不同眼壓狀態(tài)下實驗性青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞p53基因表達

李素美 王文奇

(1淮安市洪澤區(qū)人民醫(yī)院，江蘇 淮安 223100；2淮安市第一人民醫(yī)院)

青光眼主要表現(xiàn)為眼紅、夜盲、虹視、視物模糊、眼痛、頭痛等，嚴重可導致失明〔1〕。因患者早期癥狀不明顯或無癥狀常錯過了最佳治療時機，發(fā)現(xiàn)時病情已發(fā)展到中晚期，視覺功能損傷嚴重致失明〔2〕。晚期青光眼致盲是目前人類最主要的致盲原因，且這種致盲是不可逆的，如何有效地保護青光眼患者的視覺功能是當前眼科的難題之一〔3〕。近年來臨床研究認為造成青光眼患者視覺功能損傷與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)死亡相關(guān)〔4〕。而RGCs的死亡則是通過細胞凋亡來完成的，目前已知的激發(fā)RGCs凋亡的因素較多，但這些因素都是利用信號傳導影響細胞內(nèi)控制凋亡的相關(guān)基因完成的〔5〕。p53基因在誘導RGCs凋亡中有重要的作用〔6〕。醫(yī)學界針對青光眼的相關(guān)研究很多，但缺乏關(guān)于不同眼壓狀態(tài)下RGCs細胞內(nèi)控制凋亡基因的研究。本研究通過檢測不同眼壓狀態(tài)下p53基因的表達，探討其對青光眼RGCs凋亡作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 SD小鼠RGC-5細胞系，選購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。DMEM培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清：美國Corning公司；胰蛋白酶消化液：北京索萊寶科技有限公司；兔抗鼠單克隆體P53：美國Santa 公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒：南京森貝伽生物科技有限公司；Hoe33342染色液：美國MedChemExpress公司；聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒：美國TaKa-Ra公司；Western印跡試劑盒：基爾頓生物科技(上海)有限公司；CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；IX70型倒置相差顯微鏡：徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司；流式細胞儀：美國Beckman Coulter公司；熒光顯微鏡：徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司；紫外投射儀：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，溫度為37℃，體積數(shù)為5% 的CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中進行RGC-5細胞培養(yǎng)，3～4 d用0.25%的胰蛋白消化傳代1次，傳代比例為1∶4〔7〕。

1.2.2實驗分組 RGC-5細胞(對數(shù)期生長的)以每孔8×103的密度在96孔培養(yǎng)板上進行接種，培養(yǎng)24 h后，分為4組：對照組、20 mmHg壓力組、40 mmHg組、60 mmHg組。對照組僅進行密封處理，不加壓，壓力組分別用20、40和60 mmHg的密封加壓裝置處理，將經(jīng)處理的細胞分別放入各自的培養(yǎng)箱中48 h，然后用倒置相差顯微鏡對各組的細胞狀態(tài)進行觀察記錄〔8〕。

1.2.3流式細胞儀檢測 使用Annexin V-FITC和PI細胞凋亡檢測試劑盒來進行檢測，按說明書操作。首先收集加壓培養(yǎng)后的RGC-5細胞，用預冷處理過的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次；在結(jié)合緩沖液中懸浮置入洗滌的細胞〔9〕。然后分別添加Annexin V-FITC和PI，進行15 min避光孵育。最后添加結(jié)合緩沖液混合均勻，用流式細胞儀分析〔10〕。

1.2.4半定量RT-PCR檢測 加壓培養(yǎng)后，選取RGC-5細胞(1×105個)通過Trizol一步法進行RNA提取，再用Oligo(dT)進行逆轉(zhuǎn)錄反應獲得cDNA。以Genbank上的基因序列為依據(jù)進行引物設(shè)計，分別用p53引物和內(nèi)參GAPDH引物行PCR〔11〕。其反應體系為25 μl，反應條件為：5 min 95℃預變性，余下的34個循環(huán)50 s 95℃變性，50 s 55℃退火，50 s 72℃延伸，最后5 min 72℃延伸，共行35個循環(huán)〔12〕。利用瓊脂糖凝膠(購自：武漢沃軒科技有限公司，內(nèi)含1%花青素)電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定，同時通過紫外透射儀觀察拍照，凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.2.5Western印跡檢測 加壓培養(yǎng)后，收集RGC-5細胞并用細胞裂解液進行30 min裂解。然后在4℃的環(huán)境下，以12 000 r/min的速度進行5 min離心處理，提取上清液，加入上樣緩沖液后在沸水中煮5 min，用濃度為10%的十二烷基硫代硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離〔13〕。電泳結(jié)束后，脫奶粉(5%)封閉1 h，加入比例為1∶1 000的一抗，4℃過夜〔14〕。進行30 min的TBST液漂洗后，加入比例為1∶2 000的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫下孵育30 min，用TBST液漂洗1 h，ECL染色〔15〕。掃描得出圖像，需重復3次獨立實驗。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組細胞形態(tài)及存活狀況 對照組細胞形狀為梭形且有較多樹突，各壓力組細胞輪廓不清，皺縮細胞變多，有些細胞樹突變少、變短，有些細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡。而且壓力越大，細胞異常表現(xiàn)越明顯，見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下細胞形態(tài)及存活狀況(×100)

2.2各組細胞凋亡情況比較 隨著壓力數(shù)值的上升，凋亡和壞死細胞比例均顯著高于對照組(均P<0.05)。見圖2和表1。

圖2 各組細胞流式細胞儀檢測下細胞凋亡

表1 各組凋亡和壞死細胞比例比較

2.3各組細胞p53 mRNA表達和蛋白表達 與對照組相比，各加壓組細胞p53 mRNA和蛋白表達水平均顯著增加，且與20 mmHg壓力組相比，40 mmHg壓力組和60 mmHg壓力組p53 mRNA和蛋白表達水平上調(diào)更顯著(P<0.05)。見圖3，4，表2。

1～4：對照組，20 mmHg壓力組，40 mmHg壓力組，60 mmHg壓力組圖3 各組細胞在不同壓力下P53的mRNA表達

1～4：對照組，20 mmHg壓力組，40 mmHg壓力組，60 mmHg壓力組圖4 各組細胞在不同壓力下p53的蛋白表達

表2 各組 p53 mRNA 和蛋白表達水平比較

3 討 論

目前臨床研究已證實，RGCs進行性死亡和視神經(jīng)纖維丟失是青光眼患者眼壓上升的主要因素之一〔16〕。本研究結(jié)果證明壓力可導致RGCs出現(xiàn)死亡，且壓力大小與細胞損傷程度成正比。張虹等〔17〕將經(jīng)過純化培養(yǎng)的SD系大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞分別施加0、20、40、80 mmHg的氣壓，在培養(yǎng)箱中進行48 h培養(yǎng)后對細胞的凋亡狀況進行檢測，隨著壓力數(shù)值的上升，細胞凋亡指數(shù)增高，證明壓力會導致RGCs凋亡，且壓力越高細胞凋亡越嚴重，且高壓力會增加細胞早期凋亡進程。

RGCs凋亡是一個極其復雜又涉及多層面、多因素的過程〔18〕。因為各層面各因素間是彼此聯(lián)系又相互影響制約的，現(xiàn)在研究的尚不能對其發(fā)病機制進行明確闡述〔19〕。但在目前已知的能調(diào)節(jié)細胞凋亡的因素中，與RGCs凋亡相關(guān)性較強的就是p53基因。p53基因是促進細胞凋亡的抑癌基因，因其會產(chǎn)生一種名為53 kD的核蛋白而得名〔20〕。其基因分為野生型和突變型兩種，野生型通過讓細胞周期停留在G1期，來控制細胞的繁殖從而使其凋亡；突變型則為突變基因無誘導細胞凋亡的作用〔21〕。當細胞DNA出現(xiàn)損害時，為了使其有時間進行損傷修復，p53先會誘使細胞停留在G1期；但當DNA損傷過于嚴重不能修復時，p53則會誘使細胞凋亡，以此達到清除壞死細胞的目的。