放射照射SHR大鼠RVLM對(duì)血壓影響及可能機(jī)制

李超亞，潘金梅，韓君勇

（中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院 心血管內(nèi)科，廣東 珠海 519000）

0 引言

高血壓病是臨床的常見(jiàn)病、多發(fā)病，因其并發(fā)癥多且嚴(yán)重，是導(dǎo)致死亡的主要原因之一，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。放射治療是利用放射線治療腫瘤的一種局部治療方法。放射治療在腫瘤治療中的作用和地位日益突出，已成為治療惡性腫瘤的主要手段之一。延髓腹外側(cè)區(qū)（RVLM）是機(jī)體延髓區(qū)域內(nèi)的一個(gè)多功能復(fù)合體，具有調(diào)節(jié)機(jī)體呼吸功能、運(yùn)動(dòng)功能和心血管功能等作用。Salusin-β在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（特別是延髓）對(duì)心血管活動(dòng)具有非常重要的調(diào)節(jié)功能[2]。本實(shí)驗(yàn)擬在麻醉下給予不同劑量X射線照射SHR大鼠RVLM后觀察大鼠血壓的變化；檢測(cè)照射后大鼠RVLM中salusin-β表達(dá)的變化，初步探討放射照射SHR大鼠RVLM對(duì)其血壓影響影響及可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料。采用12周齡雄性自SHR 18只及血壓正常的同齡雄性封閉系對(duì)照WKY大鼠WKY6只為研究對(duì)象，本實(shí)驗(yàn)所用12周齡雄性SHR及其血壓正常的同齡雄性封閉系對(duì)照WKY大鼠均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)房，繁殖條件相同。本實(shí)驗(yàn)采用雙重對(duì)照組。對(duì)照組：（只麻醉不照射、即佯裝照射）照劑量為0 GY的WKY大鼠6只為WKY對(duì)照組（A組）；照劑量為0 GY的SHR大鼠6只為SHR對(duì)照組（B組）；實(shí)驗(yàn)組：照劑量為4 GY的SHR大鼠6只為低劑量照射組（C組）；照劑量為8 GY的SHR大鼠6只為高劑量照射組（D組）。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟及方法。放射照射前后體重測(cè)量：放射照射前2天及放射照射結(jié)束1周后分別采用精密天平測(cè)量各大鼠清醒安靜狀態(tài)下體重，記錄至0.1 g。放射照射：大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，麻醉后將大鼠俯臥位固定在固定架上，使其四肢舒展開(kāi)并用膠帶固定四肢，僅頭部暴露在照射野，其余部位用防輻射鉛衣圍遮擋保護(hù)以避免照射，先置于模擬機(jī)下定位以確定照射部位RVLM，在體表標(biāo)記明確照射野，實(shí)驗(yàn)組輻照裝置用中山大學(xué)第五附屬醫(yī)院放療科提供的醫(yī)科達(dá)直線加速器產(chǎn)生的6 MV的X射線一次性分別給予4 Gy，8 Gy，局部照射，照射野大小為1.0×1.0 cm，（4Gy照射時(shí)間約為80 s，劑量率為300 MU/min，皮源距為100cm，照射中心在皮下1.0 cm）。SHR對(duì)照組及WKY對(duì)照組麻醉后置于放療機(jī)下佯裝照射，即只麻醉不進(jìn)行照射（0 Gy）。照射前后血壓測(cè)量：放射照射實(shí)驗(yàn)前2 d及放射照射結(jié)束1周后，分別采用BP-6無(wú)創(chuàng)動(dòng)物血壓測(cè)量系統(tǒng)測(cè)量大鼠鼠尾的動(dòng)脈血壓即收縮壓（SBP）。每只大鼠重復(fù)測(cè)量記錄三次鼠尾收縮壓，取三次測(cè)量平均值為測(cè)得收縮壓值。取延髓：采血完畢后麻醉下處死大鼠，根據(jù)Paxinos和Watson的大鼠立體定位圖譜取下頭端延髓腹外側(cè)區(qū)RVLM組織（人字點(diǎn)即對(duì)耳線后退約2.3～4.6 mm，中線旁開(kāi)約1.0～3.0 mm，小腦背側(cè)表面下降約8.5～10.5 mm），直接置于凍存管中用于Western-Blot檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)。放射照射前后大鼠體重、血壓測(cè)量、放射照射后RVLM中salusin-β表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 放射照射前后WKY及SHR大鼠體重、血壓對(duì)比。放射照射前2天對(duì)照組A組與對(duì)照組B組相比收縮壓有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）；照射前2 d對(duì)照組B組與實(shí)驗(yàn)C組、實(shí)驗(yàn)D組三組之間體重及收縮壓均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；照射結(jié)束后1周SHR大鼠間體重?zé)o明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），以上結(jié)果顯示W(wǎng)KY與SHR大鼠之間、SHR大鼠之間具有良好的可比性，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 放射照射前后WKY及SHR大鼠體重、血壓對(duì)比（±s）

表1 放射照射前后WKY及SHR大鼠體重、血壓對(duì)比（±s）

注：A組：WKY對(duì)照組、B組：SHR對(duì)照組、C組：SHR低劑量照射組、D組：SHR高劑量照射組；SBP：收縮壓；BW：體重。放射照射前A組與B組比較，★P＜0.05，★★P＜0.001。

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2.2 放射照射前后WKY及SHR大鼠收縮壓變化。照射結(jié)束后1周對(duì)照組A組收縮壓對(duì)比照射前2天變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；照射結(jié)束后1周對(duì)照組B組與實(shí)驗(yàn)組C組、實(shí)驗(yàn)組D組三組間收縮壓比較：B、C、D三組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001），結(jié)果顯示C組、D組收縮壓低于B組，D組收縮壓低于C組。提示放射照射SHR大鼠RVLM可對(duì)其收縮壓產(chǎn)生影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 放射照射前后WKY及SHR大鼠收縮壓變化（±s）

表2 放射照射前后WKY及SHR大鼠收縮壓變化（±s）

注：A組：WKY對(duì)照組、B組：SHR對(duì)照組、C組：SHR低劑量照射組、D組：SHR高劑量照射組；SBP：收縮壓。放射照射后B組、C組、D組三組間比較，★P＜0.05，★★P＜0.001。

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2.3 各組RVLM中Salusin-β在不同組間蛋白質(zhì)情況。采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western-Blot）在蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證WKY和SHR大鼠RVLM內(nèi)Salusin-β蛋白的表達(dá)差異，采用β-Actin抗體作為內(nèi)參，定量分析Salusin-β在蛋白質(zhì)水平RVLM的表達(dá)情況。Salusin-β蛋白與β-Actin抗體的Western-Blot檢測(cè)結(jié)果顯示Salusin-β蛋白在WKY和SHR大鼠在RVLM均有表達(dá)如圖1所示。A、B兩組相比較：B組Salusin-β蛋白條帶較A組粗大，提示B組Salusin-β蛋白含量較高。B、C、D三組比較：B組Salusin-β蛋白條帶較C組粗大，C組條帶較D組粗大，提示B組Salusin-β蛋白含量較C組高、C組較D組高。蛋白質(zhì)條帶圖像結(jié)果采用Image J圖像分析軟件分析，測(cè)定Salusin-β及β-Actin抗體的條帶灰度值，通過(guò)比較灰度比值分析不同組間Salusin-β的表達(dá)量。結(jié)果顯示：A、B兩組比較：B組中Salusin-β蛋白含量明顯高于A組（P＜0.05）（表3）。B、C、D三組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001），B組中Salusin-β蛋白含量明顯高于C組，C組高于D組（表4）。上述結(jié)果提示放射照射SHR大鼠RVLM可引起RVLM中細(xì)胞內(nèi)Salusin-β蛋白的含量減少。

圖1 各組RVLM中Salusin-β在不同組間蛋白水平的表達(dá)

表3 A/B兩組RVLM中Salusin-β在蛋白質(zhì)表達(dá)量（±s）

表3 A/B兩組RVLM中Salusin-β在蛋白質(zhì)表達(dá)量（±s）

注：A組：WKY對(duì) 照 組、B組：SHR對(duì) 照 組。A、B組 比 較，★★P＜0.001。

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表4 B/C/D三組RVLM中Salusin-β在蛋白質(zhì)水平表達(dá)量（±s）

表4 B/C/D三組RVLM中Salusin-β在蛋白質(zhì)水平表達(dá)量（±s）

注：B組：SHR對(duì)照組、C組：SHR低劑量照射組、D組：SHR高劑量照射組。B組、C組、D組三組間比較，★P＜0.05，★★P＜0.001。

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3 討論

高血壓可導(dǎo)致腦卒中、冠心病事件、終末期腎病的風(fēng)險(xiǎn)增加，是致死、致殘最常見(jiàn)的病因性疾病之一，嚴(yán)重消耗醫(yī)療和社會(huì)資源，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[3]。鑒于高血壓患者數(shù)量龐大，危害巨大，著手探索新的高血壓治療領(lǐng)域，尋找新的治療高血壓的方法十分必要。本研究選用12周齡雄性SHR及WKY作為研究對(duì)象，待其適應(yīng)動(dòng)物房環(huán)境后，測(cè)量其放射照射前2天體重及收縮壓，結(jié)果顯示放射照射前SHR間體重及收縮壓均無(wú)明顯差異，顯示SHR大鼠組間具有良好的可比性；照射結(jié)束后1周低劑量照射組SHR大鼠收縮壓（171.17±3.58）mmHg低于SHR對(duì)照鼠（188.38±3.04）mmHg，高劑量照射組收縮壓（163.16±3.42）mmHg低于低劑量照射組收縮壓（171.17±3.58）mmHg。這個(gè)結(jié)果表明放射照射SHR大鼠RVLM后可使其收縮壓下降，本研究還發(fā)現(xiàn)血壓下降程度與照射劑量大小相關(guān)。然使其血壓下降的具體機(jī)制仍不十分明確。

新近發(fā)現(xiàn)的Salusins是一種具有內(nèi)源性心血管調(diào)節(jié)活性肽，在動(dòng)物及人體心血管系統(tǒng)均有多方面的影響[4]；Salusin-β在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（特別是延髓）對(duì)心血管活動(dòng)具有非常重要的調(diào)節(jié)功能。在麻醉大鼠延髓經(jīng)典升壓區(qū)頭端延髓腹外側(cè)區(qū)（RVLM）微量注射Salusin-β可產(chǎn)生快速、顯著的升高血壓，加快心率效應(yīng)。Salusin-β在SD大鼠RVLM產(chǎn)生劑量依賴性升高血壓的作用[5]。我們的研究通過(guò)Western-Blot法檢測(cè)了SHR及WKY大鼠RVLM組織中Salusin-β表達(dá)情況，結(jié)果提示：SHR對(duì)照組大鼠RVLM組織中Salusin-β表達(dá)高于WKY對(duì)照組大鼠，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與前人研究結(jié)果一致，支持SHR大鼠RVLM組織中Salusin-β表達(dá)高低與其高血壓發(fā)展形成具有相關(guān)性。放射照射結(jié)束1周后SHR對(duì)照鼠、低劑量照射的SHR大鼠、高劑量照射的SHR大鼠三組間比較：三組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；大鼠RVLM組織中Salusin-β表達(dá)SHR對(duì)照鼠高于低劑量照射的SHR大鼠；低劑量照射的SHR大鼠高于高劑量照射的SHR大鼠。結(jié)合前述前人研究結(jié)果：RVLM微量注射salusin-β可升高血壓，及我們前面放射照射后SHR大鼠RVLM使其血壓下降，我們推測(cè)放射照射SHR大鼠RVLM后引起其RVLM中Salusin-β表達(dá)的減少可能是引起照射后收縮壓下降的因素之一，放射照射劑量高低與Salusin-β表達(dá)高低有關(guān)。

綜上所述，放射照射RVLM可引起自發(fā)性高血壓大鼠收縮壓下降，收縮壓下降程度與接受照射劑量高低相關(guān)；自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）血壓升高的原因與RVLM中Salusin-β表達(dá)情況相關(guān)。自發(fā)性高血壓大鼠RVLM中Salusin-β表達(dá)減少可能是引起其照射后收縮壓下降的因素之一。