物的相對分子質(zhì)量、裂解途徑，參考對照品以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)[13-14]，確定化合物22為甘草苷，其裂解途徑見圖2。

化合物38在負(fù)離子模式下產(chǎn)生609.146 1 [M-H]-的分子離子峰，使用Xcalibur軟件計算其分子式為C27H30O16，該化合物在質(zhì)譜高能碰撞下先丟失一分子蕓香糖基，二級質(zhì)譜圖中出現(xiàn)高豐度的苷元母核離子m/z 301和m/z 300，隨后母核離子繼續(xù)裂解出現(xiàn)m/z 273、271、255、179、151等碎片離子峰。結(jié)合相對分子質(zhì)量、裂解途徑，參考對照品以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)[15]，確定該化合物為蘆丁。

3.2.2? 有機(jī)酸類化合物的鑒定及裂解特點(diǎn)? 本實(shí)驗(yàn)共鑒定了10個有機(jī)酸類化合物，該類化合物在負(fù)離子模式下能產(chǎn)生較高豐度的準(zhǔn)分子離子峰，因其結(jié)構(gòu)中含有羧基、羥基等特征基團(tuán)，該類化合物在質(zhì)譜高能碰撞下容易丟失CO2、H2O等小分子[15-17]，湖南新冠2號方中的有機(jī)酸類成分主要包括苯丙素類化合物和苯甲酸類化合物。以化合物9為例，該化合物負(fù)離子模式下產(chǎn)生353.085 8 [M-H]-的分子離子峰，由精確相對分子質(zhì)量推測其分子式為C16H28O9，其二級質(zhì)譜圖出現(xiàn)高豐度的離子峰m/z 191，該碎片離子為綠原酸在質(zhì)譜高能碰撞下酯鍵斷裂得到一分子奎尼酸，隨后奎尼酸脫水失去一分子H2O形成碎片離子m/z 173;同時二級質(zhì)譜圖中也出現(xiàn)m/z 179，該離子峰為酯鍵斷裂得到一分子咖啡酸，然后咖啡酸脫羧失去一分子CO2得到碎片離子m/z 135。結(jié)合相對分子質(zhì)量、裂解途徑，參考對照品以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)，確定化合物9為綠原酸[18-19]，其質(zhì)譜裂解途徑見圖3。

3.2.3? 三萜類化合物的鑒定及裂解特點(diǎn)? 本實(shí)驗(yàn)共鑒定了10個齊墩果烷型五環(huán)三萜，均為甘草酸類衍生物，此類化合物在質(zhì)譜高能碰撞下苷鍵容易斷裂，生成苷元碎片和糖基碎片，隨后苷元發(fā)生RDA裂解，出現(xiàn)大量低豐度含A、B環(huán)和D、E環(huán)的碎片離子峰，糖基則易發(fā)生連續(xù)的脫水、脫羧，形成高豐度的碎片離子峰。此類成分在負(fù)離子模式下的二級裂解數(shù)據(jù)以糖基的裂解碎片為主，而在正離子模式下的二級裂解數(shù)據(jù)以苷元的裂解碎片為主。

以甘草酸為例，該化合物在負(fù)離子模式下產(chǎn)生821.393 6[M-H]-的分子離子峰，由精確相對分子質(zhì)量推測其分子式為C42H62O16，其負(fù)離子模式下的二級質(zhì)譜圖中出現(xiàn)高豐度的離子峰m/z 351，該碎片離子為甘草酸苷鍵斷裂脫去苷元后形成的二聚葡萄糖醛酸殘基，隨后二聚葡萄糖醛酸殘基繼續(xù)裂解得到高豐度的一分子葡萄糖醛酸殘基碎片離子m/z 193，該碎片離子繼續(xù)脫水、脫羧得到m/z 175、157以及高豐度的m/z113等碎片，高豐度的碎片離子m/z 351、193和113可以作為此類化合物在負(fù)離子模式下的特征離子。甘草酸在正離子模式下的二級質(zhì)譜圖提供的裂解信息與負(fù)離子模式不同，正離子模式下產(chǎn)生823.405 5 [M+H]+的分子離子峰，其二級質(zhì)譜圖里出現(xiàn)低豐度的苷元碎片離子m/z 471，隨后苷元失去一分子H2O得到高豐度的碎片離子m/z 453，該碎片離子繼續(xù)脫羧得到m/z 407，同時其C環(huán)發(fā)生RDA裂解，出現(xiàn)眾多雜亂的碎片離子峰，m/z 471、453可以作為此類化合物在正離子模式下的特征離子[20-21]。甘草酸在負(fù)離子和正離子模式下的質(zhì)譜裂解途徑見圖4、圖5。

3.2.4? 其他類化學(xué)成分的鑒定? 除上述成分外，還從湖南新冠2號方中檢測出3個環(huán)烯醚萜苷類（化合物8、12和16）、3個核苷類（化合物1、2和3）、2個氨基酸類（化合物4和7）和2個脂肪酸類（化合物63和64）。

4 討論

中藥預(yù)防處方在防控COVID-19疫情期間發(fā)揮重要作用，中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中藥復(fù)方研究的關(guān)鍵問題。中藥復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜多樣在短時間內(nèi)難以快速對其進(jìn)行分離鑒定，LC-MS具有高分離度、高靈敏度、高精密度的特點(diǎn)，在化學(xué)成分的鑒定方面具有獨(dú)特優(yōu)勢，可以在短時間內(nèi)對復(fù)雜化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。本研究通過建立湖南新冠2號方的UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS定性分析方法，得到未知化合物在正、負(fù)離子下準(zhǔn)分子離子峰的精確相對分子質(zhì)量，運(yùn)用Xcalibur軟件計算化合物的分子式，通過二級質(zhì)譜裂解碎片分析其裂解途徑，結(jié)合PubChem、MassBank、Metlin、Human Metabolome

Database（HMDB）等數(shù)據(jù)庫，以及參考相關(guān)文獻(xiàn)，推測化合物的結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)對湖南新冠2號方中化學(xué)成分進(jìn)行快速鑒定的目的。

湖南新冠2號方是由黃芪、山銀花、陳皮、大棗、甘草5味中藥組成，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)以及本實(shí)驗(yàn)測得的分析結(jié)果可以推斷出一部分化學(xué)成分的來源歸屬。陳皮、甘草中富含黃酮類成分，其中蘆丁為5味藥材中均含有的黃酮類成分，橙皮苷、柚皮苷、柚皮素、維采寧-2等來源于陳皮，甘草素、異甘草素、甘草苷、烏拉爾寧等來源于甘草。此外，甘草中還富含三萜類成分，如：甘草酸、甘草次酸、羥基甘草酸等為來源于甘草中的三萜類成分。山銀花中富含有機(jī)酸類成分，如：綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、二咖啡酰奎寧酸等。苯丙氨酸、芒柄花苷、紫檀苷、毛蕊異黃酮等為來源于黃芪中的成分。大棗中檢測出來的化學(xué)成分極少，僅蘆丁來源于大棗。

本實(shí)驗(yàn)鑒定了湖南新冠2號方中64個化學(xué)成分，其中34個黃酮類化合物、10個有機(jī)酚酸類化合物、10個三萜類化合物、3個環(huán)烯醚萜苷類、3個核苷類、2個氨基酸類和2個脂肪酸類化合物。黃酮類化合物是檢出最多的一類化合物，負(fù)離子模式下響應(yīng)度較高，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗炎、抗氧化等藥理作用，黃酮類化合物對免疫細(xì)胞的調(diào)控與其對細(xì)胞信號通路的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，主要通過介導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子-κB、絲裂原活化蛋白激酶和Toll樣受體等細(xì)胞信號通路，調(diào)控相關(guān)免疫分子的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。這類化合物可能是湖南新冠2號方通過增強(qiáng)機(jī)體免疫功能來預(yù)防COVID-19的主要藥效成分，本研究為揭示湖南新冠2號方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，明確其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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