鉑基抗癌藥物與蛋白質(zhì)配位鍵相互作用質(zhì)譜研究新進展

黃 超，梁祖君，趙 耀，房田田，吳 魁，羅 群,3，汪福意,3,4

(1.中國科學(xué)院化學(xué)研究所活體分析化學(xué)實驗室，北京分子科學(xué)國家研究中心，北京 100190；2.武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院， 湖北 武漢 430081；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4. 北京質(zhì)譜中心，北京 100190)

癌癥是威脅人類生命健康的重大疾病之一。在主要發(fā)達國家中，癌癥排列在主要死亡因素前列[1]。癌癥治療方法主要包括手術(shù)、放射療法和化學(xué)藥物療法等。其中，化學(xué)療法可在一定程度上阻止癌細胞的無限增殖，鉑藥是化學(xué)療法中的主要藥物。近年來，雖然靶向藥物和免疫藥物方興未艾，取得了很好的療效，但據(jù)報道，接受化療的患者中仍有將近一半使用鉑藥或以鉑藥為主的綜合治療[2]。自順鉑(CDDP)進入臨床治療40多年以來，順鉑、卡鉑和奧沙利鉑廣泛應(yīng)用于多種實體癌癥的治療。在肺癌、膀胱癌、卵巢癌、宮頸癌等惡性腫瘤治療中的效果良好[3]，其中順鉑對睪丸癌的治愈率超過95%。

幾十年來，經(jīng)典鉑類藥物抗癌作用的分子機制一直是藥物研究的重要課題之一。大量實驗表明，順鉑類藥物是平面四邊形結(jié)構(gòu)，帶有2個氨和陰離子配體，其中氨作為非離去基團配體，可以是螯合或非螯合的，在整個細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化過程中，與金屬中心保持結(jié)合[4]。在藥物進入細胞核之前，鉑的陰離子配體作為離去基團被水分子取代；藥物進入細胞核后，水分子被DNA上的堿基取代，形成交聯(lián)產(chǎn)物(主要是鏈內(nèi)交聯(lián)產(chǎn)物，以及少量鏈間交聯(lián)產(chǎn)物)以及單功能復(fù)合物[5]。鉑結(jié)合DNA后造成DNA損傷，可以被核苷酸切除修復(fù)機制(NER)清除[6]。一些非核酸修復(fù)功能的蛋白質(zhì)與鉑損傷DNA結(jié)合，可以使DNA損傷免受NER清除。涉及這種“修復(fù)屏蔽”作用的蛋白質(zhì)主要是高遷移族(HMG)蛋白，其中的某些特定蛋白質(zhì)，如HMGB1可以特異性識別順鉑在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中引起的畸變。這些蛋白質(zhì)屏蔽鉑-DNA加合物使其免于被修復(fù)的能力，可能有助于增強高表達此類蛋白質(zhì)的癌細胞對順鉑的敏感性[7]。

在治療腫瘤的過程中，順鉑還表現(xiàn)出明顯的腎毒性、生殖毒性、耳毒性、神經(jīng)毒性等。另外，腫瘤細胞非常容易產(chǎn)生先天性或獲得性耐藥性，導(dǎo)致藥物劑量和后續(xù)療效受到限制[8]。關(guān)于順鉑毒副作用和耐藥性的研究有很多。有實驗表明，進入細胞的鉑只有不到1%形成了Pt-DNA交聯(lián)產(chǎn)物，而靜脈注射順鉑后，數(shù)小時內(nèi)98%藥物可與血漿蛋白結(jié)合[9]，因此蛋白質(zhì)可能是鉑類藥物的重要靶標，研究鉑類藥物與蛋白質(zhì)的相互作用對于探究其在體內(nèi)的作用途徑、藥效發(fā)揮等非常重要[10]。先前的研究表明，順鉑可與蛋白質(zhì)表面的多種氨基酸殘基發(fā)生非特異性結(jié)合。例如，Pt(Ⅱ)除了對蛋氨酸和半胱氨酸等含硫氨基酸具有很高的親和力，也可與含有氨基和羧基的氨基酸殘基結(jié)合[11]，因此鉑配合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合非常穩(wěn)定。臨床實驗證明，順鉑-蛋白質(zhì)結(jié)合物的副作用比游離順鉑藥物的副作用低，同時保留了藥效基團的抗腫瘤活性[12]。

研究Pt(Ⅱ)配合物與蛋白質(zhì)之間的相互作用，不僅可為設(shè)計新的配合物提供思路，還可以增加新型Pt(Ⅱ)配合物進入臨床實驗的機會。質(zhì)譜作為一種強有力的表征手段，在鑒定和定量小分子藥物(包括金屬藥物)結(jié)合蛋白方面得到了有效應(yīng)用[13]。本課題組前期已發(fā)表綜述介紹質(zhì)譜在金屬抗癌藥物與蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用[14-15]。鑒于鉑類藥物與蛋白質(zhì)作用機理研究的快速發(fā)展及該項研究的重要性。本文重點關(guān)注近十幾年來的最新進展，綜述Pt(Ⅱ)配合物的配位化學(xué)環(huán)境，從分子水平分析鉑-蛋白質(zhì)相互作用方式，結(jié)合本課題組的部分研究工作，總結(jié)和評述以質(zhì)譜為主要分析手段的鉑-蛋白質(zhì)相互作用機理研究新進展。這些研究將有助于更好地理解鉑類抗癌藥物的藥代動力學(xué)和毒副作用機制，為設(shè)計、開發(fā)更加低毒高效的新型金屬抗癌藥物提供理論依據(jù)。

1 鉑類抗癌藥物的配位化學(xué)：分子結(jié)構(gòu)及作用機理

鉑類配合物作為一類經(jīng)典的化療藥物，可根據(jù)中心鉑原子的價態(tài)分為Pt(Ⅱ)配合物和Pt(Ⅳ)配合物。本文將重點介紹Pt(Ⅱ)配合物的配位化學(xué)及其與生物分子的作用機制。

Pt(Ⅱ)配合物是過渡金屬配合物的重要類別之一，可以分為順式鉑、反式鉑(Ⅱ)配合物兩大類。順式二氨二氯鉑配合物(cis-diaminedichloroplatinum, CDDP)簡稱順鉑，是最早進入臨床、應(yīng)用最廣泛的鉑基類藥物之一。順鉑是以二價金屬鉑離子為中心離子，其最外層電子排布為3d8，配合物形成時以dsp2雜化形成平面四邊形結(jié)構(gòu)。順鉑的配體可分為較不穩(wěn)定的氯離子配體，以及較穩(wěn)定、不容易離去的氨分子等含N供體的配體。雜化軌道接受配體的電子后，2個氨分子和2個氯離子分別排布在平面四邊形的兩側(cè)，即構(gòu)成順式結(jié)構(gòu)；若相同的配體分布在平面四邊形的對角線上，則為反式結(jié)構(gòu)。在順鉑的基礎(chǔ)上，研究人員還開發(fā)出了利用不同的單齒配體或多齒配體代替氨或氯而形成的平面四邊形Pt(Ⅱ)配合物[16]，先后開發(fā)出第二代和第三代鉑類抗癌藥物，即卡鉑和奧沙利鉑[17]，示于圖1。

圖1 已獲臨床批準上市的鉑(Ⅱ)抗癌藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of the clinically approved Pt(Ⅱ) anticancer drugs

早期鉑類藥物構(gòu)效關(guān)系研究一般認為，在臨床上具有活性的鉑類藥物具有與順鉑相似的特征，如包含順式結(jié)構(gòu)的配體以及離去基團、進入臨床應(yīng)用的卡鉑和奧沙利鉑等都具有與順鉑類似的結(jié)構(gòu)[3]。從作用機理上看，一般認為順鉑在進入細胞前，由于血液中較高的氯離子濃度(約104 mmol/L)，氯離子不容易離去；一旦順鉑進入細胞內(nèi)，細胞質(zhì)(約20 mmol/L)和細胞核(約4 mmol/L)內(nèi)較低的氯離子濃度導(dǎo)致2個氯離子依次被水分子取代，形成順鉑水解產(chǎn)物[PtCl(NH3)2(H2O)]+和[Pt(NH3)2(H2O)2]2+。在中性或弱酸性介質(zhì)中，順鉑水解產(chǎn)物上的配體水容易被DNA分子內(nèi)嘌呤環(huán)上N7取代，形成單功能DNA結(jié)合產(chǎn)物或雙功能DNA交聯(lián)產(chǎn)物，使DNA鏈扭曲變形，即造成DNA損傷。如果DNA交聯(lián)損傷不被修復(fù)，將阻止DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，繼而抑制癌細胞增殖。然而在臨床使用中，要使順鉑類藥物與細胞核DNA形成復(fù)合物，藥物分子需通過靜脈傳輸?shù)竭_病灶部位，穿過細胞膜并進入細胞核。由于順鉑是一種軟酸屬性的路易斯酸，對具有軟堿屬性的供電子原子有很高的親和力，故Pt(Ⅱ)會優(yōu)先結(jié)合含有S供體的軟堿化合物。實際研究還發(fā)現(xiàn)，Pt(Ⅱ)對配體中含有N供體的交界堿以及O供體的硬堿也有較高的親和力，因此，除了DNA之外，含S、O、N側(cè)鏈氨基酸的多肽、蛋白質(zhì)及氨基酸殘基也能與順鉑相互作用[11]。側(cè)鏈最容易與Pt(Ⅱ)結(jié)合的氨基酸為含有S供體的甲硫氨酸(Met)和半胱氨酸(Cys)，以及含有咪唑環(huán)的組氨酸(His)。另外，酪氨酸(Tyr)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)等含有羥基或羧基側(cè)鏈的氨基酸也能與Pt(Ⅱ)結(jié)合。這些氨基酸與順鉑的結(jié)合位點示于圖2。

對鉑配合物與氨基酸Met的作用機理研究表明，順式Pt(Ⅱ)以及反式Pt(Ⅱ)配合物與Met的結(jié)合產(chǎn)物最終可能通過異構(gòu)化而趨于一致，得到順式SN螯合配合物[18]。谷胱甘肽(GSH)作為細胞內(nèi)濃度最高的含硫生物分子，其與順鉑的反應(yīng)已得到深入研究[18]。含有上述氨基酸殘基的其他重要蛋白質(zhì)，如銅轉(zhuǎn)運蛋白及其伴侶蛋白、金屬硫蛋白、血漿蛋白、鋅指蛋白等也可以與Pt(Ⅱ)相互作用并引起蛋白結(jié)構(gòu)變化[19]。臨床使用中，順鉑通常利用靜脈注射給藥，在這一過程中，人體血漿中含有的高豐度血清白蛋白(HSA)是鉑類藥物的第一潛在靶標。因此，研究順鉑與蛋白質(zhì)的相互作用，對于理解藥物作用機理、代謝運輸以及毒副作用均有重要意義。

相比于順鉑，反式二氯二氨合鉑(Ⅱ)配合物在生理條件下不具有抗癌活性。研究表明，該配合物與DNA結(jié)合時更多形成鏈間交聯(lián)或單功能加合物，其形成鏈間交聯(lián)較緩慢，轉(zhuǎn)變?yōu)殒渻?nèi)交聯(lián)的時間也較長，可被細胞內(nèi)核酸修復(fù)機器在短時間內(nèi)修復(fù)。而具有活性的反式Pt(Ⅱ)配合物由于其配體的作用，可使DNA受到不同程度的損傷，從而導(dǎo)致細胞死亡[20]。與順鉑相似，反式Pt(Ⅱ)配合物也可與除DNA之外的生物分子，如蛋白質(zhì)分子相互作用。目前已經(jīng)上市的順鉑、卡鉑、奧沙利鉑等6種二價鉑類抗癌藥物均可以與蛋白質(zhì)結(jié)合。

2 質(zhì)譜研究鉑類藥物與蛋白質(zhì)相互作用的方法及策略

為了全面、深入地了解Pt(Ⅱ)配合物與蛋白質(zhì)相互作用的位點、反應(yīng)速率、結(jié)合計量以及形成的鉑藥-蛋白質(zhì)復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu)，研究人員發(fā)展了一系列基于電磁波譜和質(zhì)譜的技術(shù)，包括X射線晶體學(xué)、紫外-可見光譜法、熒光光譜法、核磁共振波譜法、質(zhì)譜等。這些方法各自的原理、優(yōu)缺點及應(yīng)用范圍列于表1。相較于電磁波譜表征手段，質(zhì)譜具有靈敏度高、所需樣品量少、耗時短，以及適用于分析復(fù)雜生物樣品等優(yōu)點。隨著質(zhì)譜及其與不同色譜分離技術(shù)聯(lián)用的發(fā)展，通過質(zhì)譜分析可以獲得更詳細的鉑藥與蛋白質(zhì)結(jié)合的信息[28-29]，極大地促進了該領(lǐng)域的研究和發(fā)展[21]。在鉑藥物結(jié)合蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析中，鉑獨特的同位素分布有助于尋找產(chǎn)物中結(jié)合含鉑碎片的肽段。另外，鉑藥物結(jié)合的肽段豐度往往較低，而Pt(Ⅱ)藥物碎片通常具有2個正電荷，可顯著增強結(jié)合產(chǎn)物的離子化水平，有利于質(zhì)譜檢測。

表1 研究鉑類藥物與蛋白質(zhì)相互作用的分析方法概述Table 1 Overview of analytical strategies for investigating the interactions between platinum drugs and proteins

2.1 質(zhì)譜方法概述

質(zhì)譜常見的質(zhì)量分析器有四極桿、離子阱、飛行時間(TOF)、傅里葉變換離子回旋共振(FT-ICR)和軌道離子阱(Orbitrap)等。其中四極桿和離子阱質(zhì)量分析器的分辨率較低，很難滿足復(fù)雜蛋白質(zhì)體系分析的需要，在此不做詳細介紹。飛行時間質(zhì)譜的特點是全質(zhì)量軸掃描速度快，可以檢測的分子質(zhì)量范圍寬，質(zhì)量分辨率較高(可達7 000～40 000)，在蛋白質(zhì)和肽段分析領(lǐng)域，尤其是高通量蛋白質(zhì)組學(xué)肽段分析中取得了廣泛應(yīng)用。本課題組應(yīng)用“自下而上”的飛行時間質(zhì)譜分析研究了一種光活性四價鉑抗腫瘤化合物與硫氧還蛋白(Trx)等蛋白質(zhì)的相互作用，不僅能快速鑒定被Pt結(jié)合的肽段，并且還發(fā)現(xiàn)了被氧化的肽段。結(jié)合催化還原活性分析，發(fā)現(xiàn)該還原性蛋白的氧化損傷導(dǎo)致細胞內(nèi)ROS水平升高，可能是這種光活性四價鉑化合物抗腫瘤作用的主要機理，示于圖3a；通過分析肽段的二級質(zhì)譜，可以判斷出Pt結(jié)合位點及氨基酸殘基的氧化位點，示于圖3b。以上研究為闡明鉑類金屬抗癌化合物的作用靶點、分子作用機理以及毒副作用機制提供了重要依據(jù)[29]。

注：*表示一氧化肽段；oo表示雙氧化肽段圖3 光活性四價鉑化合物抗腫瘤的可能作用機理(a)和Pt結(jié)合位點及氨基酸殘基的氧化位點(b)Fig.3 Possible mechanism of anticancer activity for photoactivated Pt(Ⅳ) anticancer complex (a) and the binding site and oxidation site of Pt and amino acid residue (b)

FT-ICR和Orbitrap是兩種同時具有超高質(zhì)量分辨能力和質(zhì)量精度的高性能質(zhì)量分析器。它們前置碰撞誘導(dǎo)解離(CID)和電子俘獲解離(ECD)等裂解技術(shù)，可以提供大量肽段碎片進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，是表征蛋白質(zhì)共價或配位結(jié)合位點的有力手段。目前，F(xiàn)T-ICR-MS和Orbitrap-MS通常可以實現(xiàn)1×10-6的質(zhì)量精確度和105～106的質(zhì)量分辨率，通過與不同離子化方式和色譜分離技術(shù)聯(lián)用，已成為蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等研究領(lǐng)域質(zhì)譜分析的理想工具[31]。

O′Connor等[30]通過FT-ICR-MS表征了順鉑與多種蛋白質(zhì)的結(jié)合位點，證明順鉑對蛋白質(zhì)三維空間中相鄰的氨基酸殘基具有交聯(lián)能力，并結(jié)合ECD裂解技術(shù)進一步探索了順鉑與多肽的結(jié)合[32]。結(jié)果表明，順鉑可以交聯(lián)2個胰島素多肽，并可能與肽段中的多個位點結(jié)合生成多種構(gòu)象異構(gòu)體，這些構(gòu)象異構(gòu)體可以通過CID進行部分定位。需要說明的是，僅當肽段中存在Met時，Pt殘基才能與Lys、Arg上的氨基配位結(jié)合，因此含鉑殘基可能是從含S配體上轉(zhuǎn)移到Lys、Arg等氨基配體上的。

在探究鉑藥與蛋白質(zhì)相互作用的過程中，研究人員發(fā)展了“自下而上(bottom up)”和“自上而下(top down)”的質(zhì)譜分析方法[33]?！白韵露稀狈椒ㄏ韧ㄟ^酶(胰蛋白酶為主)將鉑-蛋白質(zhì)復(fù)合物水解為肽段，經(jīng)液相色譜分離后進行質(zhì)譜分析[34-35]。這種方法的優(yōu)點是便于自動操作，因為蛋白質(zhì)酶解成肽段發(fā)生在進樣之前，可以最大程度地減少儀器和管線對蛋白質(zhì)樣品的非特異性吸附，因此適合大規(guī)模的蛋白質(zhì)鑒定。而“自上而下”方法不需要酶解處理，直接選擇鉑-蛋白質(zhì)復(fù)合物的準分子離子為母離子，利用CID或ECD等裂解技術(shù)，將母離子裂解成碎片，通過分析這些碎片離子，鑒定藥物結(jié)合位點[36]。該方法的優(yōu)點是所鑒定的蛋白質(zhì)序列覆蓋率高，并且可以分析蛋白質(zhì)的翻譯后修飾位點[37-38]。

“自下而上”和“自上而下”方法均可以與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用。通過串聯(lián)質(zhì)譜獲得的結(jié)果信息更豐富，第一階段執(zhí)行離子分離，以選擇具有特定質(zhì)荷比的離子作為母離子，然后通過碰撞誘導(dǎo)產(chǎn)生碎片離子，或者通過電子轟擊、離子分子反應(yīng)、光解離等其他方式產(chǎn)生碎片離子；第二階段分離并檢測生成的產(chǎn)物離子[40-41]。串聯(lián)質(zhì)譜通常分為空間串聯(lián)多級質(zhì)譜(如三重四極桿質(zhì)譜(TSQ)、四極桿飛行時間(Q-TOF)質(zhì)譜、離子阱飛行時間質(zhì)譜(IT-TOF)等)和時間串聯(lián)質(zhì)譜(如離子阱質(zhì)譜等)[42]。鉑結(jié)合為肽段增加的電荷不僅有助于結(jié)合產(chǎn)物的檢測，而且使二級質(zhì)譜裂解更充分，便于歸屬修飾位點[32]，因此這些串聯(lián)質(zhì)譜在金屬藥物-蛋白質(zhì)相互作用分析中得到很好的應(yīng)用。本課題組在光活性四價鉑抗腫瘤化合物與硫氧還蛋白(Trx)等蛋白質(zhì)的相互作用研究中，使用FT-ICR-MS的二級質(zhì)譜表征了被Pt結(jié)合以及誘導(dǎo)氧化的氨基酸殘基位點，通過雙級串聯(lián)質(zhì)譜可以證明W31被雙氧化，而不是W28和W31分別被單氧化或W28被二氧化[29]，示于圖3b。Marto等[43]使用帶有納升電噴霧裝置的微毛細管HPLC色譜柱與傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀耦合，進行實時MS/MS多肽序列分析，這種組合的檢測限較低，在MS和MS/MS模式下均能保持高質(zhì)量分辨率(m/Δm>5 000)和質(zhì)量精度(約(5～10)×10-6)，因此非常適合蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

2.2 離子化技術(shù)

2.2.1電噴霧電離質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù) 電噴霧電離(ESI)作為一種傳統(tǒng)的軟電離技術(shù)，在藥物分析中廣泛應(yīng)用[44]。ESI可以很好地保留蛋白質(zhì)與金屬抗癌藥物之間配位結(jié)合的完整性[45]。Farrell等[46]通過ESI-MS研究了三齒配體的Pt(Ⅱ)配合物與人類免疫缺陷病毒(HIV)核衣殼蛋白(NCp7)之間的相互作用，證實該配合物比順鉑具有更高的反應(yīng)活性，可以與NCp7的C端鋅指結(jié)構(gòu)域形成1∶1的加合物。該結(jié)果為設(shè)計可與生物分子選擇性相互作用的新的Pt(Ⅱ)配合物提供了思路。

基于ESI的質(zhì)譜分析技術(shù)在單細胞水平也有很多與蛋白質(zhì)分析相關(guān)的應(yīng)用。Nano-ESI-MS以Nano-tip為取樣工具，通過與不同種類的ESI質(zhì)譜聯(lián)用進行檢測，Nano-tip的尖端口徑可以達到1～5 μm級別(甚至更小)，能檢測到zmol(10-21mol)量級的多肽，為單細胞分析提供了條件[47]。Masujima等[48]通過優(yōu)化Nano-ESI-MS方法，成功地檢測出RBL 2H3細胞(大鼠嗜堿性白血病肥大細胞)的胞漿和細胞內(nèi)特殊胞質(zhì)顆粒的化學(xué)成分差別，將改進后的方法稱為“實時單細胞視頻質(zhì)譜法”。之后，他們將此方法用于抗癌藥物他莫昔芬在HepG2細胞中的代謝研究。結(jié)果表明，未經(jīng)代謝的他莫昔芬在HepG2細胞的細胞質(zhì)和液泡中均能被檢測到，而他莫昔芬的代謝產(chǎn)物只能在細胞質(zhì)中被檢測到[49]。進一步優(yōu)化此方法，將來有望應(yīng)用于探究活體單細胞中鉑類抗癌藥物與蛋白質(zhì)的相互作用。

在蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域，與ESI-MS聯(lián)用的分離技術(shù)主要有基于凝膠電泳的分離系統(tǒng)和基于液相色譜的分離系統(tǒng)[50]。凝膠電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中占有重要地位[51]，但其面臨著一些方法學(xué)問題，包括無法檢測大量蛋白質(zhì)組中的微量成分，疏水蛋白(如膜結(jié)合蛋白和跨膜蛋白)難以溶解在樣品緩沖液中，蛋白質(zhì)分離過程的自動化和簡化相對困難，難以直接與生物質(zhì)譜聯(lián)用。與凝膠電泳相比，高效液相色譜(HPLC)技術(shù)具有高分辨率、高重現(xiàn)性及良好的質(zhì)譜兼容性等優(yōu)點，尤其是由多種色譜模式組成的多維液相色譜(MDLC)。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有高通量、高選擇性和高靈敏度等優(yōu)點，在藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)中受到越來越多的關(guān)注[52]。Liu等[27]通過HPLC-ESI-MS系統(tǒng)地研究了Cox17蛋白與鉑配合物和谷胱甘肽(GSH)復(fù)合物的相互作用。Farrell等[53]通過LC-MS研究了多核鉑配合物與人血清白蛋白的相互作用，揭示了這種“非共價”化合物不同于嵌入和小凹槽結(jié)合的新模式，并鑒定出HSA上鉑的結(jié)合位點為Cys-34和Met-298，分別位于蛋白質(zhì)亞結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ中。Sheldrick等[54]結(jié)合多維液相色譜和電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜法，分析了順鉑和大腸桿菌細胞中蛋白質(zhì)之間的相互作用。在CID裂解條件下，產(chǎn)生了大量胰蛋白酶酶解肽段的b+和y+肽離子，最終鑒定出31種鉑化蛋白質(zhì)，其中6種在大腸桿菌細胞中含量很高。此外，通過對結(jié)合位點的分析，在18種蛋白質(zhì)中，羧酸(D、E)、羥基(S、T、Y)的氧原子和甲硫基(M)的S原子被鑒定為Pt配位點。

本課題組開發(fā)了一種功能化的金納米顆粒親和探針，從細胞蛋白質(zhì)提取液中捕獲、分離、識別鉑類抗癌藥物損傷DNA的蛋白質(zhì)，繼而以HPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)鑒定捕獲的蛋白質(zhì)。這種聯(lián)用技術(shù)使用具有優(yōu)異水溶性和大表面積且高度分散的功能化金納米探針，僅需要少量細胞裂解物就可以在均質(zhì)溶液中進行目標蛋白質(zhì)的捕獲和分離，大大提高了質(zhì)譜對鉑類損傷DNA識別蛋白質(zhì)分析的靈敏度[55]。近期，本課題組將順鉑損傷的DNA片段共價交聯(lián)在磁性納米顆粒上，構(gòu)建藥物損傷DNA親和探針捕獲分離DNA損傷識別蛋白，結(jié)合HPLC-MS/MS分析進一步提高了蛋白質(zhì)鑒定的覆蓋率[56]。

2.2.2基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI-MS) 基質(zhì)輔助激光解吸電離具有靈敏度高、操作簡單、重復(fù)性好、樣品容量大等優(yōu)點，適合分析大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)和金屬藥物的反應(yīng)產(chǎn)物。有研究比較了在金屬抗癌藥物與蛋白質(zhì)的相互作用中，MALDI和ESI兩種軟電離質(zhì)譜方法表征的差異[57]。

MALDI-MS作為一種空間分辨、無標記的分析技術(shù)，可直接對生物樣品進行成像分析，在藥物組織成像的應(yīng)用中具有很大的優(yōu)勢。特別是在藥物治療的組織中，利用MALDI-MS可以靈敏地表征藥物及其代謝物在組織中的分布。Caprioli等[58]首次將MALDI-MS用于組織成像，并表征了生物組織中各種蛋白質(zhì)的分布。MALDI-MS在表征金屬抗癌藥物與蛋白質(zhì)之間形成的加合物以及確定可能的反應(yīng)機理具有重要應(yīng)用。

2.2.3電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)及其聯(lián)用技術(shù) ICP-MS早期只是一種分析無機元素和同位素的技術(shù)，具有極低的檢測限、良好的重現(xiàn)性，從最初出現(xiàn)，便迅速取代原子發(fā)射光譜成為金屬定量分析的首選。在分析生物樣品時，無論金屬元素和生物分子以何種方式結(jié)合，在通過高溫等離子體時均可以幾乎完全地被分解成原子狀態(tài)并電離，因此可以準確地對生物樣品中的微量金屬元素進行定量分析。ICP-MS與其他技術(shù)的聯(lián)用結(jié)合發(fā)展出了許多新的分析手段，如柱凝膠電泳(GE)、尺寸排阻色譜(SEC)、湍流色譜法(TFC)和激光剝蝕法(LA)等[59]。

凝膠電泳所需的樣品消耗量少、分辨率較高，是蛋白質(zhì)分離和分析的常用方法之一[60]。如果把凝膠電泳做成柱狀，并與ICP-MS結(jié)合使用，可以準確定量被GE分離的蛋白質(zhì)中的金屬元素，還可以方便地與蛋白質(zhì)組學(xué)和金屬組學(xué)相結(jié)合，為同時監(jiān)測細胞內(nèi)金屬及其相關(guān)蛋白提供了獨特的解決策略，示于圖4[61]。Sun等[62]以大腸桿菌細胞中過表達的2種幽門螺旋桿菌金屬伴侶蛋白HypA和HspA為例，研究了GE-ICP-MS系統(tǒng)定量分析細胞內(nèi)金屬結(jié)合蛋白質(zhì)的方法，通過平行檢測金屬和硫信號，可以精確地定量細胞內(nèi)金屬蛋白的化學(xué)計量比，該方法在探測胞內(nèi)鉑類藥物結(jié)合的蛋白質(zhì)方面具有很大潛力。

圖4 GE與ICP-MS聯(lián)用裝置和圖譜解析示意圖[61]Fig.4 Illustration of the gel-electrophoresis-ICP-MS system and the workflow of the assignments of the chromatogram[61]

早在1999年，尺寸排阻色譜[63]與電感耦合等離子體質(zhì)譜相結(jié)合，即可確定血清中金屬藥物的含量[64]。Buckley等[65]用這種方法監(jiān)測和鑒定血漿蛋白和卡鉑的復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)卡鉑主要與血漿蛋白中的白蛋白和γ球蛋白結(jié)合。之后，Dyson等[66]使用相同技術(shù)研究了順鉑與血清白蛋白、白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)金屬結(jié)合取決于蛋白質(zhì)濃度和樣品的孵育時間。湍流色譜法配有大的多孔顆粒固定相和超高流速流動相，可以使蛋白質(zhì)大分子平穩(wěn)地通過固定相，一些小分子與固定相相互作用后被洗脫液洗脫，適合高通量分析[67]。Hann等[68]利用TFC-ICP-MS研究了一種鉑金屬候選藥物與人血清白蛋白之間的相互作用。結(jié)果表明，該藥物不與人血清白蛋白發(fā)生相互作用，然而，在人血漿中孵育后保留在TFC上的鉑減少，表示鉑進入血漿后形成了游離的極性代謝物或?qū)ρ獫{蛋白具有高親和力的代謝物。

激光剝蝕-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(LA-ICP-MS)是一種無機元素成像方法[69]。利用該方法，研究人員發(fā)現(xiàn)了順鉑在腎皮質(zhì)與皮質(zhì)髓質(zhì)交界處的積累，并推測順鉑的積累與腎臟損害之間的相關(guān)性[70]，示于圖5。Hartinger等[71]通過甘油處理干燥凝膠，對整個凝膠中的鉑進行成像，并在二維DE凝膠中制作了第一個完整的基于LA-ICP-MS的Pt等高線圖。他們還結(jié)合膠上酶解技術(shù)，檢測到了順鉑孵育的腎臟近曲小管上皮細胞(RPTECs)中的多種鉑結(jié)合蛋白，這些蛋白可能與藥物導(dǎo)致的腎毒性有關(guān)。

圖5 基于激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜的大鼠全腎臟Pt的生物成像示意圖[70]Fig.5 Biological imaging for the distribution of Pt in full rat kidney based on LA-ICP-MS[70]

2.2.4二次離子質(zhì)譜(SIMS) 質(zhì)譜成像技術(shù)可以獲取細胞水平上有價值的信息，其中二次離子質(zhì)譜成像可以提供亞微米范圍內(nèi)的化學(xué)信息，在單細胞分析中顯示出巨大的潛力[72-73]。SIMS具備檢測多種元素及其同位素的能力，在元素成像模式下，檢測限可以達到1～1 000 ng/g。通過SIMS不僅可以得到樣品表面成分的質(zhì)譜圖，還可以對樣品表面的多種元素或組分進行同時成像分析，具有空間分辨率高、化學(xué)專一性強、免標記、靈敏度高等優(yōu)點[74]。

為研究順鉑作用于腫瘤細胞的分子機理，Keppler等[75]應(yīng)用nano-SIMS成像技術(shù)表征了15N標記的順鉑在樹脂包埋的人類結(jié)腸癌細胞超薄(300 nm)切片中的亞細胞分布。近期，本課題組開發(fā)了一種單細胞成像策略，在前期開發(fā)的一種方便實用的可尋址細胞樣品板上[76]，先以激光共聚焦顯微成像定位細胞內(nèi)熒光標記的特定蛋白質(zhì)，再以飛行時間-二次離子質(zhì)譜(TOF-SIMS)成像可視化金屬抗腫瘤藥物在同一細胞內(nèi)的分布，實現(xiàn)了原位直接觀察藥物分子和靶蛋白相互作用的單細胞原位研究，示于圖6a[77]。該方法不僅可以觀察到細胞內(nèi)HMGB1蛋白質(zhì)與順鉑損傷DNA的特異性結(jié)合，還發(fā)現(xiàn)了一種細胞轉(zhuǎn)錄因子SMAD3在順鉑孵育后不再與DNA結(jié)合，其轉(zhuǎn)錄活性明顯下降。這是首次應(yīng)用質(zhì)譜成像方法在單細胞水平上觀察到順鉑與生物大分子的相互作用。本課題組[78]還通過密碼子拓展-非天然氨基酸插入技術(shù)，用含F(xiàn)的三氟甲基苯丙氨酸(Tf-Phe)化學(xué)標記特定蛋白質(zhì)，然后通過TOF-SIMS在單細胞水平原位可視化該蛋白。通過在原核和真核細胞中對Tf-Phe修飾的GFP進行成像，驗證了該方法的有效性，并將其應(yīng)用于大腸桿菌CheA蛋白質(zhì)和HeLa細胞中DNA結(jié)合蛋白HMGB1的可視化，示于圖6b。分別對來自抗癌藥物順鉑的[PtCN]-和DNA的[PO3]-離子同時成像，實現(xiàn)了在單細胞水平原位探索HMGB1和順鉑損傷DNA之間的識別和相互作用。由于這種質(zhì)譜成像的可視化方法不需要化學(xué)修飾或標記藥物分子，對蛋白質(zhì)分子標記的化學(xué)結(jié)構(gòu)變化也較小，因此可以擴展到原位研究小分子藥物與其在細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)靶標的相互作用，有望成為藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域中的通用且有效的研究工具。

圖6 金屬抗腫瘤藥物損傷DNA的相互作用蛋白的可視化分析(a)[77]，使用TOF-SIMS成像在單細胞水平上分析目標蛋白質(zhì)(b)[78]Fig.6 Workflow of the confocal imaging and TOF-SIMS imaging for the visualization of Pt-DNA-protein interaction in a single cell (a)[77], and workflow of the analysis of protein by TOF-SIMS in single cells (b)[78]

3 蛋白質(zhì)與順鉑的相互作用研究

順鉑的耐藥性被認為是阻礙其更有效臨床應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一[79]。目前研究認為，順鉑進入人體后，主要以主動運輸和被動擴散2種形式運輸和攝取[80]。導(dǎo)致順鉑耐藥性的主要原因有3個：順鉑轉(zhuǎn)運進細胞內(nèi)的途徑被阻礙；順鉑損傷的DNA被修復(fù)；順鉑排出細胞的途徑被增強。目前普遍認為，順鉑-蛋白質(zhì)交聯(lián)可能降低順鉑與DNA相互作用的水平，增加其毒副作用，繼而降低順鉑的作用效率。

3.1 血漿蛋白

3.1.1血清白蛋白 在人體血漿蛋白中，人血清白蛋白(HSA)約占總血清蛋白含量的52%。正常情況下，白蛋白在血漿中的含量大約為40 g/L，是血清中含量最高的蛋白質(zhì)。HSA由一條包含585個氨基酸的單鏈組成，多肽鏈以螺旋構(gòu)象為主，單鏈包含3個同源結(jié)構(gòu)域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，每個結(jié)構(gòu)域都含有2個結(jié)構(gòu)相似的子區(qū)域[81]。

HSA的主要功能是運輸脂肪酸，也能夠結(jié)合各種代謝物和藥物[82]，可介導(dǎo)某些內(nèi)源性和外源性化合物之間的轉(zhuǎn)化，參與血液中各種金屬離子，包括銅、鋅和鈣的運輸[83]。HSA與某些藥物的結(jié)合會影響其代謝和分布，降低藥物的活性濃度、影響臨床功效，因此抑制藥物與HSA的結(jié)合是藥物開發(fā)的重要目標[84]。

研究表明，HSA可與順鉑在不同位點結(jié)合。最初研究人員認為，順鉑的結(jié)合位點為HSA的Cys34位置，順鉑與含巰基配體具有很高的反應(yīng)活性。之后的光譜和色譜研究表明，順鉑與HSA的反應(yīng)可形成與S，N配位的大環(huán)螯合，該螯合位點包括HSA表面暴露的Met298殘基、Cys34以及其他Met殘基，研究人員推測HSA的Met298是順鉑主要的結(jié)合位點，Met87和Met446是次要的結(jié)合位點[85]。除此之外，N-供體His67、His128、His247[86]和O-供體氨基酸Tyr150(或Tyr148)和Asp375(或Glu376)[87]也被鑒定為順鉑在HSA的可能結(jié)合位點，示于圖7。His67和His247殘基與順鉑的交聯(lián)可抑制Zn2+與HSA的結(jié)合，所以順鉑治療可能會導(dǎo)致患者出現(xiàn)鋅缺乏、低鋅血癥和高尿鋅癥[86]。非甾體類抗炎藥(NSAIDs)可降低順鉑與HSA的結(jié)合，從而使血清中游離順鉑的水平得到提升[88]。

圖7 HSA中順鉑可能的結(jié)合位點[87] Fig.7 Binding sites of cisplatin with HAS[87]

一般認為HSA與順鉑的交聯(lián)是不可逆的，因此通常并不關(guān)注于構(gòu)建基于該交聯(lián)的藥物庫[89]。但早期許多研究表明，順鉑與HSA的交聯(lián)在臨床上有積極效果，順鉑-HSA形成交聯(lián)后給藥，腫瘤區(qū)域的鉑濃度增加[90]，交聯(lián)物給藥3次后喉癌可被緩解[12]。

3.1.2人轉(zhuǎn)鐵蛋白 人轉(zhuǎn)鐵蛋白(hTf)包含679個氨基酸，分子質(zhì)量約為80 kDa，血液濃度約為2.5 g/L。每個hTf蛋白分子都可以結(jié)合2個Fe3+離子[91]。由于hTf受體經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞中過表達，因此已作為靶向腫瘤細胞的藥物靶點進行研究[92]。hTf中的順鉑結(jié)合位點最初被鑒定為Met256和Met499，兩者都與Pt(Ⅱ)形成單齒配合物[93]。質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，順鉑不僅可以結(jié)合含硫的氨基酸殘基Met256，還可以結(jié)合含氧的氨基酸殘基Tyr136、Tyr317 以及含氮的氨基酸殘基His273、His578[94]。還有研究報道表明，順鉑通過Thr457與hTf結(jié)合形成蛋白加合物[95]。在使用鉑類藥物療法時，順鉑-hTf復(fù)合物的形成可以顯著減輕藥物本身的毒性并改善選擇性[19]。研究顯示，以順鉑-hTf(10∶1)復(fù)合物給藥時，人肝細胞癌HepG2細胞對順鉑的攝入水平上升，而且誘導(dǎo)細胞凋亡的能力也有所增強[96]。分別使用順鉑-apo-hTf結(jié)合后的復(fù)合物和順鉑處理HepG2細胞后，兩組細胞表現(xiàn)出明顯的蛋白表達差異，表明順鉑與apo-hTf結(jié)合形成的復(fù)合物與順鉑的作用機理不同。與順鉑-HSA復(fù)合物相比，相同Pt(Ⅱ)含量的Pt-hTf復(fù)合物在體外顯示出高10倍以上的細胞毒性[97]。

3.2 線粒體蛋白系列

線粒體在調(diào)節(jié)細胞凋亡中起著重要作用。研究表明，線粒體與順鉑的作用機制有關(guān)，鉑類藥物可以在線粒體蛋白上大量積聚，線粒體中鉑類藥物濃度的增加可以促進腫瘤細胞的凋亡[98]。因此，鉑類藥物與線粒體蛋白的相互作用可能對其抗癌機制影響很大。

3.2.1細胞色素C 細胞色素C是一種較小的水溶性蛋白，通常位于線粒體膜間隙中，其結(jié)構(gòu)中含有潛在的Pt結(jié)合位點(甲硫氨酸和組氨酸等)，被廣泛用于研究鉑類藥物與蛋白質(zhì)的相互作用[99]。大多數(shù)鉑類藥物與細胞色素C反應(yīng)的分析都側(cè)重于鑒定藥物-蛋白質(zhì)復(fù)合物作為藥物助劑，并鑒別細胞色素C上的鉑結(jié)合位點。利用ESI-MS分析順鉑及其類似物與細胞色素C的反應(yīng)，可以推測出各種形式的鉑結(jié)合殘基，如[Pt(NH3)2Cl]+、[Pt(NH3)2H2O]2+、[Pt(NH3)2]2+和[Pt(NH3)2]2+等，示于圖8[100]。進一步利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用研究表明，細胞色素C與鉑結(jié)合的位點可能為Glu61、Glu62、Thr63、Met65和Met80[51]，這些結(jié)合可能會改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象并導(dǎo)致其功能障礙。細胞色素C中Met65作為順鉑的主要結(jié)合位點，可能導(dǎo)致細胞色素C的構(gòu)象紊亂和局部解折疊，從而影響其生物學(xué)活性[101]。順鉑可導(dǎo)致細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)中，而細胞色素C在細胞凋亡中起著重要作用，所以此過程可導(dǎo)致線粒體呼吸作用的變化并使細胞凋亡[102]。

圖8 順鉑和細胞色素C復(fù)合物的ESI-MS譜圖[100]Fig.8 ESI-MS spectrum of the binding complex of cisplatin and cytochrome C[100]

3.2.2Cox17 Sco1、Cox17和Cox11等蛋白質(zhì)在向線粒體轉(zhuǎn)運Cu(Ⅰ)中起著重要作用[103]。其中Cox17蛋白位于線粒體膜間區(qū)，具有3種不同的氧化還原狀態(tài)：氧化態(tài)(Cox173S-S，具有3個二硫鍵)，還原態(tài)(Cox170S-S，沒有二硫鍵)以及中間態(tài)(Cox172S-S，具有2個二硫鍵)。當細胞攝取銅后，銅通過Cox172S-S、Sco1和Cox11轉(zhuǎn)移至細胞色素C氧化酶[104]。由于Cox17在某些腫瘤細胞(如非小細胞肺癌細胞)中過表達，因此該蛋白被認為是抗癌藥物(如順鉑)治療的靶標[105]?；贔T-ICR-MS的順鉑與apo-Cox172S-S的相互作用研究表明，順鉑可與apo-Cox172S-S的Cys26或Cys27殘基結(jié)合，其中Cys27也是apo-Cox172s-s中銅離子的結(jié)合位點[106]。ESI-MS以及液相色譜分析表明，順鉑還能與apo-Cox172s-s的Met4、Cys27和His47殘基結(jié)合，其中Met4是主要的結(jié)合位點[107]。

3.3 銅相關(guān)蛋白系列

鉑類藥物需要依靠人體的運輸系統(tǒng)進入人體。由于Cu(Ⅰ)和Pt(Ⅱ)具有較相似的配位活性，銅相關(guān)蛋白與鉑藥物的相互作用被廣泛研究。人體內(nèi)的CTR1、Atox1、Cox17、ATPase和其他銅相關(guān)蛋白可能參與鉑類藥物的吸收、轉(zhuǎn)運和細胞外排，對鉑類抗癌藥物的活性調(diào)控起到了重要作用。

3.3.1銅轉(zhuǎn)運蛋白 銅轉(zhuǎn)運蛋白1(CTR1)是一種進化上保守的銅攝取轉(zhuǎn)運蛋白，廣泛存在于動物、植物和真菌中。人體中銅轉(zhuǎn)運蛋白1(hCTR1)主要存在于質(zhì)膜上，由3個跨膜螺旋、1個胞外N端結(jié)構(gòu)域和1個胞內(nèi)C端結(jié)構(gòu)域組成。這3個不同的結(jié)構(gòu)域都包含銅結(jié)合位點，配位結(jié)合轉(zhuǎn)移被認為是銅運輸中的重要步驟[108]。

hCTR1的細胞外N端結(jié)構(gòu)域含有2個富含甲硫氨酸的結(jié)構(gòu)，是鉑類藥物潛在的結(jié)合位點。hCTR1的N端結(jié)構(gòu)域缺失可降低細胞對順鉑的攝取[109]，并增強對順鉑毒性的耐受[110]。研究酵母細胞中CTR1的模型肽與順鉑的反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，甲硫氨酸是主要的結(jié)合位點，示于圖9[111]，當順鉑與模型肽的物質(zhì)的量比為1∶1反應(yīng)時，鉑的主要結(jié)合位點為Met7[112]。小細胞型肺癌細胞的跨膜金屬結(jié)合殘基(Met150和Met154)的突變直接使該細胞無法攝取順鉑[113]。

圖9 人銅轉(zhuǎn)運蛋白1將順鉑轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)并激活[111]Fig.9 Human copper transporter 1 (hCTR1) transports cisplatin into the cell and activateit[111]

3.3.2銅伴侶蛋白1 除hCTR1與順鉑的結(jié)合外，銅伴侶蛋白1(Atox1)也可以與鉑結(jié)合，調(diào)節(jié)順鉑在細胞內(nèi)的積累并將其轉(zhuǎn)移至ATP7A和ATP7B的金屬結(jié)合域[114]。Atox1是由68個氨基酸殘基組成的可溶性蛋白，在其C端有1個富含賴氨酸的核定位信號肽KKTGK。當Atox1與Cu結(jié)合時，Atox1通過信號肽被引導(dǎo)進入細胞核并充當轉(zhuǎn)錄因子[115]。Atox1蛋白質(zhì)保守序列的2個半胱氨酸可以與1個Cu(Ⅰ)結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，當敲除Atox1后，細胞ATP水平和脂肪形成受到影響，進而抑制腫瘤細胞的增殖及生長[116]。

研究人員在培養(yǎng)Atox1轉(zhuǎn)染的大腸桿菌過程中添加順鉑，然后電泳分離Atox1，通過ICP-MS可檢測到蛋白質(zhì)中的Pt。NMR結(jié)果表明，順鉑與Atox1的結(jié)合會引起Cys12、Cys15和Ala16的化學(xué)位移發(fā)生變化，示于圖10[26]，表明順鉑的結(jié)合位點很可能在這個位置。

圖10 核磁共振波譜研究順鉑和Atox1的細胞內(nèi)藥物傳遞和相互作用[26]Fig.10 Intracellular drug transport and interaction of cisplatin and Atox1 studied by NMR[26]

鉑化的Atox1蛋白可以調(diào)節(jié)鉑藥物在細胞中的聚集，同時利用銅穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)促進鉑藥物的細胞攝取并影響鉑藥物在細胞中的分布[117-118]。敲除Atox1可以減少順鉑代謝過程中被細胞攝取的順鉑量，從而導(dǎo)致順鉑在DNA上的結(jié)合減少。Atox1可以與CTR1的C端相互作用，引起CTR1泛素化和蛋白酶水解。但是在敲除Atox1的細胞中，順鉑引起的CTR1表達下調(diào)受到抑制[119]。有研究表明，Atox1可以將順鉑轉(zhuǎn)移到ATPase的金屬結(jié)合域，Atox1過表達可能會促使更多的順鉑被ATP7A/B結(jié)合，進而泵出細胞[120]。體外研究表明，無論Atox1在實驗最開始時是否含有銅離子，順鉑都會與Atox1相互作用；近紫外圓二色性譜表明，當Atox1含有銅離子時，銅與鉑會相互作用；NMR結(jié)果表明，順鉑與Atox1的結(jié)合會使該蛋白質(zhì)展開并聚集；細胞系研究表明，Atox1的表達與順鉑耐藥有關(guān)[120]。

3.3.3銅運輸?shù)鞍?鉑類藥物在體內(nèi)產(chǎn)生耐藥性的主要原因之一是細胞內(nèi)藥物累積量的減少[121]。研究發(fā)現(xiàn)，銅運輸?shù)鞍卓蓪㈨樸K隔離在囊泡中或排出細胞，從而產(chǎn)生順鉑耐藥性[122]。P型陽離子轉(zhuǎn)運蛋白ATPase(包括ATP7A和ATP7B)定位于高爾基體的內(nèi)膜上，二者具有54%的同源性。ATP7A/7B由3部分組成：N端的金屬結(jié)合區(qū)域、跨膜區(qū)域和C端區(qū)域。N端區(qū)域包括6個金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NMBD)，每個金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含1個可與銅相互作用的CXXC序列[123]。ATP7A和ATP7B的金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有類似于Atox1的結(jié)構(gòu)，并且具有與鉑類藥物結(jié)合的能力。研究表明，ATP7B可以直接與順鉑結(jié)合并將其轉(zhuǎn)運至亞細胞囊泡；當ATP7B金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域的保守序列CXXC突變?yōu)镾XXS時，該蛋白質(zhì)喪失了轉(zhuǎn)運銅或順鉑的能力，并且細胞的耐藥性降低[124]。與此相對應(yīng)的是，ATPase蛋白質(zhì)的過表達將會增強細胞對順鉑類藥物的耐藥性[125]。在ATP存在時，順鉑、奧沙利鉑可以與ATP7A的N端金屬結(jié)合域結(jié)合，并使銅結(jié)合時發(fā)生的電荷轉(zhuǎn)移得到增強。如果對ATP7A的第6個NMBD中的銅結(jié)合位點(C575A/C578A)進行突變，不僅會影響與鉑的結(jié)合，還會抑制ATP相關(guān)的電荷轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致催化活性喪失[125]。

3.4 雞蛋清溶菌酶

雞蛋清溶菌酶(HEWL)由129個氨基酸殘基構(gòu)成，分子質(zhì)量約為14 kDa，具有4個二硫鍵的HEWL具有很高的穩(wěn)定性，因此，通常作為模型蛋白質(zhì)研究金屬藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合[126]。結(jié)合ESI-MS測定金屬-蛋白質(zhì)加合物的化學(xué)計量比，X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)，順鉑與HEWL之間的主要結(jié)合位點為His15[127]。順鉑與HEWL的結(jié)合過程相當緩慢，但二甲基亞砜(DMSO)可以促進順鉑以及卡鉑與His15中咪唑基團上的N原子結(jié)合[128]。此外，溫度也會影響順鉑與蛋清溶菌酶的相互作用：在20、37、55 ℃等不同溫度的純水系統(tǒng)中，更高的溫度會促進反應(yīng)過程中順鉑-蛋清溶菌酶加合物的形成，還會促使順鉑的Pt原子與Arg14的N原子成鍵結(jié)合。因此，體溫升高可能會增加藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合率，從而增強與順鉑給藥相關(guān)的毒副作用[129]。

3.5 金屬硫蛋白

金屬硫蛋白(MT)是一種具有金屬結(jié)合能力和高誘導(dǎo)性的低分子質(zhì)量含硫金屬蛋白。該蛋白在進化上高度保守，主要由4個高度保守的異構(gòu)體(MT-1/-2/-3/-4)組成[130]。MT-1和MT-2廣泛存在于大多數(shù)哺乳動物的內(nèi)臟器官中，可以在細胞因子和金屬作用下誘導(dǎo)產(chǎn)生，而MT-3和MT-4僅存在于一些特定的組織中，不能被誘導(dǎo)產(chǎn)生。目前已經(jīng)在多種癌癥中發(fā)現(xiàn)了MT-3的過表達[130]。MT具有較低的分子質(zhì)量(7 000 Da)，分為α-簇和β-簇2個不同的金屬結(jié)合域，約含有61個氨基酸，其中20～21個氨基酸為半胱氨酸，占比較高。這些半胱氨酸殘基上的巰基對許多重金屬具有高親和力，對銅、鋅等生命必需金屬元素起到調(diào)節(jié)作用，對鎘、汞等有害金屬具有抑制和解毒作用。質(zhì)譜研究表明，每個MT分子最多可以結(jié)合12個順鉑分子，并且順鉑的4個配體都會離去，鉑中心原子僅以裸Pt(Ⅱ)的形式結(jié)合到蛋白上[131]。這主要是巰基配體的對位效應(yīng)，順鉑的氯配體被巰基的硫取代后，其對位的氨基變得不穩(wěn)定，很快也被取代，因此最終產(chǎn)物通常是4個巰基配位的Pt(Ⅱ)。

研究人員通過比較12種順式/反式Pt(Ⅱ)化合物與Zn7-MT-2的相互作用發(fā)現(xiàn)，反式Pt(Ⅱ)化合物與Zn7-MT-2的反應(yīng)比順式Pt(Ⅱ)化合物快，但反式Pt(Ⅱ)化合物保留了N-供體配體，因此保留了其潛在的活性形式，示于圖11[131]。有研究表明，隨著鉑類藥物劑量的增加，腫瘤細胞的MT含量逐漸增加，MT含量的增加可導(dǎo)致順鉑治療效果降低，但如果順鉑定量分批給藥，則治療效果顯著提高[132]。另外，MT可以清除細胞內(nèi)一定量的ROS，因此對順鉑誘導(dǎo)的腎毒性有一定的抵抗作用[133]。MT在癌細胞產(chǎn)生對順鉑耐藥性的作用超過了對順鉑的解毒作用[134]，而MT與金屬抗腫瘤藥物的相互作用對藥物療效的總體利弊還需要進一步評估。

圖11 人Zn7-MT-2與順鉑(a)及反鉑(b)的配位結(jié)合反應(yīng)機理圖[131]Fig.11 Binding reaction mechanisms of human Zn7-MT-2 with cisplatin (a) and transplatin (b)[131]

3.6 鋅指蛋白系列

鋅指蛋白最初發(fā)現(xiàn)于非洲爪蛙卵母細胞中，是指由一系列鋅指結(jié)構(gòu)組成的蛋白質(zhì)。鋅指結(jié)構(gòu)中約含30～40個氨基酸殘基，主要由組氨酸(His)和半胱氨酸(Cys)組成，因此，具有金屬結(jié)合位點。鋅指結(jié)構(gòu)中，鋅離子(Zn2+)位于中心位置，周圍的氨基酸可自我折疊形成“手指”結(jié)構(gòu)，根據(jù)主要氨基酸序列的不同，可分為Cys2His2、Cys2HisCys和Cys2Cys2主要的鋅指基序(ZnF)。在人類蛋白質(zhì)組中，最常見的ZnF為Cys2His2。不同的ZnF可賦予蛋白質(zhì)與不同生物分子相互作用的能力，包括DNA識別、RNA包裝、轉(zhuǎn)錄激活、細胞凋亡調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)折疊等。此外，一些鋅指蛋白與真核基因表達調(diào)控密切相關(guān)[135]。以下將詳細介紹帶有鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白與鉑類抗癌藥物的相互作用。

3.6.1乳腺癌敏感蛋白1 乳腺癌敏感蛋白1(BRCA1)是一種參與細胞DNA修復(fù)和維護基因序列完整性的重要蛋白，該蛋白失活可以使腫瘤模型小鼠對順鉑的敏感性增加[136]。研究表明，apo形式的BRCA1可以優(yōu)先與順鉑相互作用，并在His117位點結(jié)合[137]，導(dǎo)致蛋白構(gòu)象變化，增強蛋白的熱穩(wěn)定性。該研究組還發(fā)現(xiàn)，BRCA1與鉑類化合物的結(jié)合可以抑制E3泛素連接酶活性并誘導(dǎo)泛素濃度的變化[138]，因而利用順鉑抑制泛素-蛋白酶活性的途徑，可使順鉑具有更強的細胞毒性。但由于臨床上無抗癌活性的反鉑比順鉑更能抑制BRCA1的泛素連接酶活性，因此，單獨抑制BRCA1不足以起到抗癌活性作用[138]。

3.6.2Sp1轉(zhuǎn)錄因子 Sp1轉(zhuǎn)錄因子是一種Cys2His2型鋅指蛋白。Sp家族蛋白參與多種基因的調(diào)控，包括細胞周期、增殖、分化和凋亡[139]。Sp1轉(zhuǎn)錄因子的C端具有3個連續(xù)的Cys2His2型鋅指結(jié)構(gòu)域，是非常保守的DNA結(jié)合域，可特異性識別富含GC/GT序列的DNA啟動子區(qū)域，從而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄過程。Sp1轉(zhuǎn)錄因子在許多腫瘤組織中過表達或異常激活，并且通過調(diào)節(jié)一系列腫瘤細胞相關(guān)基因的表達，在腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成中起著重要作用[140]。劉揚中課題組研究發(fā)現(xiàn)，反式噻唑鉑化合物(trans-PtTz)的配位結(jié)合對Sp1轉(zhuǎn)錄因子的二級結(jié)構(gòu)有很大影響，可破壞其鋅指結(jié)構(gòu)，從而影響這種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)其相關(guān)基因的表達。這一機理可能與trans-PtTz的活性機制有關(guān)，進一步豐富了鉑類配合物的抗癌機制[141]。

3.6.3聚(ADP-核糖)聚合酶 聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)是一種Cys3His型鋅指蛋白，在DNA修復(fù)中起著關(guān)鍵作用[142]。其中，PARP-1是一種113 kDa的蛋白質(zhì)，包含1個具有2個鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、1個自動修飾結(jié)構(gòu)域和1個催化結(jié)構(gòu)域。有實驗表明，接觸了順鉑損傷DNA的PARP可以解離DNA結(jié)合蛋白，而PARP抑制劑可以在部分腫瘤細胞系中增強順鉑的抗癌活性[143]。在順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡中，DNA損傷嚴重時，PARP蛋白會耗盡細胞儲備的NAD+，導(dǎo)致糖酵解代謝停止，進而使癌細胞壞死[144]。

3.7 超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)的金屬抗氧化劑酶，可以催化超氧陰離子自由基歧化形成氧和過氧化氫，在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用。根據(jù)超氧化物歧化酶中金屬基團的差別，可以將SOD大致分為Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD 3類。SOD對自由基引起的炎癥、自身免疫、心血管和腦血管疾病的治療具有重要作用[145]。

超氧化物歧化酶1(SOD1)的過表達是卵巢癌中順鉑耐藥的相關(guān)因素之一。有研究表明，靶向抑制SOD1的活性有助于克服卵巢癌細胞對順鉑的耐藥性[146]。如果將SOD1敲掉，可以使順鉑耐藥的卵巢癌細胞重新變得敏感，因此SOD1可以作為化療藥物增敏的潛在靶點[147]。另一方面，相較于過氧化氫酶的過表達，Mn-SOD的過表達對順鉑導(dǎo)致的人胚胎腎293細胞損傷具有修復(fù)作用，降低了對正常細胞的傷害。有研究顯示，如果給腫瘤模型小鼠體內(nèi)注射SOD1類似物，可以聚集在腎近曲小管上皮細胞中，歧化超氧自由基，從而修復(fù)或降低順鉑導(dǎo)致的毒副作用[148]。上述結(jié)果表明了超氧自由基等活性氧物種和超氧化物歧化酶在順鉑引起的腎損傷機制中的重要意義。

人超氧化物歧化酶1(hSOD1)是銅伴侶蛋白的最終靶點之一[149]，該蛋白質(zhì)表面上有2個半胱氨酸(Cys6和Cys111)，Cys6僅部分暴露于溶劑中，而Cys111完全暴露[150]。hSOD1存在于線粒體膜間隙和細胞質(zhì)中[151]，少量存在于細胞核和過氧化物酶體中。X-射線晶體結(jié)構(gòu)解析結(jié)果表明，順鉑可以在hSOD1聚集體的界面邊緣處與2個Cys111中的任意1個結(jié)合，示于圖12，但由于空間較小，不足以使2個順鉑同時結(jié)合到2個Cys111上。順鉑結(jié)合后可抑制脫去金屬氧化型hSOD1的聚集，在體外和細胞內(nèi)均能溶解并使氧化型hSOD1的寡聚體分解成單體[152]。

3.8 鈉/鉀磷酸酯酶

鈉/鉀磷酸酯酶(Na+/K+-ATPase)也稱為鈉鉀泵，是一種重要的跨膜離子通道蛋白，可將細胞外相對較低濃度的鉀離子泵入細胞，并將細胞內(nèi)相對較低濃度的鈉離子泵出細胞。鈉鉀泵每水解消耗1個ATP分子，可以逆化學(xué)梯度泵出3個鈉離子和泵入2個鉀離子，保持膜內(nèi)高鉀、膜外高鈉的不均勻離子分布。研究發(fā)現(xiàn)，順鉑對鈉鉀泵的抑制導(dǎo)致離子梯度的崩潰，這可能是急性腎衰竭的重要原因[153]。該研究利用電化學(xué)和質(zhì)譜法發(fā)現(xiàn)，順鉑與鈉鉀泵的相互結(jié)合位點在其細胞質(zhì)一側(cè)C45 loop結(jié)構(gòu)的Cys367 殘基上。順鉑在該位置的結(jié)合形成空間位阻，導(dǎo)致臨近天冬氨酸Asp369的磷酸化/去磷酸化循環(huán)受阻，可能是順鉑抑制鈉鉀泵活性的主要原因。

3.9 小結(jié)

鉑基抗癌藥物不僅能夠與DNA反應(yīng)，還可與富含半胱氨酸、甲硫氨酸和組氨酸殘基的多肽或蛋白質(zhì)配位結(jié)合。鉑類藥物與蛋白質(zhì)相互作用位點的研究必須和生物活性研究結(jié)合起來。若藥物與蛋白/肽之間的相互作用是不可逆的，則可導(dǎo)致藥物在組織中積聚，從而引起嚴重的毒副作用。因此，系統(tǒng)分析和研究細胞中可以與鉑基抗癌藥物相互作用的蛋白質(zhì)，有助于加深蛋白質(zhì)與藥物相互作用的理解，并明確藥物如何在細胞中發(fā)揮抗腫瘤活性，以及細胞抗藥性的產(chǎn)生和藥物作用機理。質(zhì)譜分析在這一前沿領(lǐng)域充分發(fā)揮了其速度快、所需樣品量少、可以精確判斷結(jié)合位點的優(yōu)勢，起到不可或缺的作用。部分研究嘗試在細胞內(nèi)尋找盡量多的順鉑結(jié)合蛋白。使用疊氮基團修飾的順鉑衍生物與釀酒酵母共同孵育，再用炔基修飾的微珠通過click反應(yīng)富集鉑結(jié)合蛋白，并用質(zhì)譜進行表征，發(fā)現(xiàn)了152種鉑結(jié)合蛋白，生物信息學(xué)分析表明其中一系列蛋白質(zhì)的鉑損傷與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激現(xiàn)象密切相關(guān)[154]。此類研究的開展對藥物致毒機理的揭示和降低毒副作用方法的設(shè)計具有重要意義。

注：藍色小球表示N；綠色小球表示Pt；黃色小球表示Cl圖12 順鉑結(jié)合脫金屬化hSOD1蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)[152]Fig.12 Crystal structure of cisplatin with apo-hSOD1[152]

4 總結(jié)與展望

與大多數(shù)有機小分子藥物不同，金屬藥物具有高反應(yīng)性和非特異性，這使金屬藥物的作用機理具有多重性。近年來，基于金屬抗癌藥物與蛋白質(zhì)的相互作用，多靶點藥物也在開發(fā)中。通過合理設(shè)計藥物分子，可以實現(xiàn)其在細胞內(nèi)與(多個)目標蛋白質(zhì)選擇性相互作用，以增強或破壞相關(guān)生物學(xué)過程，從而更好地優(yōu)化藥物的治療潛力。這些多靶點藥物不僅可以降低現(xiàn)有化學(xué)療法導(dǎo)致的全身毒副作用，而且可能降低許多化學(xué)療法方案中產(chǎn)生耐藥性的風險。大量的實驗證據(jù)表明，與蛋白質(zhì)的反應(yīng)是確定鉑類藥物總體藥理和毒理學(xué)特征的基礎(chǔ)。只有了解鉑藥進入細胞后發(fā)生的詳細生物、化學(xué)過程，才能為設(shè)計具有更好治療效果的鉑化合物提供新策略。

通常認為DNA是鉑類藥物的終極靶標，但無論從配位化學(xué)的理論分析，還是從實驗結(jié)果的考慮，都不能忽視蛋白質(zhì)對鉑類藥物作用機理的影響。過去的幾十年中，研究人員基于對金屬抗腫瘤藥物與蛋白質(zhì)之間相互作用的研究，發(fā)展了多種表征方法。其中，質(zhì)譜是分析金屬藥物與生物分子結(jié)合的最有力工具之一。使用不同類型的離子源和/或分離技術(shù)聯(lián)用的質(zhì)譜儀，可以從分子水平到組織范圍內(nèi)，甚至在單細胞水平對金屬藥物-靶標相互作用進行表征。質(zhì)譜的最大優(yōu)勢是快速、直接地鑒定結(jié)合位點。但有些金屬與氨基酸側(cè)鏈的配位相互作用較弱，或者屬于非共價相互作用，在質(zhì)譜中無法觀察到結(jié)合金屬殘基的肽段。這種情況下質(zhì)譜的分析能力是有限的，可以借助其他方法，如紫外可見光譜、熒光光譜、X射線晶體衍射、核磁共振波譜等。雖然在分子水平的研究取得了長足進步，但金屬抗癌藥物在體內(nèi)的最終作用方式和靶標尚難以準確表征，各類方法還需不斷完善才能實現(xiàn)在體內(nèi)更深入地研究鉑藥的作用機理。

致謝:感謝安徽師范大學(xué)的杜俊教授和胡先昆同學(xué)對本文的支持和貢獻。