柚皮苷通過(guò)miR-34a下調(diào)MET表達(dá)并抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞增殖和凋亡

汪冬梅 劉丹 郝鳳杰 王立東 王興波

(承德市中心醫(yī)院 1內(nèi)分泌科，河北 承德 067000；2體檢中心)

甲狀腺癌(TC)是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤。在過(guò)去30年，我國(guó)TC的發(fā)病率和死亡率逐年增加。TC可分為乳頭狀TC、濾泡狀TC、甲狀腺髓樣癌及間變性TC，其中乳頭狀TC占所有TC的70%～80%，而間變性TC只占所有TC的1%左右，但惡性程度最高，超過(guò)一半的TC患者死亡是間變性TC導(dǎo)致的?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，中藥的有效成分對(duì)TC具有明顯的抑制作用，具有對(duì)患者副作用較小、治療途徑廣泛等特點(diǎn)。柚皮苷(NRG)是從柚子等柑桔類植物中提取的一種由葡萄糖、鼠李糖和柚配質(zhì)的復(fù)合體，是一類天然類黃酮化合物，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)心血管和抗腫瘤等作用〔1〕。有報(bào)道稱，NRG在治療異種移植食管癌小鼠的過(guò)程中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性〔2〕；Erdogan等〔3〕報(bào)道，NRG可作為化療增敏劑，增強(qiáng)紫杉醇對(duì)前列腺癌細(xì)胞的毒性作用，從而抑制前列腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移。MicroRNA(miRNA)是一種在真核細(xì)胞內(nèi)廣泛分布的小分子非編碼RNA，參與了眾多疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，其中就包括TC〔4,5〕。Chen等〔6〕研究表明，miR-34a在TC組織中的表達(dá)下調(diào)，且可通過(guò)靶向GLUT1調(diào)節(jié)與氟脫氧葡萄糖的親和力。Chen等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)，NRG可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-126/VCAN-1信號(hào)通路抑制非小細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)PI3K與其下游分子蛋白激酶B(AKT)所組成的信號(hào)通路與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡等生物學(xué)過(guò)程。Cheng等〔8〕研究表明，NRG可通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活抑制大腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，Li等〔9〕研究顯示，miR-34a也可以通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路的激活抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)展。但到目前為止，NRG對(duì)TC是否有抗癌活性及其抗癌機(jī)制仍不明確，本文旨在探討NRG對(duì)TC的抗癌活性，并探究miR-34a和PI3K/AKT信號(hào)通路在TC中的作用。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 NRG(純度：≥98%，規(guī)格：20 mg，批號(hào)：110722-201815)、MTT試劑、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒及ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于中國(guó)Beyotime公司；RIPA裂解液購(gòu)于中國(guó)Solarbio公司；ANNEXIN-V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于中國(guó)Beyotime公司；青霉素、鏈霉素及DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine 2000試劑盒、TRIzol試劑盒、SYBR GREEN試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；二甲基亞砜(DMSO)試劑購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Applied Biosystems公司；海腎熒光素酶psiCHECK2載體購(gòu)于美國(guó)Promega公司。兔抗人MET單克隆抗體、PI3K單克隆抗體、p-PI3K單克隆抗體、AKT單克隆抗體和p-AKT單克隆抗體均購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2細(xì)胞 人甲狀腺癌細(xì)胞系(乳頭狀TC細(xì)胞TPC-1、間變性TC SW1736細(xì)胞)和人正常甲狀腺Htori-3細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究資源中心。

1.3儀器 BJPX-200恒溫培養(yǎng)箱(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)；HBS-1096C酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；CyFlow Cube6流式細(xì)胞儀(廣州吉源生物科技有限公司)；A320離心機(jī)(上海友聲衡器有限公司)；FA2204G電子天平(常州萬(wàn)泰天平儀器有限公司)；qRT-PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Mini-ProteanTetra小型垂直電泳槽(上海土森視覺(jué)科技有限公司)。

1.4方法

1.4.1組織收集 收集承德市中心醫(yī)院手術(shù)切除的甲狀腺癌組織樣本及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織，患者在術(shù)前均已簽署知情同意書，且患者及其家屬均明確本研究的目的及意義，本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4.2細(xì)胞培養(yǎng) 將TPC-1和SW1736細(xì)胞接種于含10%胎牛血清(FBS)，100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2條件的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TPC-1和SW1736細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔的密度接種至6孔板內(nèi)，在37℃，5%CO2條件的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)24 ，使用Lipofectamine 2000試劑盒將miR-NC、miR-34a mimics轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4細(xì)胞處理 在37℃條件下，調(diào)整NRG濃度為6、12、25 μg/ml處理TPC-1和SW1736細(xì)胞12 h、24 h、48 h或72 h。收集處理后的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.5MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 將TPC-1和SW1736細(xì)胞以2 000個(gè)/孔的密度分別接種至96孔板中，在培養(yǎng)箱中孵育24 h后使用濃度為6、12、25 μg/ml的NRG分別處理兩種細(xì)胞12、24、48或72 h。隨后將20 μg/ml的MTT試劑添加至各孔中，在37℃條件下繼續(xù)孵育4 h。最后加入150 μl DMSO終止孵育，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490 nm出的吸光光度(OD)值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將TPC-1和SW1736細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的密度分別接種至6孔板，在37℃條件下用使用濃度為6、12、25 μg/ml的NRG處理48 h，隨后使用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，在4℃條件下2 000 r/min離心5 min并收集沉淀。在室溫下使用5 μl的ANNEXIN-V-FITC和10 μl PI染色15 min。隨后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平，并通過(guò)FlowJo 10.6.2軟件分析數(shù)據(jù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.7RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-34a及蛋白mRNA表達(dá) 根據(jù)TRIzol試劑盒說(shuō)明書提取甲狀腺組織、TPC-1和SW1736細(xì)胞內(nèi)總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照SYBR GREEN試劑盒說(shuō)明書構(gòu)建PCR體系，PCR如循環(huán)參數(shù)如下： 95℃持續(xù)5 min，95℃持續(xù)45 s，60℃持續(xù)45 s，72℃持續(xù)60 s，共進(jìn)行40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。以U6或GAPDH作為內(nèi)參。結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.4.8Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中MET及PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 用濃度為6、12、25 μg/ml的NRG處理TPC-1和SW1736細(xì)胞48 h，使用RIPA裂解液收集細(xì)胞總蛋白，使用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。在12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中分理出50 mg的蛋白裂解物并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在室溫下用5%的脫脂奶粉封閉2 h后將稀釋后(1∶1 000)的一抗在4℃條件下孵育過(guò)夜，隨后與稀釋后(1∶2 000)的二抗在室溫下孵育2 h。最后使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，使用ImageJ 1.52a軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.9雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-34a與MET的靶向關(guān)系 擴(kuò)增MET后將其克隆至海腎熒光素酶psiCHECK2載體中，構(gòu)建野生型MET質(zhì)粒(MET-WT)。將MET突變后克隆至載體內(nèi)構(gòu)建突變型MET質(zhì)粒(MET-MUT)。使用Lipofectamin 2000試劑盒將MET-WT和MET-MUT或miR-NC和miR-34a mmics共轉(zhuǎn)染至Htori-3細(xì)胞內(nèi)，24 h后測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的熒光素酶活性。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1NRG抑制TPC-1和SW1736細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 與NRG共培養(yǎng)后，TPC-1和SW1736細(xì)胞的增殖受到明顯抑制(P<0.05)，呈現(xiàn)出明顯的劑量和時(shí)間依賴性。TPC-1和SW1736細(xì)胞經(jīng)NRG處理后其凋亡率也顯著增加(P<0.05)，也呈現(xiàn)出明顯的劑量和時(shí)間依賴性。RT-qPCR檢測(cè)TPC-1和SW1736細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度NRG(0、6、12、25 μg/ml)處理48 h后，兩種細(xì)胞內(nèi)cyclinD1 mRNA和c-Myc mRNA的表達(dá)水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同樣地，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)TPC-1和SW1736細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，隨著NRG處理濃度的增加，兩種細(xì)胞內(nèi)survivin mRNA和Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平逐漸降低，但細(xì)胞內(nèi)caspase-3 mRNA、Cleaved-caspase-3 mRNA及Bax mRNA的表達(dá)水平逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1，圖2，表2。

與0 μg/ml組比較：1)P<0.05,2)P<0.01圖1 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TPC-1和SW1736細(xì)胞增殖

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TPC-1和SW1736細(xì)胞凋亡水平

表2 TPC-1和SW1736細(xì)胞內(nèi)cyclinD1、c-myc蛋白及凋亡相關(guān)蛋白mRNA水平和細(xì)胞凋亡水平

2.2NRG抑制炎性介質(zhì)在TPC-1和SW1736細(xì)胞中的表達(dá) CCR6、CXCR4和CXCR7 mRNA在TC組織中的表達(dá)水平(2.36±0.13、2.01±0.16、1.89±0.11)明顯高于正常甲狀腺組織(1.00±0.02、0.98±0.06、1.00±0.05，P<0.01)。在TPC-1和SW1736細(xì)胞內(nèi)CCR6(1.87±0.17、2.13±0.13)、CXCR4(1.64±0.17、2.13±0.12)和CXCR7 mRNA表達(dá)水平(1.72±0.16、1.97±0.12)也遠(yuǎn)高于HTori-3細(xì)胞(1.00±0.01、1.00±0.03、0.99±0.04，P<0.05)。經(jīng)過(guò)不同濃度NRG(0、6、12、25 μg/ml)處理后，TPC-1和SW1736細(xì)胞內(nèi)CCR6、CXCR4和CXCR7 mRNA的表達(dá)水平逐漸降低，且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 柚皮苷抑制TPC-1和SW1736細(xì)胞中炎性介質(zhì)的表達(dá)

2.3NRG調(diào)控miR-34a和MET的表達(dá)并抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活 miR-34a在TC組織和細(xì)胞中的表達(dá)均下調(diào)(P<0.01)；MET mRNA在TC組織和細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)增加(P<0.01)。不同濃度的NRG(0、6、12、25 μg/ml)處理后細(xì)胞內(nèi)miR-34a表達(dá)水平顯著增加，且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性(P<0.05)。隨著NRG濃度的增加，TPC-1和SE1736細(xì)胞內(nèi)MET蛋白的表達(dá)量逐漸降低，呈現(xiàn)出劑量依賴性(P<0.05)。此外，隨著NRG濃度的增加，TPC-1和SW1736細(xì)胞內(nèi)p-PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)量降低(P<0.05)，即NEG處理抑制了細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路的激活(P<0.05)，見(jiàn)表4～6，圖3。

表4 RT-qPCR檢測(cè)miR-34a和MET mRNA在TC組織的表達(dá)水平

表5 RT-qPCR檢測(cè)miR-34和MET mRNA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平

表6 RT-qPCR檢測(cè)miR-34在不同濃度給藥組細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平

圖3 Western印跡檢測(cè)MET、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白在TPC-1和SW1736細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平

2.4上調(diào)miR-34a抑制MET的表達(dá)并抑制PI3K/AKT信號(hào)通路激活 轉(zhuǎn)染miR-34a mimics后，細(xì)胞內(nèi)miR-34a的表達(dá)水平顯著增加(P<0.001)。Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-34a顯著抑制TPC-1和SW1736細(xì)胞內(nèi)MET蛋白的表達(dá)(P<0.05)。ENCORI預(yù)測(cè)結(jié)果顯示MET是miR-34a的下游靶基因，靶向結(jié)合序列見(jiàn)圖4。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，過(guò)表達(dá)miR-34a顯著抑制野生型MET(MET-WT)的熒光素酶活性(0.36±0.04 vs 1.01±0.05，P<0.01)。MTT檢測(cè)TPC-1和SW1736細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-34a顯著抑制細(xì)胞的增殖能力(P<0.01)，且細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)蛋白cyclin D1和c-Myc mRNA的表達(dá)水平也顯著降低(P<0.01)。同樣地，過(guò)表達(dá)miR-34a顯著增強(qiáng)了對(duì)TPC-1和SW1736細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用(P<0.01)，細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白survivin和Bcl-2 mRNA的表達(dá)受到明顯抑制(P<0.01)，caspase-3、cleaved caspase-3和Bax mRNA的表達(dá)量明顯增加(P<0.01)。Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-34a也可以顯著抑制細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路的激活(P<0.01)，且顯著抑制細(xì)胞內(nèi)炎性介質(zhì)CCR6、CXCR4和CXCR7 mRNA的表達(dá)(P<0.01)，見(jiàn)圖5～7,表7,圖8。

圖4 靶向結(jié)合序列

圖5 Western印跡檢測(cè)結(jié)果

與miR-NC組比較：1)P<0.05,2)P<0.01圖6 MTT檢測(cè)TPC-1和SW1736細(xì)胞增殖

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TPC-1和SW1736細(xì)胞凋亡水平

表7 上調(diào)miR-34a后TPC-1和SW1736細(xì)胞內(nèi)蛋白、mRNA水平及細(xì)胞凋亡水平

圖8 MTT檢測(cè)TPC-1和SW1736細(xì)胞增殖

3 討 論

TC是分布較為廣泛的一種惡性腫瘤，隨著TC發(fā)病率的逐年上升，各國(guó)學(xué)者都在尋找新型且有效的治療方案〔10〕。NRG是柚皮中含量較為豐富的一種純天然黃酮化合物，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性〔11〕，因此在本項(xiàng)目中將明確NRG對(duì)TC的抗腫瘤作用。

本研究結(jié)果表明NRG以劑量和時(shí)間依賴性的方式抑制TPC-1和SW1736細(xì)胞的增殖。同時(shí)，NRG劑量依賴性地增加了TPC-1和SW1736細(xì)胞的凋亡。為明確其抑制TPC-1和SW1736細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的分子機(jī)制，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)了兩種細(xì)胞內(nèi)增殖和凋亡相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)水平。G1/S-特異性周期蛋白(cyclin)D1是一個(gè)由人類CCND1基因編碼的蛋白質(zhì)，屬于高度保守的細(xì)胞周期家族，可促進(jìn)腫瘤的增殖并參與腫瘤的發(fā)生〔12〕。c-Myc癌基因是Myc基因家族的重要一員，是一種可使細(xì)胞獲得無(wú)限增殖和永生化功能的基因，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔13〕。在此項(xiàng)目中發(fā)現(xiàn)，隨著NEG濃度的增加，處理48 h后兩種細(xì)胞內(nèi)cyclinD1和c-Myc mRNA的表達(dá)水平逐漸降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這也就解釋了NRG會(huì)以劑量依賴性的方式抑制TPC-1和SW1736細(xì)胞的增殖。凋亡抑制基因survivin是抗凋亡基因家族中的新成員，具有腫瘤特異性，只表達(dá)在腫瘤和胚胎組織中，與腫瘤的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔14〕。B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2是一種癌基因，具有明顯的抗凋亡作用〔15〕。capsapse-3是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)劑，在癌癥細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)抑制了癌細(xì)胞的凋亡〔16〕。Bax基因是與Bcl-2同源的蛋白，是Bcl-2基因家族中重要的促凋亡蛋白，Bax蛋白的過(guò)度表達(dá)可抑制Bcl-2基因的保護(hù)效應(yīng)而促使細(xì)胞發(fā)生凋亡〔17〕。此項(xiàng)目中發(fā)現(xiàn)，survivin和Bcl-2 mRNA在兩種細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)隨著NRG劑量的增加而減少，且差異性顯著。與此相反的是，caspacse-3、cleaved caspase-3和Bax mRNA在兩種細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平隨著NRG濃度的增加而逐漸上調(diào)?？傊?，NRG通過(guò)抑制TPC-1和SW1736細(xì)胞內(nèi)cyclinD1和c-Myc mRNA的表達(dá)抑制細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)出明顯的劑量和時(shí)間依賴性。同時(shí)NRG通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)survivin、Bcl-2 mRNA的表達(dá)并上調(diào)caspase-3、cleaved caspase-3及Bax mRNA的表達(dá)，劑量依賴性地促進(jìn)TPC-1和SW1736細(xì)胞的凋亡。

研究表明，患有甲狀腺炎的患者患TC的風(fēng)險(xiǎn)增加，且在TC患者的癌癥組織中常出現(xiàn)免疫浸潤(rùn)〔18〕，提示炎癥反應(yīng)可能是誘發(fā)TC的危險(xiǎn)因素。趨化因子受體是參與和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的化學(xué)因子，其中一些不僅由免疫細(xì)胞產(chǎn)生，而且在正常的甲狀腺細(xì)胞和TC細(xì)胞中產(chǎn)生，被認(rèn)為與腫瘤進(jìn)展和患者預(yù)后相關(guān)〔19〕。CCR6是趨化因子CCL20的唯一受體，CCR6與CCL20在許多預(yù)后不良的癌癥中表達(dá)增加，且在TC的多種細(xì)胞系中均發(fā)現(xiàn)了CCR6 mRNA的表達(dá)增加〔20〕。CXCR4是CXCL12的受體，是在TC中研究最多的趨化因子受體之一，通常情況下CXCR4在正常TC組織和細(xì)胞中基本不表達(dá)，而在TC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)明顯升高〔21〕；有研究表明，過(guò)度表達(dá)的CXCR4還表現(xiàn)出了對(duì)癌細(xì)胞的抗凋亡作用，且增強(qiáng)了TC的轉(zhuǎn)移能力〔22〕。CXCR7通過(guò)與CXCL12和CXCL11結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞的黏附、遷移增殖和凋亡〔23〕。Werner等〔24〕研究發(fā)現(xiàn)，CXCR7在TC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)明顯升高，其表達(dá)水平也與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。此外Zhang等〔25〕研究結(jié)果表明，CXCR7可通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路的激活抑制TC細(xì)胞的增殖和遷移。在此項(xiàng)目中發(fā)現(xiàn)，CCR6、CXCR4和CXCR7 mRNA的表達(dá)水平在TC組織和細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)均顯著增加，但經(jīng)過(guò)NRG處理后細(xì)胞內(nèi)CCR6、CXCR4和CXCR7 mRNA逐漸降低，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。上述研究結(jié)果也在一定程度上解釋了NRG對(duì)TPC-1和SW1736細(xì)胞增殖的抑制作用和對(duì)其凋亡的促進(jìn)作用。

miR-34a位于人類1p36號(hào)染色體之上，通常被認(rèn)為是抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子，其功能包括通過(guò)靶基因調(diào)節(jié)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、增殖、遷移、凋亡及對(duì)化療藥物的敏感性〔26〕。研究顯示，miR-34a可通過(guò)與Bcl-2基因的靶向結(jié)合，抑制Bcl-2蛋白的翻譯從而發(fā)揮抗癌作用〔27,28〕。在此項(xiàng)目中發(fā)現(xiàn)，MET也是miR-34a的下游靶基因。研究顯示，MET是包括TC在內(nèi)多種癌癥的潛在治療靶標(biāo)，并且可以通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)TC細(xì)胞的增殖〔29〕。此項(xiàng)目研究結(jié)果顯示，在TC組織和細(xì)胞內(nèi)，miR-34a的表達(dá)量顯著降低，MET mRNA在TC組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯升高。經(jīng)NRG處理后細(xì)胞內(nèi)miR-34a的表達(dá)水平隨NRG濃度的增加逐漸升高，MET蛋白隨著NRG濃度的增加逐漸降低，且miR-34a負(fù)調(diào)控MET蛋白的表達(dá)。上述結(jié)果表明，miR-34a在TC組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，MET的表達(dá)上調(diào)，且miR-34a可靶向負(fù)調(diào)控MET在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。另外，過(guò)表達(dá)miR-34a顯著抑制TPC-1和SW1736細(xì)胞的增殖，并顯著抑制cyclin D1和c-Myc mRNA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。同樣地，過(guò)表達(dá)miR-34a也顯著增加了TPC-1和SW1736細(xì)胞的凋亡，并顯著影響survivin、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3和Bax mRNA的表達(dá)。

PI3K/AKT信號(hào)通路是經(jīng)典的信號(hào)通路之一，參與多種人類癌癥的發(fā)生發(fā)展。磷酸化的PI3K(p-PI3K)刺激AKT的磷酸化，并因此影響腫瘤的生物學(xué)行為〔30〕。先前的研究已證實(shí)PI3K/AKT信號(hào)通路在TC中發(fā)揮作用。在此研究中發(fā)現(xiàn)，NRG可劑量依賴性的抑制PI3K的磷酸化，進(jìn)而抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活〔31〕。此外，過(guò)表達(dá)miR-34a也顯著抑制PI3K/AKT信號(hào)通路在TPC-1和SW1736細(xì)胞中的激活。