薄芝糖肽對胃癌模型大鼠的干預(yù)效果及對免疫功能的影響

陳宓 蘇州

(1綿陽市第三人民醫(yī)院(四川省精神衛(wèi)生中心)腫瘤科，四川 綿陽 621000；2四O四醫(yī)院腫瘤科)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤〔1，2〕。主要由于生活質(zhì)量提高，飲食種類過于豐富導(dǎo)致〔3〕。胃癌早期確診率極低，一旦確診為胃癌，可能已經(jīng)到了晚期，因此提高胃癌的確診率和治療效果是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)最主要的研究課題。胃癌患者免疫力低于正常人〔4，5〕。薄芝糖肽是由靈芝多糖提煉出來的糖肽類藥品，可增強抗腫瘤作用，增強免疫力〔6〕。本研究探討薄芝糖肽對胃癌大鼠的干預(yù)效果及對免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物：選擇30只BALB/c健康大鼠，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供，年齡5～8〔平均(7.5±0.5)〕個月，體重210～230〔平均(225.5±1.5)〕g。所有大鼠飼養(yǎng)在干凈籠子里，室溫(22.1±1.8)℃，相對濕度38%～42%，每天光照10個小時，喂飲純凈水，清潔級飼養(yǎng)1 w。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。主要藥物及試劑：薄芝糖肽(北京賽升藥業(yè)股份有限公司)；白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α(武漢博士德生物工程有限公司)；IL-2抗體(中山康方生物醫(yī)藥有限公司)；重組人細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3抗體、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多克隆抗體、p53抗體(Santa Cruz公司)；生物顯微鏡(Olympus公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色劑(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2分組、建模及給藥 隨機選取10只大鼠作為對照組，另外20只大鼠參照張丹等〔7〕研究實驗，于大鼠腹部皮下注射200 mg/kg阿糖胞苷，2 d后行60CO全身照射，劑量為10 Gy，次日在活性良好的胃癌細(xì)胞株中加入Ⅰ型胰蛋白酶，進(jìn)行重懸之后將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×1010/L，在大鼠右腋皮下注射0.8 ml細(xì)胞懸液。7 d后大鼠腋下出現(xiàn)直徑為1 cm左右的腫塊視為胃癌模型建立成功，20只大鼠中有4只建模過程中死亡，2只建模失敗，建模成功有14只，將這14只胃癌模型大鼠隨機分為胃癌組和薄芝糖肽組各7只。薄芝糖肽組于大鼠腹腔注射2 ml：5 mg(多糖)1 mg(多肽)的薄芝糖肽4 ml，1次/d，連續(xù)注射7 d，對照組和胃癌組注射同等劑量的生理鹽水。

1.33組細(xì)胞CD4+T、CD4+CD25+T、CTL殺傷功能檢測 抽取大鼠抗凝外周血，分別加入不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體10 μl，加入100 μl EDTA抗凝的全血中孵育15 min，加入紅細(xì)胞裂解液，緩沖液(PBS)洗滌3次，使用流式細(xì)胞儀檢測CD4+T、CD4+CD25+T、CTL細(xì)胞分別占淋巴細(xì)胞的百分比。

1.4切片及染色 對3組進(jìn)行全麻處理，采用斷頭法處死，取其胃黏膜組織，距賁門和幽門1.5 cm離斷出全胃，在胃大彎側(cè)部開全胃，取0.2 cm×2.0 cm長條形胃組織，迅速置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，石蠟包埋，HE染色檢查。

1.53組IL-6、IL-10、IL-2、TNF-α檢測 抽取大鼠尾部靜脈血,使用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測3組胃癌模型因子IL-6、IL-10、IL-2、TNF-α表達(dá)水平。

1.63組STAT3、p53、VEGF檢測 Western印跡檢測3組胃癌STAT3、p53、VEGF蛋白表達(dá)量，取每組4份心肌組織樣本，研磨后加入蛋白緩沖液，進(jìn)行常規(guī)蛋白提取，采取二喹啉甲酸(BCA)進(jìn)行定量分析。50 μg的蛋白樣品上樣后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，通過蛋白電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，使用5%的脫脂奶粉TBST中進(jìn)行避光封閉1 h，洗滌之后加入一抗稀釋溶液(STAT3、p53、VEGF按照1∶1 000比例進(jìn)行稀釋)，在4℃的環(huán)境中過夜保存，洗滌后加入二抗稀釋溶液(STAT3、p53、VEGF按照1∶5 000比例進(jìn)行稀釋)，在溫床中孵育1 h后再次洗滌，加入發(fā)光液ECL，曝光2～3次，取重疊值。使用軟件分析蛋白條帶灰度值。內(nèi)參蛋白是GAPDH。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析、獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.13組CD4+T細(xì)胞、CD4+CD25+T、CTL比較 胃癌組、薄芝糖肽組CD4+T細(xì)胞及CTL殺傷功能均顯著低于對照組,CD4+CD25+T細(xì)胞顯著高于對照組(均P<0.05)；薄芝糖肽組CD4+T細(xì)胞及CTL殺傷功能均顯著高于胃癌組，CD4+CD25+T細(xì)胞顯著低于胃癌組(均P<0.05)。見表1。

表1 3組CD4+T細(xì)胞、CD4+CD25+T細(xì)胞及CTL比較

2.23組病理組織觀察 對照組胃黏膜組織無任何變化，處于正常水平；胃癌組胃黏膜出現(xiàn)了排列紊亂，黏膜增厚，可見異性增生；薄芝糖肽組胃黏膜腺體排列比較規(guī)則，未見明顯的異型增生或腸上皮化生。見圖1。

圖1 3組胃黏膜病理組織觀察(HE，×200)

2.33組IL-6、IL-10水平比較 胃癌組、薄芝糖肽組IL-6及IL-10水平均顯著高于對照組(均P<0.05)；薄芝糖肽組IL-6、IL-10水平均顯著低于胃癌組(均P<0.05)，見表2。

表2 3組IL-6、IL-10、IL-2、TNF-α、STAT3、p53、VEGF水平比較

2.43組IL-2、TNF-α水平比較 胃癌組、薄芝糖肽組IL-2水平均顯著低于對照組，TNF-α水平均顯著高于對照組(均P<0.05)；薄芝糖肽組IL-2水平顯著高于胃癌組，TNF-α水平顯著低于胃癌組(均P<0.05)。見表2。

2.53組STAT3、p53、VEGF水平比較 胃癌組、薄芝糖肽組STAT3、p53、VEGF水平均顯著高于對照組(均P<0.05)；薄芝糖肽組STAT3、p53、VEGF水平均顯著低于對照組(均P<0.05)。見表2、圖2。

圖2 3組STAT3、p53、VEGF蛋白表達(dá)

3 討 論

胃癌主要是由氣血弱易發(fā)生的氣滯、血瘀、痰凝、耗氣傷陰、損傷脾腎導(dǎo)致〔8〕。有研究表明當(dāng)胃癌發(fā)生時，機體免疫功能發(fā)生變化導(dǎo)致免疫力下降〔9〕。CD4+T屬人體免疫系統(tǒng)中比較重要的一種免疫細(xì)胞，簡稱為CD4細(xì)胞，主要是CD4，輔助T細(xì)胞表達(dá)〔10〕。T淋巴細(xì)胞在免疫功能中扮演著重要角色，能指揮身體對抗微生物，比如腫瘤病毒。CD4+T細(xì)胞中表面分子CD25表達(dá)的不同，可將其分為CD4+CD25低表達(dá)的效應(yīng)性T細(xì)胞和CD4+CD25高表達(dá)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞〔11〕。CTL是白細(xì)胞的亞部，為一種特異T細(xì)胞專門分泌各種細(xì)胞因子參與免疫功能，對腫瘤及病毒等有殺傷作用，是腫瘤免疫的重要防線〔12〕。IL-6屬于細(xì)胞因子，能刺激免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖、分化且提高其功能〔13〕。IL-10可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與分化，參與免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)，是現(xiàn)在醫(yī)學(xué)研究中公認(rèn)的炎癥和免疫抑制因子〔14，15〕。IL-2可有效調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中白細(xì)胞活性，能促進(jìn)因子繁殖，同樣參與抗體反應(yīng)，造血和腫瘤監(jiān)視〔16〕。TNF-α可直接殺傷腦腫瘤細(xì)胞核，但對正常的細(xì)胞無明顯毒性〔17〕。STAT可和特定的含磷酸化酪氨酸的肽段結(jié)合。STAT被磷酸化后，發(fā)生聚合稱為同源或聚體形式的活化轉(zhuǎn)錄激活因子，進(jìn)入胞核內(nèi)與靶基因啟動子序列的特定位點結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄〔18，19〕。p53基因含有大量的脯氨酸，電泳速度被拖慢。p53基因的失活對腫瘤形成起重要作用。p53基因突變會導(dǎo)致正常生物功能的喪失〔20〕。VEGF在胃癌中有極高的表達(dá)，對胃癌新生的血管形成及腫瘤轉(zhuǎn)移和生長起很大的作用。