藥物免修飾的藥靶鑒定蛋白質(zhì)組方法研究進展

呂佳紋，葉明亮

(1.中國科學院大連化學物理研究所，遼寧 大連 116023；2.中國科學院大學，北京 100049)

現(xiàn)代藥物研發(fā)領(lǐng)域最常用的2種新藥篩選策略是表型篩選和靶向篩選[1-2]。表型篩選是一種直接通過表型與疾病的聯(lián)系來評價藥物療效的直觀方法，曾在上世紀眾多經(jīng)典藥物的發(fā)現(xiàn)中起到巨大作用。2000年左右，研究者們使用靶向方法篩選到了許多有治療價值的明星分子，因此該方法在藥物發(fā)展領(lǐng)域得到了更多重視。靶向篩選方法一般是從已知的“成藥”靶蛋白出發(fā)，篩選一系列候選小分子化合物或其他抗體藥的藥物文庫，從而尋找對成藥靶蛋白有調(diào)控作用的治療潛力的藥物分子。在過去10年中，表型篩選在新藥研發(fā)領(lǐng)域中掀起了一股復興狂潮[3-4]。盡管21世紀初期是一個靶向篩選占主流的時代，但近十幾年來，表型篩選在發(fā)現(xiàn)新藥小分子化合物方面的貢獻大大超過了靶向篩選[5]。然而，表型篩選最大的問題是其獲得的候選化合物的蛋白質(zhì)靶點是未知的[6]。雖然在藥物開發(fā)的早期階段并非必須知曉藥物的靶蛋白，但是若要充分研究候選藥物的藥效及其原理，構(gòu)建藥物靶點蛋白和脫靶蛋白數(shù)據(jù)庫仍然是非常關(guān)鍵的[7]。通過深入研究藥用小分子化合物在細胞內(nèi)的作用機制(mechanism of action, MoA)，建立“藥物結(jié)構(gòu)-作用靶點-表型”的三元模型，有助于更深入透徹地理解藥物分子是如何參與調(diào)控生物體內(nèi)的生命活動[8]。尤其是藥物分子與其靶蛋白之間相互作用的研究，即靶點解析(target deconvolution)，在臨床用藥指導、患者分級策略、不良反應預測以及推廣臨床使用等臨床應用領(lǐng)域具有重大意義[9]。

在很長一段時間內(nèi)，基于遺傳學的配體-蛋白相互作用解析方法被廣泛應用于識別新的藥物靶點和研究在藥物功能和耐藥性中起作用的基因[10]。然而，這些基于遺傳學的方法只能間接地為藥物-靶蛋白相互作用提供證據(jù)。遺傳學的研究方法通常涉及抑制或過表達相關(guān)基因來研究藥物小分子對生物體表型的影響，因此，通常是假說驅(qū)動的驗證性研究。除此之外，基于基因組學和轉(zhuǎn)錄組學的研究方法都缺乏諸如翻譯后修飾(PTM)、蛋白質(zhì)定位和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等信息。相反，在蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)中，這些信息得以保留。隨著蛋白質(zhì)組學的重要分析工具——質(zhì)譜儀的發(fā)展，尤其是Orbitrap系列質(zhì)譜儀分析能力的提升，極大拓展了蛋白質(zhì)組的鑒定深度和定量精度。在過去的15年中，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學和基于計算技術(shù)的生物信息學領(lǐng)域的進步，極大地推動了藥靶篩選的研究，發(fā)展了一系列基于蛋白質(zhì)組學的靶點解析方法。

在化學蛋白質(zhì)組學方法中，親和色譜法(affinity chromatography)是一種經(jīng)典的策略，被廣泛應用于研究蛋白質(zhì)與生物活性小分子的相互作用或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用[11]。該方法通過適當?shù)墓倌軋F(通常是羧酸或伯胺)，將配體分子固載于固相基質(zhì)上，然后與蛋白質(zhì)提取物共孵育，經(jīng)過幾個洗滌步驟后，與配體結(jié)合的蛋白保留在基質(zhì)上，通過蛋白變性或自由配體競爭將這些結(jié)合蛋白洗脫下來，最后使用凝膠電泳或液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對洗脫的蛋白質(zhì)進行分析[7]。這種方法的一個明顯缺點是需要合成待研究活性化合物的衍生物，并將其以化學偶聯(lián)的方式固載到基質(zhì)樹脂材料上。這一化學衍生過程可能會影響待研究分子的生物活性部分。此外，被固載的配體分子的蛋白質(zhì)結(jié)合特性(即特異性和/或親和力)可能與游離配體有差異，因此無法將目標蛋白質(zhì)捕獲到樹脂上。另一個問題是，因為引入了連接臂和固載樹脂材料，可能會有許多非特異性蛋白被吸附在固相基質(zhì)上，對后續(xù)的樣品分析造成一定的干擾[12]。還有一種專門研究蛋白激酶抑制劑的化學蛋白質(zhì)組方法，與親和色譜法在策略上非常相似。即先將一系列泛激酶抑制劑分子通過共價鍵固載到基質(zhì)材料上，再將待研究的抑制劑小分子和固載基質(zhì)材料共同投入到樣品中與蛋白共孵育，使待研究的小分子與泛特異性親和性基質(zhì)共同競爭結(jié)合蛋白，從而檢測待研究的抑制劑與其靶蛋白的結(jié)合能力[13-14]。這種方法具有廣譜性，能夠?qū)崿F(xiàn)超過200個蛋白激酶靶點的檢測，目前泛激酶抑制劑固載基質(zhì)已被成功商品化。這種方法不需要對配體小分子進行化學衍生，而是通過檢測待研究的抑制劑小分子與固載的泛激酶抑制劑之間對靶蛋白競爭能力的差別，反向地推斷配體分子與靶蛋白的結(jié)合情況[15]。這種基于Kinobeads方法的實施過程相對比較復雜，其實驗過程需要使用昂貴的標記試劑進行定量檢測[12]。

另一種廣泛使用的方法是由Cravatt團隊開發(fā)的基于活性的蛋白質(zhì)組分析(ABPP)，利用化學探針檢測與某一類配體小分子有親和作用的蛋白質(zhì)的化學蛋白質(zhì)組[16-18]。ABPP方法最初用于酶譜分析，后來被引入藥物靶點篩選領(lǐng)域。這種方法利用了特殊設計的化學探針，其結(jié)構(gòu)通常包括3個功能部分：1) 結(jié)合基團。與靶蛋白有親和相互作用，將探針引導至受體結(jié)合區(qū)域；2) 反應基團。使探針與受體蛋白質(zhì)發(fā)生共價連接；3) 報告基團。通常為可拓展的基團，如疊氮/炔基等，或是熒光基團、可富集基團等可被檢測的標簽，用于定性、定量地檢測結(jié)合蛋白[16,19]。常規(guī)的分析流程為：通過反應基團將探針與靶蛋白共價連接后，使用點擊化學技術(shù)將報告基團接到探針上，原位發(fā)光或質(zhì)譜等方式檢測探針捕獲的結(jié)合蛋白。這些親和性探針能夠以化學鍵的方式“凍結(jié)”小分子與靶蛋白之間的相互作用，可以幫助固定一些低親和力的靶蛋白，提高對這些相對較弱結(jié)合力靶點的鑒定能力[7]。

這些化學蛋白質(zhì)組學技術(shù)是高通量藥物靶點篩選的有力工具[3,20-22]。然而，值得注意的是，這2種方法都需要額外對小分子藥物或競爭性抑制劑進行化學衍生，隨之帶來了一系列問題。例如，一些小分子化合物在化學結(jié)構(gòu)上缺乏合適的化學修飾空間，因此無法被設計衍生成為化學探針或固載有藥物小分子的固相基質(zhì)[23]。額外的化學衍生還可能影響藥物的生物活性/靶點結(jié)合特異性，造成靶蛋白的錯誤識別或無法檢測到與小分子原有結(jié)構(gòu)發(fā)生結(jié)合的蛋白[24-25]?；谟H和色譜法利用了固定化小分子藥物與靶蛋白之間的親和作用來捕獲靶蛋白，因此，在檢測低豐度蛋白和親和力較弱的靶蛋白上存在著一定難度。而ABPP技術(shù)利用化學探針直接標記、富集和鑒定靶蛋白，在一定程度上緩解了這一問題。由于探針連接到某些蛋白質(zhì)氨基酸殘基上時，可能會影響胰蛋白酶的消化效率，酶解產(chǎn)物肽段可能過長而不適合bottom-up蛋白質(zhì)組學分析。此外，有一些探針化學結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定或空間位阻過大，導致質(zhì)譜分析時探針標記的肽段無法被有效地碎裂，造成質(zhì)譜分析困難。因此，有必要發(fā)展無需對藥物分子進行化學改造的藥靶篩選方法。

在過去的幾十年中，蛋白質(zhì)組學家聯(lián)合生物學家發(fā)展了一系列藥物免修飾(modification-free)的藥物靶蛋白分析方法[26]，這些方法不需合成探針或?qū)λ幬锓肿舆M行任何化學修飾。相反，它們可以通過直接測量藥物結(jié)合后蛋白質(zhì)性質(zhì)的特定變化鑒定藥物靶蛋白，如測量蛋白的熱穩(wěn)定性和蛋白酶解敏感性變化。這些蛋白質(zhì)性質(zhì)的改變是由于藥物結(jié)合后，靶蛋白能量狀態(tài)、蛋白折疊結(jié)構(gòu)等生物物理性質(zhì)發(fā)生了改變。使用諸如細胞熱位移分析、熱蛋白質(zhì)組分析、蛋白質(zhì)氧化速率穩(wěn)定性分析、基于有機溶劑沉淀蛋白穩(wěn)定性方法、藥物親和相應靶點穩(wěn)定性分析、脈沖酶解法、限制性酶解法等藥物免修飾的方法，即可區(qū)分與藥物分子發(fā)生結(jié)合的靶蛋白和游離蛋白。本文將詳細闡述以上方法的原理、實施和應用。

1 藥物免修飾的藥物靶蛋白篩選方法

1.1 細胞熱位移分析(熱蛋白質(zhì)組分析)

熱位移分析(TSA)是使用最廣泛的非化學修飾藥物靶點的發(fā)現(xiàn)方法之一[27]。通過測量光散射[28]或熒光[29]的變化來確定蛋白熔融點的變化，并繪制藥物結(jié)合蛋白和游離蛋白的熱熔融曲線。當靶蛋白與藥物發(fā)生結(jié)合形成復合物時，靶蛋白的熱穩(wěn)定性增強，通過比較游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的靶蛋白熱熔化曲線中點的位移(Tm)，即可判斷蛋白是否為藥物的靶點[30]。該方法簡單明了，但由于探針不能區(qū)分不同的蛋白質(zhì)，因此，TSA僅適用于純化蛋白的分析。為解決這一問題，Nordlund團隊開發(fā)了一種概念類似的技術(shù)，稱為細胞熱位移分析(CETSA)，用于在活細胞中直接研究藥物與靶蛋白的相互作用[31]。在CETSA方法中，用藥物或載體處理多份細胞裂解物或完整細胞，加熱至10個不同溫度點并冷卻，然后高速離心分離含有可溶性蛋白的上清液部分和不溶性的沉淀部分，示于圖1。隨著溫度升高，蛋白質(zhì)逐漸展露出疏水核，使蛋白質(zhì)在高溫下沉淀。因此，可通過測定隨溫度升高的可溶性蛋白質(zhì)組分來衡量蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。在CETSA中，不同溫度點可溶性組分中的蛋白質(zhì)分別用蛋白免疫印記法定量檢測，然后根據(jù)蛋白質(zhì)的強度隨溫度升高的變化，繪制蛋白質(zhì)的熱熔化曲線。根據(jù)藥物結(jié)合蛋白和游離蛋白之間的熱熔化曲線中點位移區(qū)分藥物靶蛋白[32]。在確定蛋白熱熔化中點位移溫度后，可通過等溫劑量依賴的實驗研究藥物劑量與藥物靶蛋白結(jié)合之間的關(guān)系，從而測定藥物分子與靶蛋白相互作用的親和力[31]。在這種等溫劑量響應指紋圖譜方法(ITDRFCETSA)中，細胞或細胞裂解產(chǎn)物暴露于不同濃度的藥物處理條件下，同時保持加熱時間和溫度恒定，通過比較蛋白結(jié)構(gòu)受藥物保護的程度，可以識別出該蛋白是否為真正的藥物靶點，并且推斷對應的Kd值。CETSA技術(shù)具有操作簡便、與完整細胞相容性好等優(yōu)點，在全球的學術(shù)界和工業(yè)界都已得到廣泛應用，是目前藥物靶蛋白篩選的常用方法之一[33-36]。此外，CETSA還被應用于研究脫靶蛋白、結(jié)合機制、藥效和細胞耐藥性等生物學問題[2,37]。除了能定性鑒定藥物-靶點的相互作用外，ITDRFCETSA還可用于探索動物體內(nèi)劑量依賴的靶點相互作用、幫助確定藥物的使用和劑量、監(jiān)測耐藥性[31]。

圖1 細胞熱位移(熱蛋白質(zhì)組分析)方法工作原理及流程Fig.1 Principle and workflow of CETSA (or TPP)

最初，CETSA技術(shù)使用基于抗體的蛋白質(zhì)免疫印記法(western blotting)或近程放大發(fā)光均相檢測(alpha screening)進行蛋白定量分析，從而描繪蛋白在加藥與否條件下的熱融化曲線。這種基于抗體定量的CETSA方法需要提前了解目標靶蛋白并獲得對應抗體，因此不適用于無偏好性地(unbiased)發(fā)掘藥物新靶點，也無法獲得蛋白質(zhì)組水平的全局化數(shù)據(jù)。2014年，Savitski團隊[38]將CETSA方法與多重定量質(zhì)譜法相結(jié)合，發(fā)展了熱蛋白質(zhì)組分析(TPP)方法，并應用于藥物靶點蛋白和脫靶蛋白的鑒定。利用基于串聯(lián)質(zhì)量標簽(TMT-10plex)標記的高通量鑒定和定量能力，TPP方法能夠同時檢測全蛋白質(zhì)組在10個溫度下的熱變性狀態(tài)，并繪制完整的熔化曲線，從而可以確定每種蛋白質(zhì)的熱位移變化。本質(zhì)上，TPP與CETSA的原理完全一致，都是基于蛋白質(zhì)受熱變性會逐漸展開結(jié)構(gòu)并析出沉淀；不同之處在于，TPP使用多重標記的質(zhì)譜技術(shù)進行蛋白定量，最初的CETSA使用基于抗體的定量技術(shù)。因此，這種基于高通量質(zhì)譜進行蛋白定量的熱位移技術(shù)，又被稱為MS-CETSA。與CETSA相同，TPP/MS-CETSA可被用于細胞提取物層次的研究，亦可被應用于完整的活細胞層次，通過結(jié)合這兩方面的信息，可以區(qū)分由于靶蛋白直接與配體結(jié)合引起的熱位移和下游信號通路變化引起的蛋白質(zhì)熱位移[39]。那些在活細胞實驗中熱穩(wěn)定性受到影響、而在細胞提取物中未受影響的蛋白質(zhì)可能是藥物分子的間接靶點[40]。因為質(zhì)譜方法的分析通量很高，可以一次性分析成千上萬的蛋白，TPP方法廣泛應用于篩選一系列潛力藥物或其他小分子的靶蛋白及其相互作用蛋白與下游信號通路的研究[41-45]。還有一種方法——配體穩(wěn)定靶點識別技術(shù)(TILS)[46]，與CETSA或TPP方法研究可溶性部分蛋白的不同，該方法研究的是蛋白在加熱之后產(chǎn)生不可溶的沉淀部分，可被視為CETSA/TPP的互補方法。

雖然CETSA/TPP方法最初是為研究蛋白與藥物相互作用而開發(fā)的，這2種基于熱穩(wěn)定性變化的方法也可被用于研究蛋白與其他配體分析的相互作用，例如蛋白-蛋白的相互作用，蛋白與核酸、代謝物、氨基酸、脂質(zhì)等生命活動中常見配體分子的相互作用。2018年，開發(fā)MS-CETSA和TPP的2個團隊分別將這種基于熱穩(wěn)定性變化的方法應用于細胞周期蛋白質(zhì)組的研究，通過檢測細胞生命周期過程中蛋白質(zhì)豐度和熱穩(wěn)定性的變化，揭示了在細胞生命周期不同狀態(tài)下全蛋白質(zhì)組及蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡的變化。這種針對“不同細胞狀態(tài)×不同加熱狀態(tài)”兩個維度下的熱穩(wěn)定性變化研究，被稱為2D-CETSA或2D-TPP，即“溫度梯度(temperature)×處理狀態(tài)(condition)”的二維樣品陣列。P?r Nordlund團隊將這種策略應用到細胞周期不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)與其他配體的相互作用研究中，如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用，蛋白質(zhì)與核酸、代謝物、脂質(zhì)、輔因子等配體的相互作用[47]。該研究首次將基于熱穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)能量狀態(tài)變化引入細胞周期蛋白質(zhì)組，探究細胞生命周期中不同時期的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性和表達水平變化，并將發(fā)生動態(tài)變化的蛋白分為3類：1) 僅在蛋白表達水平發(fā)生變化；2) 僅在蛋白熱穩(wěn)定性水平發(fā)生變化；3) 在蛋白表達和熱穩(wěn)定性水平都發(fā)生變化。研究結(jié)果表明，發(fā)生了熱穩(wěn)定性變化的蛋白相比僅發(fā)生表達水平變化的蛋白參與了更多的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡。除蛋白表達水平外，CETSA技術(shù)能夠通過測定熱穩(wěn)定變化，從而反映細胞生命周期不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)實現(xiàn)多種生物學功能的過程，有助于研究細胞周期過程中蛋白質(zhì)相互作用的動態(tài)變化。研究人員還指出，處于同一相互作用網(wǎng)絡中的蛋白質(zhì)有相似的熱穩(wěn)定性位移，表明這些蛋白可能作為1個蛋白質(zhì)復合物執(zhí)行特定的生物學功能。在后續(xù)工作中，該團隊開發(fā)了熱穩(wěn)定性近程共聚集(TPCA)算法，并用于研究已知蛋白復合物，證實了這些已知的蛋白復合物確實能表現(xiàn)出“熱穩(wěn)定共聚集”效應，為系統(tǒng)性地預測蛋白質(zhì)復合物以及研究細胞異質(zhì)性的蛋白復合物提供了很好的工具[48]。Savitski團隊[49]也將這種2D-TPP策略應用于系統(tǒng)性地研究細胞周期過程中蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性變化和可溶性蛋白豐度變化，證明了在細胞周期的M期和G1期之間，細胞中蛋白的熱穩(wěn)定性變化是廣泛存在的。他們認為細胞生命周期過程中，蛋白豐度變化和蛋白熱穩(wěn)定性變化是相互獨立的，換言之，細胞周期相關(guān)的蛋白熱穩(wěn)定性變化是通過與蛋白豐度無關(guān)的機制調(diào)控的。

然而，這些基于熱穩(wěn)定性變化的方法存在一定的局限性。首先，由于需要保持蛋白質(zhì)活性，在蛋白提取過程中通常不添加變性試劑，使得膜蛋白等高疏水性蛋白質(zhì)無法檢測。實際上，很多藥物的作用靶點均存在于細胞膜上。為解決這一問題，可以向細胞提取液中添加溫和的洗滌劑(如NP-40)來幫助溶解膜蛋白，在一定程度上提升膜蛋白的溶解性[50]。此外，這些方法不適用于解折疊后仍不發(fā)生沉淀聚集的蛋白[51]。理論上，蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性在一定程度上會受到配體結(jié)合的影響。然而，一些蛋白質(zhì)在表觀熔化溫度上并沒有明顯受到配體結(jié)合的影響[39]。對于一些多結(jié)構(gòu)域蛋白或結(jié)構(gòu)巨大的蛋白，配體誘導的結(jié)構(gòu)變化可能只發(fā)生在很小的范圍內(nèi)，不足以對蛋白質(zhì)聚集和沉淀產(chǎn)生影響[32,39]。除此之外，觀察到一些蛋白質(zhì)在藥物處理后熱穩(wěn)定性降低，發(fā)生了去穩(wěn)定化作用[52]。一種解釋是這些蛋白質(zhì)并不是藥物直接的靶蛋白，而是真正靶蛋白的相互作用蛋白。在實施過程中，CETSA或TPP方法的單個樣品分析通常需要10個溫度點，如果考慮到不同處理狀態(tài)或來源的樣品與生物學/技術(shù)重復，通常需要10×N個樣品測量，過大的分析通量對于基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組分析的穩(wěn)健性是一個嚴峻的挑戰(zhàn)。最近，研究者們分別從樣品前處理和數(shù)據(jù)處理兩個方面出發(fā)，發(fā)展了一系列優(yōu)化熱穩(wěn)定性分析的方法，旨在降低待分析樣品數(shù)目。一種近年來比較流行的“一鍋法”策略是將多個加熱溫度點的樣品混合后直接分析單個合并樣品，將CETSA原有的測定熱融曲線的“位移變化”轉(zhuǎn)變?yōu)椤胺e分變化”[53]。本課題組開發(fā)了一種微球輔助的熱致沉淀分析方法(MAPS)，在樣品前處理過程中，引入微球材料捕獲蛋白質(zhì)受熱沉淀，隨后進行基于微球的快速、高通量的SP3法樣品前處理；從熱穩(wěn)定性數(shù)據(jù)處理方面，開發(fā)了一種不依賴于擬合熱熔曲線的數(shù)據(jù)處理策略，通過比較加藥/空白兩種處理條件之間的整體穩(wěn)定性差異，在數(shù)據(jù)處理層次上“合并”多個溫度點的數(shù)據(jù)，降低所需分析樣品數(shù)目的同時，放大了熱穩(wěn)定性變化差異[54]。另一種等溫熱位移(iTSA)方法[55]為在單一溫度點下進行熱穩(wěn)定性實驗，通過增加樣品重復次數(shù)提高靶蛋白鑒定的統(tǒng)計學可信度，在單一溫度下，也可達到與CETSA/TPP相似的效果，但該方法不能大幅度減少所需分析的樣品個數(shù)。

1.2 蛋白質(zhì)氧化速率穩(wěn)定性分析

上述基于熱穩(wěn)定性方法反饋的是蛋白水平的信息，僅能檢測到蛋白與配體結(jié)合后的整體生物物理性質(zhì)的變化，無法揭示配體結(jié)合域的詳細信息。Fitzgerald團隊專注于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其功能的研究，在2000年發(fā)展了一種基于氫氘交換(H/D交換)速率方法，用于全局性檢測蛋白質(zhì)上的酰胺基團，以分析蛋白質(zhì)穩(wěn)定性[56]。因為某些基團上的不穩(wěn)定氫原子可以與周圍溶劑中的質(zhì)子發(fā)生自由交換，通過監(jiān)測這些氫原子與重水溶劑中氘原子的交換速率來考察蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。然而，H/D交換過程中的回交現(xiàn)象會對蛋白結(jié)構(gòu)折疊的觀測產(chǎn)生不利影響，隨后該團隊發(fā)展了一種與先前的酰胺H/D交換策略相似的方法，即基于蛋白質(zhì)氧化速率穩(wěn)定性(SPROX)的配體-蛋白相互作用研究方法[57]。在SPROX中，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是通過甲硫氨酸殘基的氧化速率與化學變性劑(如鹽酸胍或尿素)濃度的關(guān)系來評估的。向含有或不含藥物的細胞蛋白質(zhì)提取物中加入一系列濃度遞增的化學變性劑(例如鹽酸、GdmCl)緩沖液，使用等量的過氧化氫試劑氧化蛋白樣品后，對蛋白質(zhì)氧化反應進行猝滅，再進行常規(guī)bottom-up蛋白質(zhì)組樣品前處理，隨后進行質(zhì)譜定量分析，測定未氧化和氧化的含甲硫氨酸肽段的相對強度，并繪制含甲硫氨酸肽段氧化程度隨SPROX緩沖變性劑濃度變化的曲線。通過加藥或空白處理下的含蛋氨酸的氧化肽和非氧化肽的氧化曲線的中點位移，可以判斷該肽段所歸屬的蛋白是否為藥物直接或間接相互作用的蛋白，示于圖2。曲線中點位移可用于計算蛋白質(zhì)折疊自由能(ΔGf)、結(jié)合自由能(ΔΔGf)和解離常數(shù)(Kd)[57-58]。原則上，SUPREX和SPROX均測量蛋白質(zhì)的去折疊/復性平衡。與H/D交換的可逆問題相比，SPROX的主要優(yōu)點是化學反應的不可逆性。SPROX方法開發(fā)早期，由于受到定量通量的限制，最初主要針對單個純化蛋白質(zhì)進行蛋白折疊情況研究[57]，但隨著基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學技術(shù)的飛速發(fā)展，該方法被拓展應用于研究復雜生物樣品中的蛋白質(zhì)-配體結(jié)合特性[59]。

圖2 蛋白質(zhì)氧化速率穩(wěn)定性分析方法工作原理及流程Fig.2 Principle and workflow of SPROX

理論上，任何定量方法都可以在SPROX中定量分析非氧化和氧化含蛋氨酸的肽段。然而，考慮到SPROX中的多重變性條件，基于穩(wěn)定同位素標記的多重定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)更適合作為SPROX的定量手段，包括串聯(lián)質(zhì)譜標記(TMT/iTRAQ)的化學標記[60]和細胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標記(SILAC)[61-65]。2019年，有研究[62]使用SPROX方法與TMT聯(lián)用，將其命名為高分辨SPROX(HR-SPROX)，報道了在人類細胞提取物中檢測到的約3 000個蛋白質(zhì)中約10 000個獨特的折疊穩(wěn)定性變化區(qū)域。2020年，F(xiàn)itzgerald團隊[66]將SPROX技術(shù)與基于熱穩(wěn)定性的CETSA方法相結(jié)合，用于研究抗組胺藥物氯馬斯汀的靶蛋白和藥效機制，成功鑒定并驗證了瘧原蟲伴侶蛋白TRiC/CCT是氯馬斯汀的靶點。與CETSA/TPP方法相同，SPROX方法也需要一系列不同濃度變性劑處理的樣品點來描繪蛋白/肽段的氧化曲線，對后續(xù)的蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析通量造成很大壓力?！耙诲伔ā钡乃枷肟杀粦糜谒谢诙鄿y量點擬合蛋白穩(wěn)定性曲線的非化學修飾的藥物靶蛋白篩選方法，同樣地，也可被應用于SPROX分析中，將多個變性劑濃度處理后的樣品合并，“多點分析”轉(zhuǎn)化為“單點分析”，可以降低樣品數(shù)目、提高分析通量[67]。

SPROX方法最初的設計是用于研究蛋白質(zhì)與藥物的親和力，現(xiàn)在被擴展到蛋白質(zhì)與其他小分子配體的相互作用[60,68]、疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化和翻譯后修飾[61,69]、金屬離子與蛋白的相互作用及毒性機制[70]等研究。SPROX的局限性之一是其只適用于研究含有甲硫氨酸殘基的蛋白質(zhì)。為克服這一弱點，開發(fā)了一系列針對其他氨基酸殘基的化學修飾方法，包括針對賴氨酸殘基的SMTA[71]、針對色氨酸的HNSB[72]。與CETSA和其他基于熱穩(wěn)定性的方法相同，SPROX主要適用于檢測藥物與可溶性蛋白質(zhì)的相互作用。由于該方法需要使用外源的化學變性劑和氧化劑，無法像CETSA/TPP一樣被應用于分析活細胞。SPROX可在肽水平上分析氧化和非氧化蛋氨酸，表明其具有揭示每個獨特蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的局部穩(wěn)定性的能力。但由于肽段水平定量的信噪比、假陽性等問題，這種針對局部結(jié)構(gòu)域的方法在藥物靶蛋白的鑒定覆蓋度和準確性上有所遜色。因此，F(xiàn)itzgerald團隊開發(fā)了一種化學變性相關(guān)的蛋白沉淀方法(CPP)，利用化學變性劑使蛋白沉淀，隨后稀釋變性劑濃度使已被展開結(jié)構(gòu)的變性蛋白析出沉淀，通過檢測藥物對其靶蛋白結(jié)構(gòu)的保護效應，實現(xiàn)高覆蓋的藥物靶蛋白鑒定和篩選[73]。

1.3 基于有機溶劑沉淀蛋白穩(wěn)定性方法

目前，已開發(fā)了許多利用蛋白質(zhì)沉淀過程解析藥物靶蛋白的方法。如CETSA/TPP、SPROX等都是在蛋白變性過程中，檢測藥物結(jié)合對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響。此前，本課題組發(fā)展了一種基于有機溶劑沉淀蛋白穩(wěn)定性方法(SIP)[74]，在蛋白質(zhì)組層面進行藥物靶蛋白篩選，示于圖3。該方法使用蛋白沉淀中常用的丙酮沉淀劑溶液(50%丙酮-50%乙醇-0.1%乙酸)，使蛋白在一系列有機溶劑濃度(9%～19%)中逐漸沉淀，因與藥物發(fā)生結(jié)合的靶蛋白會比游離蛋白更穩(wěn)定，更不易被有機溶劑沉淀，通過檢測上清液中剩余蛋白質(zhì)的相對強度，即可揭示全蛋白質(zhì)組在受到有機溶劑影響下的蛋白穩(wěn)定性變化。使用SIP方法對格爾德霉素的潛在靶蛋白進行篩選，不僅鑒定到已知靶蛋白HS90AA1、HSP90AB1和HSP90B1，還篩選出若干個潛在的脫靶蛋白。在這些候選靶蛋白中，用蛋白印跡法(WB)驗證了篩選到的NDUFV1確實是格爾德霉素的脫靶蛋白。與基于熱穩(wěn)定性的CETSA和基于氧化的SPROX方法相同，SIP方法也能測量藥物與其靶蛋白的親和力。用該方法評估了格爾德霉素與其已知靶蛋白HSP90AB1的解離常數(shù)，不同有機物濃度、不同劑量格爾德霉素濃度下的實驗結(jié)果表明，格爾德霉素與HSP90AB1的半飽和濃度在0.1～1 μmol/L之間，與前人報道的Kd=1.2 μmol/L相吻合。我們也對篩選的候選靶蛋白NDUFV1的Kd進行了評估，發(fā)現(xiàn)半飽和濃度約為10 μmol/L，其與格爾德霉素的親和力比與已知靶蛋白HSP90AB1的弱。

圖3 基于有機溶劑沉淀蛋白穩(wěn)定性方法工作原理及流程Fig.3 Principle and workflow of SIP

還有一種DiffPOP方法，使用甲醇/乙酸沉淀劑促進蛋白沉淀，鑒定到絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶SHMT2是組蛋白去甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑小分子JIB-04的作用靶點[75]。這些基于有機溶劑沉淀蛋白的方法均無法直接在活細胞層次進行研究，而需要將細胞裂解后提取蛋白進行體外實驗。因蛋白變性的機理不同，基于有機溶劑沉淀穩(wěn)定性的SIP方法與基于熱穩(wěn)定性的CETSA方法具有很好的互補性。

1.4 藥物親和響應靶點穩(wěn)定性分析

與藥物發(fā)生結(jié)合的蛋白比游離蛋白更不易被蛋白酶水解[76-77]。從熱力學角度，因與藥物發(fā)生結(jié)合后蛋白的能量狀態(tài)降低，藥物-蛋白復合物從折疊態(tài)到非折疊態(tài)所需跨越的能量勢壘更大，因此，藥物結(jié)合蛋白的能量狀態(tài)更穩(wěn)定。從動力學角度，這些能量狀態(tài)更穩(wěn)定的藥物結(jié)合靶蛋白的解折疊速率比游離靶蛋白低，暴露可酶切位點的可能性更低，因此，藥物結(jié)合蛋白上的酶切位點更不容易被蛋白酶所觸及。而蛋白質(zhì)的水解敏感性取決于這些可酶切位點的可接觸范圍，同樣條件下藥物處理后的靶蛋白比未經(jīng)藥物處理的靶蛋白更不易被蛋白水解酶降解。早在上世紀90年代就已經(jīng)提出使用限制性酶切方法研究蛋白的折疊速率[78-79]，在2009年，Huang等[80-81]利用藥物結(jié)合與否會影響蛋白折疊-解折疊速率這一特點，開發(fā)了藥物親和反應靶點穩(wěn)定性(DARTS)方法用于藥物靶點篩選。DARTS方法中，用目標藥物或空白溶劑處理蛋白質(zhì)樣品，然后用蛋白酶對細胞裂解物中的蛋白質(zhì)進行限制性酶解，最后用SDS-PAGE對樣品進行分離，示于圖4。與溶劑對照組相比，被小分子結(jié)合保護的蛋白更不易被蛋白酶水解，因此，其蛋白條帶強度比對照組高。DARTS法可以分析純化蛋白或全細胞裂解后的蛋白提取物，經(jīng)SDS-PAGE分離后，可根據(jù)不同目的采用蛋白印跡法或質(zhì)譜法定量分析樣品組和對照組之間的蛋白定量變化[80,82]。

圖4 藥物親和響應靶點穩(wěn)定性分析方法工作原理及流程Fig.4 Principle and workflow for DARTS

1.5 脈沖酶解法

在DARTS方法中，蛋白質(zhì)通常在天然條件下進行限制性酶解。然而，有些蛋白質(zhì)即使經(jīng)過幾天的消化也能保持緊密結(jié)構(gòu)[83]，可能是因為這些蛋白質(zhì)在天然條件下緊密折疊，蛋白酶無法接觸到特異性酶切位點，此時，DARTS無法識別這些蛋白質(zhì)是否為藥物靶點。脈沖蛋白水解法(PP)通過引入變性劑可在一定程度上解決上述問題[84]。與DARTS不同，脈沖蛋白水解法中的蛋白質(zhì)酶切是在一系列不同變性劑濃度下進行的，蛋白質(zhì)受到變性劑的影響會發(fā)生不同程度的變性和解折疊，示于圖5。在這種方式下，即使是結(jié)構(gòu)最緊密的蛋白質(zhì)也可以在高變性劑濃度(如8 mol/L尿素)下完全展開；然后,將蛋白酶添加到上述溶液中進行脈沖水解，即短時間消化酶切已經(jīng)發(fā)生解折疊的蛋白質(zhì)，但保持折疊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)不易被蛋白酶接觸到特異性酶切位點，抵抗蛋白酶解[84]。在SDS-PAGE分離得到的樣品中，未被酶切的完整蛋白質(zhì)可以通過染色法進行定量。因此，可以確定保留折疊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，即剩余的蛋白質(zhì)部分，并且可以繪制該部分與變性劑濃度的相關(guān)曲線。同SPROX一樣，PP法引入了離液劑使蛋白變性，蛋白變性曲線是在離液劑濃度遞增的條件下描繪的，可用于計算蛋白的全局穩(wěn)定性，即蛋白折疊自由能。

圖5 脈沖酶解法工作原理及流程Fig.5 Principle and workflow of PP

在DARTS和PP方法中，SDS-PAGE經(jīng)常被用于蛋白的分離和定量檢測，隨后切下發(fā)生強度變化的蛋白泳道膠條進行后續(xù)的MS分析。然而，一些生物樣品的復雜性過高，許多蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量相近且聚集在一起，目標蛋白可能被高豐度的非目標蛋白掩蓋，用肉眼很難找到差異變化的蛋白泳道[85]。為了克服這一困難，更高分辨率的二維凝膠電泳被應用于脈沖蛋白水解方法[86]。除了通過凝膠條帶強度測定蛋白豐度外，還可使用基于LC-MS/MS的定量蛋白質(zhì)組學平臺，使用串聯(lián)質(zhì)量標簽[87]、細胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標記(SILAC)[88]等技術(shù)定量每個蛋白質(zhì)樣品中完整蛋白質(zhì)的相對豐度。DARTS和脈沖蛋白水解法的原理都是基于檢測配體誘導的蛋白穩(wěn)定性變化。在無變性劑(DARTS)或有變性劑(脈沖蛋白水解)的情況下，藥物結(jié)合可以保護靶蛋白不被蛋白酶消化。由于這2種方法測定的都是酶解剩余的完整蛋白質(zhì)，而不是酶解產(chǎn)物肽段，因此，不能用于揭示藥物與靶蛋白的結(jié)合位點。并且這2種方法都需要使用外源的蛋白水解酶，所以都無法應用于活細胞的分析。

1.6 限制性酶解法

限制性酶解是一項經(jīng)典的生物技術(shù)手段，DARTS法和脈沖水解法本質(zhì)上都利用了限制性酶解技術(shù)。2004年，F(xiàn)ontana等[79]提出了一個“天然結(jié)構(gòu)-解折疊結(jié)構(gòu)”平衡理論來解釋限制性蛋白水解過程。在該理論中，蛋白質(zhì)的部分未折疊區(qū)域(例如柔性環(huán))具有更高的部分結(jié)構(gòu)可變性，從而為蛋白酶活性位點的結(jié)合提供了更多的可接近性[79,89]。限制性酶解法用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究由來已久，但因為缺乏有效的分離檢測手段，在很長一段時間內(nèi)該方法都被局限于純化的單一蛋白的研究[90-93]，尤其專注于酶解反應后剩余的完整蛋白，而非酶解產(chǎn)物。上述DARTS法和脈沖水解法研究的是經(jīng)短時間酶切后樣品中剩余的蛋白質(zhì)，僅能提供蛋白層面的信息，而酶切位點相關(guān)的結(jié)構(gòu)域信息被忽視了。2014年，在前人研究的基礎(chǔ)上，Picotti團隊創(chuàng)造性地提出了一種基于兩步消化的限制性酶解方法，并結(jié)合基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組技術(shù)研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，被稱為限制性酶解技術(shù)(LiP)[94]，示于圖6。使用這種方法在非變性條件下提取到的天然蛋白質(zhì)需經(jīng)過兩步酶切過程：1) 限制性酶解，使用非特異性蛋白酶(例如，蛋白酶K、嗜熱菌蛋白酶等)在較低濃度和較短時間內(nèi)進行限制性蛋白水解，經(jīng)過水解產(chǎn)生大的蛋白質(zhì)碎片；2) 經(jīng)過上一步限制性水解得到的大塊蛋白碎片被轉(zhuǎn)移到變性條件下，以猝滅第一步的蛋白質(zhì)水解，經(jīng)胰蛋白酶充分消化以產(chǎn)生適于bottom-up蛋白質(zhì)組學分析長度的肽段。此外，還需1對外參樣品，即與樣品組和對照組來源完全相同的1對樣品直接進行經(jīng)典的定量蛋白質(zhì)組分析，蛋白樣品經(jīng)變性、烷基化、胰蛋白酶消化后送入質(zhì)譜分析，這對樣品將作為外源參照標準用于樣品組和對照組之間蛋白定量的歸一化。通過高靈敏度的選擇性反應監(jiān)測(SRM)技術(shù)精確地定量樣品組和對照組之間肽段相對強度的差異，從而推斷蛋白結(jié)構(gòu)差異[94]。該方法關(guān)注了限制性水解產(chǎn)生的產(chǎn)物肽段，由于藥物結(jié)合帶來的空間位阻和蛋白解折疊速率變低將導致某些蛋白結(jié)構(gòu)區(qū)域無法被蛋白水解酶觸及，因此，使加藥組與對照組之間的限制性水解產(chǎn)物肽段豐度不同，這些豐度差異的限制性水解位點很可能含有寶貴的藥物結(jié)合區(qū)域信息。

圖6 限制性酶解法工作原理及流程Fig.6 Principle and workflow of LiP

隨著基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組技術(shù)的發(fā)展，涌現(xiàn)了越來越多高效的蛋白定量技術(shù)，2018年，Paola團隊[95]利用經(jīng)典的鳥槍法蛋白質(zhì)組label-free和DIA定量技術(shù)結(jié)合限制性酶解技術(shù)，發(fā)展了基于限制性酶解的蛋白與小分子互作掃描(LiP-SMap)方法，研究了大腸桿菌和酵母蛋白質(zhì)組與多種代謝物分子的相互作用關(guān)系，首次提出了“含有結(jié)構(gòu)信息的肽段(conformotypic peptide)”概念，揭示了蛋白上與代謝物分子發(fā)生結(jié)合的區(qū)域。2020年，該團隊[96]將這種限制性酶切揭示蛋白結(jié)構(gòu)的策略應用到藥物靶蛋白篩選以及藥物結(jié)合區(qū)域的研究，使用機器學習算法給出打分值來揭示藥物與蛋白結(jié)合情況和大致的結(jié)合區(qū)域范圍。2021年，該團隊將LiP方法的研究范圍拓展到了蛋白翻譯后修飾、變構(gòu)催化、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)聚集等結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組領(lǐng)域，將1個蛋白上含有全部結(jié)構(gòu)信息的肽段列為1個條形碼，作為蛋白結(jié)構(gòu)信息的“身份卡”，使用LiP技術(shù)即可讀取全蛋白質(zhì)組的蛋白在不同狀態(tài)下的獨特結(jié)構(gòu)信息[97]。值得一提的是，LiP方法還可補充CETSA/TPP技術(shù)所缺少的蛋白結(jié)構(gòu)信息，在蛋白加熱變性過程中實施限制性酶切，可研究蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、描繪熱融曲線以及計算蛋白熱熔融點[98]。

綜上所述，基于限制性酶切的LiP技術(shù)是提供信息最全面的藥靶蛋白研究方法，但因其操作步驟多、經(jīng)兩步酶切后產(chǎn)生的肽段樣品較復雜等原因，在實際應用中，該方法篩選藥物靶蛋白的效果并不如熱蛋白質(zhì)組方法(CETSA/TPP)。我們期待未來蛋白質(zhì)組樣品前處理的簡化，隨質(zhì)譜儀器發(fā)展的定量準確度和通量的提升，為基于限制性酶解技術(shù)的藥靶篩選方法帶來性能上的飛躍。

2 總結(jié)

得益于質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)代藥物靶蛋白已從基于假設驅(qū)動的驗證性研究發(fā)展到蛋白質(zhì)組水平上無偏好性的高通量靶點篩選。相比于化學蛋白質(zhì)組學需要在藥物分子上進行化學衍生，非化學修飾方法與前沿的定量蛋白質(zhì)組學相結(jié)合，可以在蛋白質(zhì)組水平上實現(xiàn)高通量、大規(guī)模和無偏好性的藥物免修飾的靶點篩選。

本文綜述了現(xiàn)有的幾種基于高通量質(zhì)譜技術(shù)的藥物免修飾藥物靶蛋白篩選方法，包括基于熱穩(wěn)定性的細胞熱位移分析、熱蛋白質(zhì)組分析，基于蛋白解折疊速率的蛋白質(zhì)氧化速率穩(wěn)定性分析，基于蛋白酶切穩(wěn)定性的藥物親和相應靶點穩(wěn)定性分析、脈沖酶解法、限制性酶解法，和有機溶劑誘導沉淀的穩(wěn)定性分析。這些方法各有其優(yōu)勢和局限性，根據(jù)實際分析需求中的樣品類型、檢測手段和生物物理性質(zhì)等差別，可以選擇適當?shù)姆椒?，示于圖7。在樣品類型方面，只有CETSA和TPP既能夠直接在活細胞層次進行研究，又可以應用于細胞裂解物研究。其他方法的實驗條件不適用于活細胞分析，SPROX、SIP、PP需要外源加入變性劑或沉淀劑使蛋白質(zhì)去折疊，而DARTS、PP和LiP需要外源添加酶來水解蛋白，這些方法只能在細胞裂解液層次上進行研究。在檢測手段方面，本文所列方法都可以采用基于抗體的免疫印記法或基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學方法。最初，基于抗體的定量方法是高通量篩選的重要手段，例如CETSA技術(shù)與AlphaScreening的聯(lián)用極大地提高了篩選通量[33]。隨著質(zhì)譜定量精密度的提高，以及同位素串聯(lián)質(zhì)量標簽的發(fā)展，使質(zhì)譜定量的通量得到提升，基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組技術(shù)逐漸成為首選檢測手段。

圖7 基于蛋白穩(wěn)定性或酶切的藥物免修飾的藥靶鑒定方法原理和特性示意圖Fig.7 Schematics and characteristics of protein stability-or proteolysis-based modification-free methods

然而，這些非化學修飾的藥物靶蛋白篩選方法存在一些缺點。首先，這些方法是在非常復雜的細胞全蛋白質(zhì)組背景下檢測配體藥物與蛋白質(zhì)的相互作用，可能導致鑒定到的蛋白間接受到藥物影響。配體藥物誘導的靶蛋白改變可能導致蛋白質(zhì)復合物中其他蛋白的生物物理性質(zhì)改變，造成混淆。與之相比，ABPP等化學蛋白質(zhì)組技術(shù)可以將探針以共價鍵的方式連接到蛋白上，直接探測靶蛋白的活性中心，為藥物與蛋白質(zhì)的相互作用提供直接的證據(jù)。其次，非特異性蛋白質(zhì)的干擾也是非化學修飾方法的一個困擾。由于一些低豐度的靶蛋白會被高豐度的非靶蛋白“淹沒”，基于鳥槍法的定量蛋白質(zhì)組學很難檢測出低豐度的靶蛋白。此外，這些非化學修飾的方法是通過探測靶蛋白與藥物結(jié)合后某些物理性質(zhì)的變化，如熱力學穩(wěn)定性的變化或蛋白結(jié)構(gòu)構(gòu)象的變化。然而，藥物處理并不會使靶蛋白在這些物理性質(zhì)上都凸顯出明顯的變化，互補方法的聯(lián)用將在一定程度上彌補這一缺點。例如，CETSA和LiP的聯(lián)用可在結(jié)構(gòu)域水平上揭示全蛋白質(zhì)組的熱穩(wěn)定性變化[97]。