微透析-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用

龐 博，劉 舒，劉志強(qiáng)，劉淑瑩，宋鳳瑞

(1.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，長(zhǎng)春質(zhì)譜中心&吉林省中藥化學(xué)與質(zhì)譜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130022；2.天津市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)技術(shù)研究院，天津 300384)

中醫(yī)藥歷經(jīng)幾千年的發(fā)展，在疾病的預(yù)防和治療方面發(fā)揮了重要作用。然而，由于中藥成分的復(fù)雜性以及體內(nèi)過程的多樣性，早期中藥相關(guān)研究受分析技術(shù)及方法學(xué)的制約。20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)，將液相色譜與質(zhì)譜相結(jié)合，極大推進(jìn)了中藥現(xiàn)代化的發(fā)展進(jìn)程。特別是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)與各種生物分析技術(shù)的不斷融合，大大擴(kuò)展了質(zhì)譜技術(shù)在現(xiàn)代中藥研究及生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，如微透析-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將微透析實(shí)時(shí)、原位取樣的特點(diǎn)，與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的快速分離、結(jié)構(gòu)表征的優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，近年來被廣泛用于中藥活性成分的篩選、中藥藥代動(dòng)力學(xué)及作用機(jī)制等方面的研究[1-5]。本文將對(duì)以上應(yīng)用進(jìn)行概述。

1 微透析技術(shù)簡(jiǎn)介

微透析是以膜透析原理為基礎(chǔ)的微量生物活體動(dòng)態(tài)連續(xù)取樣技術(shù)[6]，早期主要用于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域。近年來，微透析技術(shù)已被成功應(yīng)用于許多組織器官及體液的研究[4,7-9]。微透析取樣技術(shù)的原理圖示于圖1。實(shí)驗(yàn)中選取與細(xì)胞外液組成相似的生理溶液作為灌流液，將含有半透膜結(jié)構(gòu)的探針插入采樣組織，在灌流液恒速灌注過程中，由于半透膜兩側(cè)存在濃度差，小分子物質(zhì)可以沿濃度梯度逐漸擴(kuò)散并被灌流液不斷帶出，而蛋白質(zhì)等生物大分子及與蛋白結(jié)合的非游離型藥物則不能通過半透膜，從而達(dá)到取樣的目的[10-11]。

圖1 微透析取樣示意圖Fig.1 Scheme of microdialysis sampling

微透析系統(tǒng)通常是由微量灌流泵、探針、連接管和樣品收集器組成。其中，微透析探針是微透析系統(tǒng)的核心部件，不同的探針膜長(zhǎng)、內(nèi)徑、截留分子質(zhì)量范圍等參數(shù)可適用于不同的取樣環(huán)境。根據(jù)探針構(gòu)造的不同，一般可分為線性探針、同心圓式探針、柔性探針和分流探針。線性探針主要適用于肝臟、肌肉、皮膚和脂肪等外周組織取樣。同心圓式探針是應(yīng)用最多的一類探針，主要用于腦內(nèi)神經(jīng)科學(xué)研究，通常需要利用腦立體定位儀選定特定腦區(qū)，并在探針套管的引導(dǎo)下植入采樣部位。柔性探針的形態(tài)與同心圓式探針相似，但柔性更好，可隨實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活動(dòng)而彎曲，對(duì)取樣部位的組織損傷降到最低，適用于肌肉、皮膚、脂肪、血管和眼部等軟組織取樣，在血管中的應(yīng)用最普遍，已廣泛用于清醒動(dòng)物的藥代動(dòng)力學(xué)研究。分流探針主要用于膽汁取樣，可避免取樣過程中的體液損失，并可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間采樣。實(shí)際應(yīng)用過程中，除了微透析探針的選擇，灌流液的組成、濃度、pH值等條件也要與細(xì)胞外液等滲且相近，并以恒速灌流，這樣可有效減少探針采樣部位周圍細(xì)胞外液組成的變化及其他物質(zhì)的干擾，組織損傷較輕，在采樣過程中基本無體液損失[12-13]。

利用微透析技術(shù)既可以實(shí)現(xiàn)對(duì)同一組織的實(shí)時(shí)、連續(xù)監(jiān)測(cè)，也可以對(duì)不同組織或體液的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，包括內(nèi)源性及外源性物質(zhì)[2-5]。在藥物研究中，可以觀察到藥物在體內(nèi)一定時(shí)間段的實(shí)時(shí)情況，有利于獲取藥物在體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)信息[2-3,14-15]。通過微透析，使用較少的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物就能夠獲得大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，減少了所需實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量，有效降低了因動(dòng)物個(gè)體差異而產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)誤差。

由于通過微透析技術(shù)獲得的樣品量非常有限，待測(cè)物會(huì)受到體內(nèi)生理環(huán)境等因素的影響，使常規(guī)分析技術(shù)的靈敏度和選擇性難以滿足要求?，F(xiàn)代分析技術(shù)與微透析的離線及在線聯(lián)用大大拓寬了微透析技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域，特別是高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)兼具快速、靈敏、高選擇性等優(yōu)點(diǎn)，與微透析技術(shù)的聯(lián)用使中藥復(fù)雜體系的研究如虎添翼。

2 微透析-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用

2.1 微透析-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥活性成分篩選中的應(yīng)用

中藥活性成分與中藥的質(zhì)量和療效密切相關(guān)。由于復(fù)雜的基質(zhì)干擾，中藥活性成分的篩選及表征非常困難。微透析技術(shù)能夠利用半透膜將中藥小分子與蛋白等生物大分子分離。根據(jù)中藥小分子與生物體內(nèi)靶分子間特異性結(jié)合的特點(diǎn)，微透析-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)通過比較有無生物靶分子加入時(shí)，溶液中處于游離狀態(tài)的中藥小分子濃度的變化來推斷其與靶分子之間的結(jié)合程度，并同時(shí)對(duì)與靶分子結(jié)合的中藥成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。利用該方法，Wang等[1]通過微透析取樣與液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用，從梔子提取物中篩選出23種潛在的醛糖還原酶抑制劑。在緩沖液中作為生物靶分子的醛糖還原酶與中藥小分子結(jié)合形成復(fù)合物后，被微透析探針截留在膜外，未結(jié)合的中藥小分子則由于濃度梯度被灌流液帶出，進(jìn)入透析液，示于圖2。該實(shí)驗(yàn)分別收集梔子提取物和梔子提取物與醛糖還原酶共同孵育后的透析液，利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)鑒定與醛糖還原酶結(jié)合的化合物，并計(jì)算出篩選的化合物與醛糖還原酶抑制劑的結(jié)合率。Pang等[16]以α-糖苷酶為生物靶點(diǎn)，建立了微透析結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速篩選黃芩提取物中α-糖苷酶抑制劑。Zhang等[17-18]以α-葡萄糖苷酶為靶分子，采用微透析-強(qiáng)度衰減質(zhì)譜法對(duì)梔子及黃芩提取物的入血成分及代謝產(chǎn)物活性進(jìn)行分析，確定了入血原型成分及代謝物與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合親和力大小，該方法能排除復(fù)雜基質(zhì)的干擾，有利于快速確定梔子及黃芩提取物中調(diào)節(jié)血糖的活性成分。

圖2 微透析-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)篩選梔子中醛糖還原酶抑制劑的示意圖[1]Fig.2 Schematic diagram of screening aldose reductase inhibitors in Gardenia jasminosides by microdialysis-LC-MS[1]

此外，Lei等[19]以土荊皮提取物和漢防己提取物與人乳腺癌細(xì)胞MCF-7相互作用為例，利用微透析技術(shù)取樣篩選中藥中多種活性成分。利用半透膜結(jié)構(gòu)的探針分別從中藥提取物以及提取物和細(xì)胞共孵育后的體系中取樣，通過對(duì)比LC-MS分析得到的指紋圖譜中各成分的豐度差異，初步篩選出與細(xì)胞相互作用的活性成分，該研究巧妙地利用了微透析取樣技術(shù)能夠排除大分子物質(zhì)干擾，僅小分子物質(zhì)擴(kuò)散至膜內(nèi)的特點(diǎn)，簡(jiǎn)化了樣品處理過程，實(shí)現(xiàn)了中藥活性成分的快速辨識(shí)。上述研究表明，微透析-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可針對(duì)特定的疾病靶點(diǎn)(分子、細(xì)胞)對(duì)中藥活性成分進(jìn)行高通量篩選，有利于從分子、細(xì)胞水平闡明藥物的作用機(jī)理，為疾病治療和新藥研發(fā)提供依據(jù)。

2.2 微透析-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥體外代謝研究中的應(yīng)用

由于中藥成分復(fù)雜，其在體內(nèi)發(fā)揮的療效和產(chǎn)生的毒副作用受代謝過程的影響很大。因此，明確中藥的代謝途徑及過程并結(jié)合藥理活性研究，不僅可以為合理用藥提供參考，也可為新藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。與體內(nèi)代謝研究相比，中藥的體外代謝模型可以排除體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的干擾，更直接地對(duì)代謝過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的代謝產(chǎn)物，為進(jìn)一步闡明藥物的作用機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。其中，肝微粒體代謝和腸內(nèi)菌培養(yǎng)是研究藥物體外代謝的兩種重要模型。

肝臟是藥物代謝的主要器官，肝微粒體含有大量的細(xì)胞色素P450(CYP450)，主要催化藥物肝臟Ⅰ相代謝[20-21]。Wen等[22]通過微透析取樣結(jié)合液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜研究了毛蕊異黃酮和芒柄花黃素在大鼠肝微粒體中的代謝和藥物相互作用。通過該方法檢測(cè)并鑒定了與肝微粒體共同孵育后來自毛蕊異黃酮的2種羥基化代謝產(chǎn)物，以及來自芒柄花黃素的3種羥基化產(chǎn)物或4′-O-去甲基化衍生物。研究還發(fā)現(xiàn)，毛蕊異黃酮和芒柄花黃素會(huì)對(duì)CYP450酶反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，當(dāng)2種化合物共同存在時(shí)，抑制彼此的Ⅰ相代謝。

大量研究表明，腸道菌群在口服中藥的代謝過程中發(fā)揮著重要作用[23-24]。中藥成分經(jīng)過腸道菌群代謝產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，對(duì)其生物活性具有重要影響。因此，研究中藥的腸內(nèi)菌代謝對(duì)了解其代謝途徑、深入闡釋其體內(nèi)過程具有重要意義。腸內(nèi)菌群以厭氧菌群為主，目前常用的體外腸內(nèi)菌代謝研究方法是將中藥提取物與腸內(nèi)菌在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[25-26]。Li等[27]通過設(shè)計(jì)簡(jiǎn)化的厭氧培養(yǎng)裝置，利用在線微透析結(jié)合超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(MD-UPLC-MS)解決了傳統(tǒng)的體外腸內(nèi)菌代謝取樣過程，對(duì)厭氧菌群的厭氧環(huán)境及腸內(nèi)菌群微生態(tài)環(huán)境造成的影響，并利用該方法對(duì)黃芪皂苷Ⅱ在腸內(nèi)菌中的代謝過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。實(shí)驗(yàn)中通過在灌流液中加入2-羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)，有效降低了基質(zhì)干擾，提高了方法的靈敏度。在黃芪皂苷Ⅱ的腸內(nèi)菌代謝實(shí)驗(yàn)中，共檢測(cè)到6種新物質(zhì)，其中4種為中間產(chǎn)物。與常規(guī)方法相比，利用online-MD-UPLC-MS建立的中藥成分腸內(nèi)菌代謝研究方法，不僅操作簡(jiǎn)單，還可實(shí)現(xiàn)腸內(nèi)菌培養(yǎng)、取樣、樣品前處理和實(shí)時(shí)在線操作的目的。

2.3 微透析-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥體內(nèi)吸收代謝研究中的應(yīng)用

中藥在體內(nèi)發(fā)揮藥理作用，要經(jīng)過復(fù)雜的機(jī)體吸收和代謝過程。因此，需要在體外代謝研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究其體內(nèi)過程。Xue等[28]采用微透析結(jié)合超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF MS)同時(shí)鑒定口服藿香提取物在血液和腎臟透析中的成分，通過微透析探針分別植入頸靜脈和腎髓質(zhì)，連續(xù)采集微透析樣品，轉(zhuǎn)移至微管，采用UPLC-Q-TOF MS進(jìn)行分析，確定了大鼠血液循環(huán)中和腎臟中的非結(jié)合成分。Cao等[29]利用微透析-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速、靈敏地分析山茱萸在大鼠微透析液中的原型及代謝產(chǎn)物，根據(jù)特征診斷碎片離子和分子質(zhì)量信息，確定生物轉(zhuǎn)化位點(diǎn)，并對(duì)代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，首次在大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)山茱萸的7個(gè)原型化合物和3個(gè)新的代謝物。Liu等[30]通過微透析取樣聯(lián)合超高液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析了知母皂苷提取物在大鼠血液中的活性成分及代謝產(chǎn)物。Zheng等[31]利用微透析技術(shù)與LC-MS聯(lián)用研究了青藤堿在大鼠皮下含量的實(shí)時(shí)監(jiān)控方法，發(fā)現(xiàn)青藤堿皮下的第一階段生物轉(zhuǎn)化可能包括去甲基化和羥基化過程。該方法可以提供真實(shí)藥物在作用部位的代謝情況，有助于研究青藤堿的代謝機(jī)理。Zhao等[32]應(yīng)用改進(jìn)的膽汁微透析取樣技術(shù)結(jié)合液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜研究中藥復(fù)方二妙丸在SD大鼠膽汁中的代謝變化。根據(jù)精確質(zhì)量和碎片信息，鑒定出23種生物堿和內(nèi)酯代謝物，其代謝途徑涉及葡萄糖醛酸化、硫酸酯化、羥基化和水解，闡明了二妙丸在體內(nèi)的代謝特征。

2.4 微透析-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥藥代動(dòng)力學(xué)及藥代動(dòng)力學(xué)-藥效學(xué)研究中的應(yīng)用

中藥藥代動(dòng)力學(xué)是在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，通過藥代動(dòng)力學(xué)原理，研究中藥活性成分在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄，以及在體內(nèi)的藥物濃度隨時(shí)間的變化規(guī)律。由于采樣技術(shù)的限制，早期的藥代動(dòng)力學(xué)研究多用血液樣本進(jìn)行分析，而微透析取樣技術(shù)與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的聯(lián)用不僅可以實(shí)現(xiàn)幾乎所有組織的取樣，還能利用質(zhì)譜的高選擇性和高靈敏度的特點(diǎn)，解決生物樣品的內(nèi)源性干擾多、目標(biāo)成分含量低的問題，因而，被廣泛用于中藥的藥代動(dòng)力學(xué)研究[33-34]。Zheng等[35]采用微透析取樣結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，比較了黃芪桂枝五物湯中芍藥苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-6-葡萄糖苷和姜酚這4種成分在正常大鼠和腦缺血再灌注損傷大鼠的血液和腦中的藥代動(dòng)力學(xué)行為。研究表明，腦缺血可影響體內(nèi)藥物代謝，增加血液中芍藥苷和姜酚的含量，降低毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮-7-O-β-D-6-葡萄糖苷的含量。Mi等[36]利用血腦雙位點(diǎn)微透析技術(shù)結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，比較了在血瘀型偏頭痛模型大鼠中不同濃度天麻素和天麻苷元對(duì)川芎嗪和阿魏酸藥代動(dòng)力學(xué)的影響。發(fā)現(xiàn)不同濃度的天麻素和天麻苷元會(huì)明顯影響川芎嗪和阿魏酸的藥代動(dòng)力學(xué)；天麻素和天麻苷元可以增加川芎嗪和阿魏酸的腦靶向性。與其他傳統(tǒng)采樣方式相比，離線微透析取樣大大簡(jiǎn)化了樣品的前處理步驟，且可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)、多個(gè)部位的微透析取樣，獲得豐富的藥代動(dòng)力學(xué)及組織分布信息。但在采集、儲(chǔ)存以及濃縮等過程中，依然存在樣品的污染、降解等問題，并且離線微透析方式往往受分析系統(tǒng)對(duì)樣品量要求的限制，需要在獲得較好探針回收率的前提下，犧牲一定的樣品時(shí)間分辨率以實(shí)現(xiàn)成功進(jìn)樣。

為更好地解決此類問題，在線微透析分析系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生，將采集到的樣品直接注入包括分離和檢測(cè)設(shè)備的分析系統(tǒng)中，具有許多超越離線微透析的優(yōu)勢(shì)。但微透析取樣時(shí)間短，在線液相色譜-質(zhì)譜儀需要具有超快的色譜分離速度，以及高靈敏度的質(zhì)量檢測(cè)能力。而商品微透析接口耐壓較低，不適合與超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用。因此，本課題組自行設(shè)計(jì)研制了耐96.53 MPa高壓的在線接口，并將其應(yīng)用于中藥藥代動(dòng)力學(xué)[37-38]及作用機(jī)制等方面的研究[3,5]。如Wang等[3]構(gòu)建了急性不完全性腦缺血模型，利用在線微透析-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法研究刺五加葉中主要成分的腦內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)過程及其對(duì)腦缺血大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響。發(fā)現(xiàn)刺五加葉中的金絲桃苷和1,5-二咖啡酰奎寧酸均能成功透過血腦屏障到達(dá)腦部, 并能有效緩解由缺血引發(fā)的神經(jīng)遞質(zhì)水平紊亂，實(shí)現(xiàn)了在不同離子監(jiān)測(cè)模式下對(duì)內(nèi)源性及外源性物質(zhì)的同時(shí)、實(shí)時(shí)、連續(xù)檢測(cè)。Zhang等[37]利用在線微透析-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(MD-UPLC-MS/MS)法研究了梔子4種未結(jié)合環(huán)烯醚萜在健康和2型糖尿病大鼠血液中的藥代動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠的藥代動(dòng)力學(xué)行為明顯改變；在不需要標(biāo)準(zhǔn)品的條件下，采用MD-UPLC-MS /MS方法直接、實(shí)時(shí)測(cè)定梔子環(huán)烯醚萜提取物在2型糖尿病大鼠體內(nèi)主要代謝物genipin-1-O-glucuronic acid和genipin-monosulfat的相對(duì)含量，獲得了兩者的相對(duì)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)[38]。與離線微透析-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)相比，在線微透析-超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有更高的時(shí)間分辨率，可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，減少樣品在采集、轉(zhuǎn)移和儲(chǔ)存過程中可能造成的污染、降解等問題；簡(jiǎn)化樣品處理過程，避免處理小體積樣品帶來的困擾，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)分析；在線聯(lián)用系統(tǒng)還能夠獲得更好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性[39]。

此外，血、腦微透析-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法也可應(yīng)用于氨溴索與遠(yuǎn)志聯(lián)合用藥的藥物相互作用研究[39]，結(jié)果表明，遠(yuǎn)志提取物與氨溴索聯(lián)合的給藥方案是安全的，且不存在藥代動(dòng)力學(xué)相互作用。

藥代動(dòng)力學(xué)-藥效學(xué) (PK-PD) 關(guān)聯(lián)分析可以將藥物在體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)過程與其對(duì)機(jī)體的效應(yīng)關(guān)聯(lián)起來，有助于全面系統(tǒng)地闡明藥物的作用機(jī)制，為藥物篩選、藥物毒性預(yù)測(cè)、臨床劑量方案選擇提供了重要的研究方法和理論依據(jù)[40-44]。Zhan等[45]通過建立一個(gè)簡(jiǎn)單的自由運(yùn)動(dòng)大鼠血液微透析取樣系統(tǒng)，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜研究了生脈注射液對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心肌缺血NO實(shí)時(shí)釋放的PK-PD效應(yīng)。Wang等[46]搭建了微透析-超高液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用的在線分析平臺(tái)，通過PK-PD關(guān)聯(lián)分析研究了刺五加葉治療缺血性腦中風(fēng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用，示于圖3。該研究搭建的在線分析平臺(tái)可同時(shí)、連續(xù)采集和定量檢測(cè)清醒狀態(tài)下缺血性腦卒中大鼠的血漿和海馬區(qū)腦脊液中刺五加葉的6種活性成分，以及與缺血性腦卒中有關(guān)的8種神經(jīng)活性物質(zhì)，建立了一種可視化的方法來表達(dá)缺血性海馬區(qū)藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)之間的關(guān)系，證明了刺五加葉對(duì)缺血性腦卒中有多方面的調(diào)節(jié)作用。

圖3 基于在線微透析-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的PK-PD分析示意圖[46]Fig.3 Schematic diagram of PK-PD analysis based on online microdialysis-LC-MS/MS[46]

2.5 微透析-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥代謝組學(xué)及作用機(jī)制研究中的應(yīng)用

中藥多成分、多靶點(diǎn)及多途徑作用的特點(diǎn)為中藥現(xiàn)代化研究帶來了極大的挑戰(zhàn)。近年來，隨著代謝組學(xué)的不斷發(fā)展，利用代謝組學(xué)進(jìn)行中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、安全性評(píng)價(jià)和藥理作用機(jī)制等方面的研究，符合中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，有利于理解中藥在體內(nèi)發(fā)揮的整體療效。微透析-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)能夠充分發(fā)揮微透析取樣“實(shí)時(shí)、活體、微量、微創(chuàng)”的特點(diǎn)，以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的高通量、高靈敏度和高特異性的特點(diǎn)，為代謝組學(xué)研究提供了新視角[4,47-48]。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是最常見的自身免疫性疾病之一，其特征是持續(xù)性滑膜炎和異常滑膜增生。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的局部炎癥可以改變關(guān)節(jié)滑液的化學(xué)組成，顯著加速慢性炎癥的發(fā)展和向全身炎癥變化的進(jìn)程。Zhan等[48]利用微透析技術(shù)解決了關(guān)節(jié)滑液的取樣困難，應(yīng)用親水相互作用液相色譜與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(HILIC-HRMS) 技術(shù)研究了佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的代謝特征和京尼平苷治療的潛在機(jī)制。通過多元統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠與正常大鼠的20種代謝物存在顯著差異，京尼平苷治療可以回調(diào)其中13種代謝物的變化。本實(shí)驗(yàn)室利用微透析頸靜脈和腎臟雙位點(diǎn)取樣技術(shù)，結(jié)合基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的靶向代謝組學(xué)方法，分別篩選出血液和腎臟中梔子治療糖尿病腎病的生物標(biāo)志物，并闡釋其作用機(jī)制，示于圖4[4]。此外，本實(shí)驗(yàn)室利用自行設(shè)計(jì)的在線接口，采用在線微透析-超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法監(jiān)測(cè)糖尿病腦病大鼠海馬區(qū)的8種神經(jīng)活性物質(zhì)的含量變化，對(duì)刺五加[3]、黃連[5]、人參[49]、北五味子[50]治療糖尿病腦病的作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究。

圖4 雙點(diǎn)微透析靶向代謝組學(xué)示意圖[4]Fig.4 Schematic diagram of the targeted metabolomics by dual-probe microdialysis[4]

3 結(jié)語(yǔ)

微透析-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將微透析技術(shù)在活體、實(shí)時(shí)、連續(xù)取樣的特點(diǎn)與質(zhì)譜技術(shù)的快速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)融合，有效解決了中藥體系復(fù)雜、內(nèi)源性干擾眾多、活性成分及代謝物在生物樣品中濃度較低等問題，在中藥活性成分篩選、藥物代謝、藥代動(dòng)力學(xué)及作用機(jī)制等研究方面發(fā)揮了其他技術(shù)不可比擬的優(yōu)勢(shì)，為中藥現(xiàn)代化研究提供了一條新的途徑。但由于微透析取樣量少、影響探針回收率等原因，單純依靠微透析-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法研究中藥中含量跨度較大的眾多成分的體內(nèi)過程，以及它們的整體作用機(jī)制尚存在一定的局限性，需要與其他方法相結(jié)合，發(fā)揮各自優(yōu)勢(shì)，形成完整的研究體系。

目前，微透析-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用還不夠廣泛，除上述提到的應(yīng)用外，期待該技術(shù)能夠解決中藥劑型的改良、中藥制劑的靶向給藥、中醫(yī)藥理論及臨床研究中的瓶頸問題，使之成為中醫(yī)藥傳承和創(chuàng)新研究的有力工具。相信隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的不斷發(fā)展，以及多學(xué)科技術(shù)和手段的交叉融合，微透析-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)會(huì)在中藥現(xiàn)代化研究中發(fā)揮更重要的作用。