雌二醇對(duì)帕金森病細(xì)胞損傷模型中PC12細(xì)胞Cav1.3基因表達(dá)的影響

何玲 猶秋香 陳光梅 王啟春 江顯萍 吳立新 熊勁 賀歆彥

(1黔南州人民醫(yī)院老年科，貴州 都勻 558000；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)疾病中心；3黔南州人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

帕金森病(PD)是一種在老年人群中較為常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病〔1〕。有調(diào)查研究顯示我國(guó)65歲以上人群患有PD的概率為1.7%，雖然PD有遺傳效應(yīng)但絕大多數(shù)的疾病患者都是散發(fā)病例〔2〕。PD患病因腦中的腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元出現(xiàn)變性死亡，從而導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺的含量減少而患病〔3〕。但導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡的原因仍尚未清楚，目前主要影響因素包括機(jī)體老化、遺傳因素、環(huán)境因素、氧化應(yīng)激等〔4〕。雌二醇是一種甾體雌激素，雌激素對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用，有研究顯示老年人體患PD與其雌性激素分泌量的減少有著一定的關(guān)系，但是將雌激素用于臨床治療卻有著較大的爭(zhēng)議〔5〕。本文擬探討雌二醇對(duì)PD病細(xì)胞損傷模型中PC12細(xì)胞Cav1.3基因的表達(dá)影響，為雌激素與PD之間的關(guān)系研究提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 主要試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、6-羥多巴胺(6-OHDA)、17β-雌二醇、胎牛血清、馬血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)、裂解液等。主要儀器：離心機(jī)、各類實(shí)驗(yàn)用玻璃儀器、電泳機(jī)等。

1.2PC12細(xì)胞的培養(yǎng) 用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細(xì)胞株，其中DMEM完全培養(yǎng)基的組成為5%的胎牛血清、5%的馬血清(滅活)、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 μg/ml)，傳代接種時(shí)用2×105/ml的細(xì)胞密度懸液進(jìn)行，接種在25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境設(shè)置為溫度37℃、CO2濃度為5%、濕度為飽和濕度，每培養(yǎng)2～3 d進(jìn)行1次換液，培養(yǎng)4～6 d后進(jìn)行1次傳代。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求一共分為3個(gè)組，分別為空白對(duì)照組，6-OHDA作用組和雌二醇干預(yù)組，雌二醇干預(yù)組又設(shè)置不同濃度的雌二醇干預(yù)亞組?？瞻捉M為在不含有6-OHDA和17β-雌二醇的DMEM完全培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)PC12細(xì)胞；6-OHDA作用組為在含有6-OHDA的DMEM完全培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)PC12細(xì)胞，其中6-OHDA的濃度為50 μmol/L；雌二醇干預(yù)組為在含有6-OHDA和17β-雌二醇的DMEM完全培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)PC12細(xì)胞，其中6-OHDA的濃度與6-OHDA作用組相同，17β-雌二醇的濃度每個(gè)亞組的都不同，分別為10-10mol/L，10-9mol/L，10-8mol/L，10-7mol/L，10-6mol/L。所有的培養(yǎng)基都是接種相同濃度、相同規(guī)格的PC12細(xì)胞懸浮液進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4評(píng)價(jià)方法 (1)使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，以空白對(duì)照組的細(xì)胞活性為標(biāo)準(zhǔn)，將其細(xì)胞MTT還原率定為100，其他組的細(xì)胞活性與空白對(duì)照組進(jìn)行比較，觀察各組在細(xì)胞活性上的差別。(2)使用Western印跡法檢測(cè)Cav1.3基因的蛋白表達(dá)，首先進(jìn)行總蛋白的提取：①將PC12細(xì)胞從培養(yǎng)基中取出，然后將培養(yǎng)液倒掉，使用PBS將提取出來的PC12細(xì)胞清洗兩遍，清洗完后將其放置于冰上，加入適量的裂解液，保證裂解液均勻的覆蓋在細(xì)胞的表明，靜置5 min；②使用移液槍將細(xì)胞脫離到離心管中，將離心管放在冰上震蕩10 min，10 min后放入離心機(jī)中進(jìn)行離心，離心設(shè)置為12 000 r/min，離心溫度為4℃，離心時(shí)長(zhǎng)為15 min，離心結(jié)束后取上層清液；③使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白的總濃度，在測(cè)出濃度后將其均一化濃度為3.75 mg/μl。其次用Western印跡法檢測(cè)Cav1.3基因的蛋白表達(dá)：①根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求配置濃度為12%的分離膠，在分離膠凝固后在配置濃度為4%的濃縮膠，在7 min后拔梳子；②將配置好的蛋白樣品加入到濃縮膠中，然后開始進(jìn)行電泳，電泳的設(shè)置為50 V，1 h，100 V，2 h；③在電泳完成后將條件改變?yōu)?0 V，1.5 h，將蛋白樣本轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上；④在轉(zhuǎn)移完成后使用稀釋液封閉1.5 h，在封閉過程中要將起的泡泡趕干凈。在封閉時(shí)間達(dá)到后向其中加入已經(jīng)稀釋好的一抗體溶液，將樣品放到搖床上進(jìn)行過夜，溫度設(shè)置為4℃；⑤第2天，將樣品中的NC膜取下，使用PBS-T溶液洗滌3次，在洗滌完成后加入濃度為1∶5 000的二抗溶液，將其混合，混合時(shí)要在避光的條件下進(jìn)行，充分混合均勻后取出NC再使用PBS-T溶液洗滌4次；⑥對(duì)蛋白樣品進(jìn)行掃描，將掃描結(jié)果與β-actin灰度進(jìn)行比較，以此來確定目標(biāo)蛋白的含量。每種分組3次平均值為最終結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同組PC12細(xì)胞活性比較 6-OHDA作用組PC12細(xì)胞活性顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)；各雌二醇干預(yù)組中的PC12細(xì)胞的細(xì)胞活性與空白對(duì)照組比較均顯著下降，但顯著高于6-OHDA作用組(P<0.05)；且呈濃度依賴性(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組PC12細(xì)胞活性及Cav1.3基因表達(dá)蛋白含量對(duì)比

A～G：空白組，6-OHDA作用組;雌二醇干預(yù)組(10-10mol/L)；雌二醇干預(yù)組(10-9mol/L)；雌二醇干預(yù)組(10-8mol/L);雌二醇干預(yù)組(10-7mol/L)；雌二醇干預(yù)組(10-6 mol/L)圖1 細(xì)胞PC12細(xì)胞活性觀察(MTT，×400)

2.2不同組細(xì)胞的Cav1.3基因表達(dá)蛋白含量比較 6-OHDA作用組Cav1.3基因相對(duì)蛋白含量顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)；雌二醇干預(yù)組中的PC12細(xì)胞的Cav1.3基因表達(dá)蛋白的含量顯著高于空白對(duì)照組，但顯著低于6-OHDA作用組(P<0.05)，且呈濃度依賴性(P<0.05)，見表1、圖2。

1～3為平行樣圖2 Cav1.3基因蛋白表達(dá)

3 討 論

PD的臨床癥狀主要表現(xiàn)為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)緩慢、肌肉僵直、無法以正常姿勢(shì)行走，同時(shí)PD患者還可能伴有抑郁、便秘和睡眠障礙等非運(yùn)動(dòng)型的癥狀〔6〕。對(duì)于PD的診斷主要是通過患者的病史，臨床癥狀和行為特征進(jìn)行判斷，其他輔助性檢查對(duì)于診斷結(jié)果影響不大〔7〕。對(duì)于PD的治療主要是通過藥物進(jìn)行治療，其中左旋多巴制劑是現(xiàn)在用于治療PD的最有效的藥物，還可以輔助以手術(shù)治療、心理治療、康復(fù)治療等〔8〕。但是現(xiàn)在的治療方法都只是對(duì)病情進(jìn)行緩解，改善患者的臨床癥狀，無法對(duì)PD進(jìn)行根本上的治愈，也無法阻止病情的持續(xù)發(fā)展〔9〕。

雌二醇是一種甾體雌激素，這種激素有兩種類型分別為α-雌二醇和β-雌二醇，本實(shí)驗(yàn)使用的就是β-雌二醇。雌二醇是一種生理作用較強(qiáng)的激素，由于其有很強(qiáng)的性激素作用，所以又將其稱為“動(dòng)情素”和“求偶素”〔10〕。雌激素能促使細(xì)胞合成DNA、RNA和相應(yīng)組織內(nèi)各種不同的蛋白質(zhì)，在臨床疾病的治療中有著一定的應(yīng)用〔11〕。主要是用于補(bǔ)充患者的雌激素不足、治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌、治療晚期前列腺癌、防治骨質(zhì)疏松、治療痤瘡、白細(xì)胞減少癥、用作事后避孕藥和退奶等〔12〕。6-OHDA是一種神經(jīng)毒性物質(zhì)，可以對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，雖然人體腦中也會(huì)產(chǎn)生6-OHDA，但是產(chǎn)生的量很少，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用很小，但是在一定生理作用下可能會(huì)產(chǎn)生大量的6-OHDA，從而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷。有研究顯示6-OHDA的含量過高可能是導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞變性死亡的原因之一〔13〕。PC12細(xì)胞是一個(gè)常用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)的神經(jīng)細(xì)胞株，其來源為于一種可移植的鼠嗜鉻細(xì)胞瘤，這種細(xì)胞有明顯的神經(jīng)細(xì)胞反應(yīng)，常被用于體外神經(jīng)細(xì)胞模型，進(jìn)行相關(guān)的藥物實(shí)驗(yàn)，以此來探討相關(guān)藥物對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的作用原理和效果〔14〕。

L型鈣通道作為一種類型鈣通道，對(duì)電壓有極強(qiáng)的依賴性，故又將其視作一種電壓依賴性鈣通道的類型鈣通道，這個(gè)通道可以通過控制鈣離子的流動(dòng)形成L型電流，在神經(jīng)細(xì)胞中有著重要作用〔15〕。哺乳動(dòng)物的大腦主要表達(dá)Cav1.2和Cav1.3兩種LTCC亞型。Cav1.3介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣超載導(dǎo)致了黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的病理改變，且該作用發(fā)生在疾病早期。其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞中的L型鈣離子通道有著重要的影響作用，通過檢測(cè)Cav1.3基因的表達(dá)情況可以來判斷神經(jīng)細(xì)胞的活躍程度和損傷狀況。雌激素除了控制人體的一些生殖行為和非生殖行為之外還對(duì)位于中腦的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元有著調(diào)節(jié)作用。有研究〔9〕顯示雌激素的含量水平與PD的發(fā)病率有著一定的關(guān)聯(lián)，雌激素可以激活中腦的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)的受體，提高其抗凋零蛋白基因的表達(dá)以此來阻止中腦的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡，保護(hù)中腦的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的效果，對(duì)PD起到治療效果。

本實(shí)驗(yàn)顯示空白對(duì)照組的PC12細(xì)胞中的Cav1.3基因表達(dá)蛋白的含量要低于6-OHDA作用組，造成這樣的原因?yàn)?-OHDA是一種具有神經(jīng)細(xì)胞毒性的物質(zhì)，6-OHDA作用組的PC12細(xì)胞受到了6-OHDA的神經(jīng)毒素作用受到了損傷，細(xì)胞內(nèi)的代謝程度下降呈現(xiàn)壞死狀態(tài)，導(dǎo)致Cav1.3基因的表達(dá)增加，會(huì)引起鈣超載從而加重細(xì)胞的損傷。在檢測(cè)中可以發(fā)現(xiàn)17β-雌二醇對(duì)PC細(xì)胞起到了保護(hù)作用，降低了6-OHDA對(duì)其的毒性效果，讓細(xì)胞沒有受到那么大的損傷，使得相關(guān)蛋白的含量要低于作用組，其作用原理為17β-雌二醇通過擴(kuò)散作用進(jìn)入到PC12細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞核類的相關(guān)受體產(chǎn)生結(jié)合發(fā)揮作用，提高增加神經(jīng)細(xì)胞活性的相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞不受6-OHDA的影響，不會(huì)影響Cav1.3基因的表達(dá)。17β-雌二醇的濃度越高對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)效果越好。

綜上，雌二醇對(duì)PD細(xì)胞損傷模型中PC12細(xì)胞Cav1.3基因的表達(dá)有著積極的影響，雌二醇可通過保護(hù)PD細(xì)胞損傷模型中PC12細(xì)胞從而避免細(xì)胞中的Cav1.3基因表達(dá)過高，并且雌二醇的濃度與Cav1.3基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)， 6-OHDA制備PC12細(xì)胞損傷模型，在6-OHDA作用組中Cav1.3的表達(dá)增高；加了雌二醇保護(hù)后，增高的Cav1.3基因的表達(dá)量下降，期望為PD的治療提供一定參考和思路。