生鮮乳中四環(huán)素類藥物殘留的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法研究

蘇銀池 高 娜 岳婷婷 李靜茹 連真真 閆 磊

（1. 河南省種牛遺傳性能測(cè)定中心， 鄭州 450000； 2. 河南省奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定有限公司， 鄭州 450000；3. 河南省奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定中心， 鄭州 450000）

四環(huán)素類抗生素是由放線菌產(chǎn)生的一類抗生素， 高濃度時(shí)具有殺菌作用， 因?qū)υx(chóng)、 衣原體、霉形體、 螺旋體、 革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都具有抑制作用， 因此又被稱為廣譜抗生素[1～5]。 該類抗生素主要包括土霉素、 四環(huán)素、 多西環(huán)素和金霉素等。 目前， 四環(huán)素類抗生素已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療上以及作為添加劑添加到飼料中[6～10]。 我國(guó)《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》 對(duì)豬、雞等動(dòng)物飼料中允許添加的土霉素和金霉素含量規(guī)格進(jìn)行了規(guī)范[11]， 但是由于四環(huán)素類抗生素易溶于水， 而且在環(huán)境中不容易降解， 食用了含有四環(huán)素類抗生素的飼料或者接受了四環(huán)素類抗生素治療的奶牛， 雖然一部分藥物會(huì)產(chǎn)生效用并分解， 但是大部分藥物會(huì)隨著糞便、 牛奶和尿液排放出來(lái)。 人飲用了含有四環(huán)素藥物殘留的牛奶后， 藥物在肝臟、牙齒和骨骼中容易產(chǎn)生積累， 當(dāng)積累到一定程度便會(huì)造成過(guò)敏反應(yīng)、 影響腸道菌群和導(dǎo)致胎兒畸形等危害[12～17]。 因此農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于 2018 年出臺(tái)了 《獸用抗菌藥使用減量化行動(dòng)試點(diǎn)工作方案 （2018－2021 年）》， 以期在有限時(shí)間內(nèi)盡可能減少藥物作為飼料添加劑用于養(yǎng)殖過(guò)程中的飼養(yǎng)模式[18]。

目前檢測(cè)四環(huán)素類抗生素藥物常用的方法有分光光度法、 化學(xué)發(fā)光法、 免疫法、 毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法、 液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法等[19～23]。傳統(tǒng)的分光光度法、 化學(xué)發(fā)光法、 毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法操作快捷簡(jiǎn)便， 但靈敏度很低[24～25]；免疫學(xué)檢測(cè)靈敏度較強(qiáng)， 也更加快速[26～27]， 但是由于非特異性吸附， 容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性。 以上方法普遍存在基質(zhì)效應(yīng)過(guò)高、 靈敏度過(guò)低的問(wèn)題。隨著科技的進(jìn)步， 光譜、 色譜等技術(shù)被越來(lái)越多地用于生產(chǎn)實(shí)踐中[28]。 液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法 （LCMS/MS） 由于其良好的色譜分離能力以及質(zhì)譜的高靈敏度和選擇性， 能夠?qū)Χ喾N四環(huán)素類藥物同時(shí)進(jìn)行化學(xué)組分定量和定性分析， 且由于其智能化和機(jī)械性操作， 處理后的多個(gè)樣品能夠完全機(jī)械化上機(jī)進(jìn)樣， 省時(shí)省力[29]。 但目前的方法提取過(guò)程、 儀器型號(hào)復(fù)雜多樣， 且國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中還沒(méi)有專門針對(duì)生鮮乳中四環(huán)素類藥物殘留檢測(cè)的液質(zhì)方法。 因此， 本文在傳統(tǒng)方法基礎(chǔ)上， 研究建立生鮮乳中四環(huán)素類藥物殘留的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法， 旨在為生鮮乳中四環(huán)素類藥物殘留的檢測(cè)提供參考。

一、 材料與方法

（一） 實(shí)驗(yàn)材料

1.試劑耗材。 對(duì)照品： 鹽酸四環(huán)素 （純度96.2%）、 鹽酸土霉素 （純度 96.0%）、 鹽酸金霉素（純度92.5%）、 鹽酸多西環(huán)素 （純度98.7%） 均購(gòu)自 Dr.Ehrenstorfer GmbH； 甲醇、 乙腈和甲酸 （色譜純， 德國(guó)默克集團(tuán)）； 乙二胺四乙酸二鈉 （分析純， 天津市大茂化學(xué)試劑廠）。 固相萃取柱： Agela Cleanert PEP－2 SPE （200 mg， 6 mL）。

2. 儀器與設(shè)備。 超高效液相色譜－串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 （1290 Infinity Ⅱ－6460 Triple Quad， 安捷倫公司， 美 國(guó)）； 超純 水儀 （FIMA03180E， Millipore synergy， 美國(guó)）； 電子天平（ME204E102， Mettler Toledo， 瑞士）； 電子天平（SSartorius， 德國(guó)）。

3. 溶液配制。 （1） 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液： 準(zhǔn)確稱取適量鹽酸四環(huán)素、 鹽酸土霉素、 鹽酸金霉素、 鹽酸多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品， 分別用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成濃度為0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液， 冷凍保存。 （2） 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液： 根據(jù)需要， 用初始流動(dòng)相將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。（3）Mcllvaine 緩沖溶液： 將 1 000 mL 0.1 mol/L 檸檬酸溶液與625 mL 0.2 mol/L 磷酸氫二鈉溶液混合， 用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH 至4.0。 Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液： 稱取60.5 g 乙二胺四乙酸二鈉溶于上述配制好的Mcllvaine 緩沖溶液中， 必要時(shí)可超聲。

（二） 實(shí)驗(yàn)方法

1. 色譜條件。 色譜柱為 C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）； 柱溫為 30℃； 進(jìn)樣體積為 20 μL； 流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水， B 為乙腈， 梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

2. 質(zhì)譜參數(shù)。 離子源為 ESI； 離子化模式為正離子模式； 干燥氣溫度為350℃； 干燥氣流速為11 L/min； 干燥氣壓力為40psi； 毛細(xì)管電壓為4 000V。

3.提取與凈化。 （1） 提取。 稱取混合均勻的生鮮乳 5 g 于 50 mL 離心管中， 加入 0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 提取液溶解并定容至50 mL， 渦旋振蕩混合均勻， 超聲提取10 min， 轉(zhuǎn)移至聚丙烯離心管中， 0～4℃條件下， 6 000 r/min 離心 10 min， 用快速濾紙過(guò)濾， 待凈化。 （2） 凈化。 準(zhǔn)確吸取 10 mL 濾液以 1 滴 /s 的速度過(guò) HLB 柱 （使用前依次用5 mL 甲醇和5 mL 水進(jìn)行預(yù)處理）， 待樣液完全流出后， 依次用5 mL 水和5%甲醇水溶液淋洗，棄去全部流出液。 最后用8 mL 的甲醇+乙酸乙酯（V∶V＝1∶9） 進(jìn)行洗脫， 收集洗脫液， 將洗脫液在40℃下用氮?dú)獯蹈桑?用初始流動(dòng)相1 mL 復(fù)溶，濾膜過(guò)濾， 供超高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

二、 結(jié)果與討論

（一） 質(zhì)譜條件優(yōu)化采用ESI 源 （電噴霧離子源） 對(duì)四環(huán)素、 土霉素、 金霉素和多西環(huán)素的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描， 通過(guò)優(yōu)化解離電壓， 讓準(zhǔn)離子分子[M+H]+豐度達(dá)到最大， 通過(guò)優(yōu)化碰撞電壓， 使子離子的豐度最大化， 選擇干擾小和豐度大的離子作為定性離子和定量離子。 4 種化合物的一級(jí)、 二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1～圖4， 優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

圖1 四環(huán)素一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖

圖2 土霉素一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖

圖3 金霉素一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖

圖4 多西環(huán)素一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖

（二） 液相色譜條件優(yōu)化化合物采用正離子模式進(jìn)行掃描， 在軟電離過(guò)程， 化合物需要獲得H+， 因此本實(shí)驗(yàn)采用以0.1%的甲酸和乙腈為流動(dòng)相， 進(jìn)行梯度洗脫。 為了獲得良好的化合物峰形，并且讓化合物之間得到良好的分離， 本文對(duì)梯度洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化。 4 種化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖見(jiàn)圖5， 從圖中可以看出， 4 種化合物得到很好的分離， 峰尖峭， 且峰形對(duì)稱， 無(wú)雜質(zhì)干擾。

圖5 4 種化合物總離子流圖

本研究在流動(dòng)相的選擇上并未使用三氟乙酸溶液， 而采用了0.1%的甲酸水作為水相。 隨著儀器精密度的增高， 對(duì)所用試劑的純度和要求也越來(lái)越高， 三氟乙酸作為一種強(qiáng)揮發(fā)性酸， 不僅有輕微的毒性， 且存在很強(qiáng)的背景干擾， 尤其是對(duì)于負(fù)離子模式下有很強(qiáng)的離子抑制作用， 同時(shí)會(huì)殘留污染質(zhì)譜。 因此選擇0.1%的甲酸水和乙腈作為本方法的A 相和B 相， 經(jīng)優(yōu)化后按照本方法設(shè)置的流動(dòng)相梯度進(jìn)行試驗(yàn)分離效果較好， 分離時(shí)間為7 min，比國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法用時(shí)縮短了2/3。 且為了盡可能減少儀器殘留和過(guò)載， 本法降低了進(jìn)樣量， 比國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)樣量減少1/3。

（三） 線性范圍根據(jù)上述的儀器條件， 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定， 以四環(huán)素類藥物的濃度為橫坐標(biāo)， 響應(yīng)面積為縱坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線， 如圖6 所示， 四環(huán)素、 土霉素、 金霉素和多西環(huán)素在1.0～500 ng/mL 濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系， 相關(guān)系數(shù)R2＞0.999， 回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)圖6。

圖6 4 種化合物的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

（四） 固相萃取柱的篩選本研究在進(jìn)行固相萃取凈化時(shí)所取濾液為10 mL， 若使用規(guī)格為60 mg、 3 mL 的固相萃取柱會(huì)增加柱子的負(fù)荷， 延長(zhǎng)過(guò)柱時(shí)間。 通過(guò)對(duì)不同廠家、 不同型號(hào)以及不同規(guī)格的固相萃取柱進(jìn)行篩選， 發(fā)現(xiàn)在相同的提取效率下， 使用規(guī)格為 200 mg、 6 mL 的 Agela Cleanert PEP－2 SPE 固相萃取柱時(shí)， 能夠很大程度上增加過(guò)柱速率， 縮短過(guò)柱時(shí)間， 降低成本。

（五） 準(zhǔn)確度及精密度實(shí)驗(yàn)在空白樣品中加入不同濃度的四環(huán)素、 土霉素、 金霉素和多西環(huán)素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液， 加入量分別 5、 10、 50 和 100 μg/kg， 每個(gè)加標(biāo)量同時(shí)做6 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)， 按照上文的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行樣品處理， 通過(guò)數(shù)據(jù)處理計(jì)算方法的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）， 結(jié)果見(jiàn)表3。在4 個(gè)不同加標(biāo)量水平條件下， 回收率在74.1%～106.8%范圍內(nèi)，RSD≤3.3%（n＝6）。 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中RSD在2.2%～7.4%范圍內(nèi)， 與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相比， 本方法具有更好的精密度。

表3 4 種化合物的回收率和精密度 （n＝6）

（六） 檢出限該方法的檢出限（LOD）通過(guò)信噪比 （S/N）≥3 來(lái)確定， 在空白生鮮乳樣品中加入四環(huán)素、 土霉素、 金霉素和多西環(huán)素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液， 使其濃度為0.5 μg/kg。 各個(gè)目標(biāo)分析物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)圖見(jiàn)圖7， 從圖中可以看出， 四環(huán)素、 土霉素、 金霉素和多西環(huán)素的方法檢出限為0.5 μg/kg，而國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢出限為50 μg/kg。

（七） 定量限該方法的定量限 （LOQ） 通過(guò)信噪比（S/N）≥10 來(lái)確定， 在空白生鮮乳樣品中加入四環(huán)素、 土霉素、 金霉素和多西環(huán)素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液， 使其濃度為1.0 μg/kg。 各個(gè)目標(biāo)分析物定量限的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)圖見(jiàn)圖7， 從圖中可以看出， 四環(huán)素、 土霉素、 金霉素和多西環(huán)素的方法定量限為1.0 μg/kg。

圖7 4 種化合物檢出限與定量限的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)圖

三、 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定生鮮乳中四環(huán)素、 土霉素、 金霉素和多西環(huán)素殘留的方法。 通過(guò)優(yōu)化儀器條件和前處理?xiàng)l件， 確定了該方法的檢出限為 0.5 μg/kg， 定量限為 1.0 μg/kg。 通過(guò)加標(biāo)回收和平行測(cè)定實(shí)驗(yàn)， 確定了準(zhǔn)確度和精密度， 結(jié)果表明， 該方法具有靈敏度高、 特異性好、重復(fù)性高和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)， 是測(cè)定生鮮乳中四環(huán)素類抗生素藥物殘留的理想方法。