核酸適配體技術(shù)在海洋生物毒素快速檢測中的應(yīng)用

吳益春 王曉煜 蘇 滿 祝世軍 周 勇 羅海軍 郭海波

（1. 舟山市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院， 浙江舟山 316012； 2. 浙江海洋大學(xué)， 浙江舟山 316022）

近年來， 我國沿海赤潮發(fā)生率顯著上升， 平均每一年爆發(fā)的次數(shù)和累計(jì)面積都有增加[1]。 海水富營養(yǎng)化、 近海的氮磷量增加， 促進(jìn)了某些有害藻類的生長繁衍[2]， 這不僅對海洋生物造成了極大威脅， 也對人類的身體健康構(gòu)成了較大的危害[3]。

一、 海洋生物毒素概況

海洋生物毒素為海洋生物體內(nèi)存在的一類高活性特殊代謝成分， 大多數(shù)具有劇烈毒性， 是海洋生物活性物質(zhì)研究中進(jìn)展最迅速的[4]， 其主要由藻類或浮游植物產(chǎn)生。 海洋生物毒素能夠在濾食性軟體貝殼類動物組織內(nèi)蓄積。 海洋污染造成的海水富營養(yǎng)化利于有毒藻類的大量繁殖， 從而引發(fā)赤潮[5]。貝類通過濾食有毒的藻類， 經(jīng)過生物累積構(gòu)成貝類毒素， 這些貝類毒素作用于人類消化系統(tǒng)、 神經(jīng)系統(tǒng)或心血管系統(tǒng)， 引起中毒， 威脅人類健康。 貝類毒素根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)可大致分為3 大類： 聚醚類毒素、 生物堿類毒素和多肽類毒素[6]。 按照毒性作用機(jī)制又分為4 大類： 腹瀉性貝毒 （diarrhetic shellfish poisoning， DSP）、 麻痹性貝毒 （paralytic shellfish poisoning， PSP）、 神經(jīng)性 貝毒 （neurotoxic shellfish poisoning， NSP）、 記憶缺損性貝毒 （amnesia shellfish poisoning， ASP）[7]。

（一） DSPDSP 的化學(xué)結(jié)構(gòu)為聚醚或大環(huán)內(nèi)酯化合物， 是一種脂溶性物質(zhì)， 其廣泛存在于軟體貝類中。 DSP 被人體攝食后主要作用于酶系統(tǒng)， 主要癥狀為腹瀉、 惡心、 嘔吐等， 目前尚無有效的治療藥物。 在大多數(shù)貝類中， 大田軟海綿酸 （OA）是DSP 的主要成分， 現(xiàn)已經(jīng)證明其具有致癌作用[8]。

（二） PSPPSP 被公認(rèn)為是目前世界上分布最廣、 事故發(fā)生頻率最高的貝類毒素。 PSP 主要由單細(xì)胞甲藻產(chǎn)生， 大致可分為3 類： 石房蛤毒素（saxitoxin， STX）、 新石房蛤毒素（neosaxitoxin，neo－STX）、 膝溝藻毒素 （gonyautoxin， GTX）。PSP 的化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定， 加熱煮熟也很難分解毒素[9]。 PSP 是一種神經(jīng)肌肉麻痹劑， 它對人體產(chǎn)生麻痹作用的機(jī)理是阻斷神經(jīng)細(xì)胞的鈉離子通道， 造成細(xì)胞間物質(zhì)傳輸障礙。 PSP 中毒會產(chǎn)生四肢肌肉麻痹、 頭痛、 惡心等不良反應(yīng)， 嚴(yán)重的會導(dǎo)致呼吸停止， 且目前沒有對癥解毒劑。

（三） NSPNSP 主要是由于貝類濾食短裸甲藻后富集至體內(nèi)而產(chǎn)生的， 被食用后會產(chǎn)生以神經(jīng)麻痹為主的中毒。 NSP 可通過兩種方法對人體造成危害， 一種是由食用了被短裸甲藻赤潮污染的貝類引起的[10]， 主要癥狀為眩暈、 頭部神經(jīng)機(jī)能失調(diào)、身體冷熱無常、 惡心、 嘔吐； 另一種是接觸了含有短裸甲藻細(xì)胞或其代謝物的海洋氣溶膠顆粒引起的呼吸道中毒， 癥狀為氣喘、 干咳等。

（四） ASPASP 是由多列擬菱形藻分泌產(chǎn)生的毒素， 其中引起中毒的成分是一種非蛋白氨基酸， 名為軟骨藻酸（domoic acid，DA）， 具有強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性， 同時(shí)也是紅藻氨酸受體的興奮劑[11]， 能夠牢固結(jié)合谷氨酸受體， 作用于興奮性的氨基酸受體和突觸傳遞素， 提高鈣離子的滲透性， 使細(xì)胞長時(shí)間處于去極化的興奮狀態(tài)而死亡， 導(dǎo)致記憶功能的長久損害。

二、 核酸適配體

核酸適配體 （aptamer， 簡稱適配體）， 是指經(jīng)過一種新的體外篩選技術(shù)——指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment， SELEX）， 在隨機(jī)單鏈寡聚核苷酸文庫中得到能特異結(jié)合蛋白或其他小分子物質(zhì)的單鏈寡聚核苷酸， 可以是RNA 也可以是DNA， 長度一般為 10～80 個(gè)核苷酸[12～13]。 眾學(xué)者利用該技術(shù)從人工合成的隨機(jī)單鏈寡聚核苷酸序列文庫中反復(fù)篩選， 得到了很多以高特異性、 高親和力與各類靶標(biāo)物質(zhì)結(jié)合為特點(diǎn)的適配體， 如凝血酶適配體[14]、 血管內(nèi)皮生長因子適配體[15]、 三磷酸腺苷適配體[16]、可卡因適配體[17]等。 適配體能通過芳香環(huán)、 π-π 堆積、 范德華力和帶電基團(tuán)之間的靜電相互作用形成特殊的三維結(jié)構(gòu)， 與靶分子特異性結(jié)合[18]。 適配體具有親和力高、 特異性強(qiáng)、 成本低、 性質(zhì)穩(wěn)定、 靶分子范圍廣、 易化學(xué)合成、 易改造、 易標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)， 目前研究中常被用作分子識別元件[19]。 由于適配體是一段單鏈寡聚核苷酸， 本身不具備識別能力， 在適配體與靶分子物質(zhì)特異性結(jié)合過程中無法產(chǎn)生可檢測的物理化學(xué)信號， 因此， 對適配體進(jìn)行篩選修飾或借助換能器， 將適配體的識別過程轉(zhuǎn)變?yōu)橐子谧R別檢測、 可定量處理的信號[20]。

適配體作為一種新型的識別分子， 被譽(yù)為 “化學(xué)抗體”， 具有以下特點(diǎn)[21～22]：（1） 適配體與靶標(biāo)結(jié)合的產(chǎn)物具有親和性和特異性， 與抗體相差較小，解離常數(shù)Kd可達(dá) nmol/L 甚至 pmol/L 數(shù)量級， 例如茶堿RNA 適配體對茶堿的親和力比咖啡因強(qiáng)1萬倍， 雖然它們的分子僅相差1 個(gè)甲基， 但仍能夠表現(xiàn)出極佳的特異性[23]。 （2） SELEX 是一種體外篩選適配體的技術(shù)， 可以從隨機(jī)單鏈寡聚核苷酸序列文庫中篩選出特異性與靶向物質(zhì)高度親和的適配體。 （3） 所選適配體序列易于大批量合成， 也可通過PCR 技術(shù)進(jìn)行大批量復(fù)制， 無需動物或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)， 周期短， 成本低。 （4） 適配體的目標(biāo)類型多，例如小分子的氨基酸、 核苷酸、 金屬離子、 毒素、有機(jī)染料、 抗生素、 輔助因子， 或者大分子的生物， 如酶、 生長因子、 抗體、 核酸和蛋白質(zhì)， 甚至是完整的病毒。 （5） 適配體不易受到外界影響， 在室溫下可以長期貯存和運(yùn)輸； 作為寡聚核苷酸的適配體分子即使變性之后， 也可以在合適的條件下發(fā)生復(fù)性。 因此， 以適配體作為識別分子的生物傳感器能夠反復(fù)利用[24]。 （6） 適配體有利于標(biāo)記和化學(xué)修飾， 可隨時(shí)將官能團(tuán)引入隨機(jī)單鏈寡聚核苷酸序列文庫， 也可在化學(xué)合成過程中進(jìn)行官能團(tuán)的標(biāo)記， 方便其檢測應(yīng)用。 （7） 適配體的相對分子質(zhì)量較小， 不具有免疫原性， 而且組織穿透力強(qiáng)， 可以滲透入細(xì)胞， 獲得更多的表相， 可應(yīng)用于藥物輸送、 分子成像和細(xì)胞內(nèi)診斷等。 （8） 適配體的二級結(jié)構(gòu)容易被預(yù)測， 使用核酸酶等工具酶對其進(jìn)行裁剪、 切割、 改造， 提高其親和力和特異性， 有助于發(fā)展多元化的檢測方法。 細(xì)菌和細(xì)胞等也可作為適配體篩選的靶標(biāo)。 抗體和適配體的比較見表1[25]。

表1 抗體和適配體的比較

三、 核酸適配體技術(shù)在海洋生物毒素檢測中的應(yīng)用

海洋生物毒素檢測方法主要包括： 小鼠生物檢測法、 免疫分析法、 大型儀器檢測法和毛細(xì)管電泳法。 小鼠生物檢測法是依據(jù)小鼠被注射毒素后的存活時(shí)間和癥狀來評估毒性[26]。 該方法簡單易行， 適用范圍大， 但只能測定毒素的毒性， 無法確定含量， 可重復(fù)性差， 難以大規(guī)模推廣。 免疫分析法是通過毒素抗原和抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物的性狀和活性特點(diǎn)對樣品中的毒素進(jìn)行定性、 定位和定量檢測， 檢測靈敏度高， 檢測迅速， 但抗體制備困難，不宜長期貯存。 大型儀器檢測法包括高效液相色譜法 （HPLC）、 液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法 （LCMS/MS） 等。 HPLC 是基于樣品提取物的純凈度，運(yùn)用高效液相色譜儀分離樣品， 再通過紫外吸收檢測、 電化學(xué)檢測和熒光檢測等方法進(jìn)行分離， 能夠準(zhǔn)確定量檢測毒素， 靈敏度高， 具有較高的可靠性， 但操作復(fù)雜， 所需設(shè)備較多， 無法進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測[27]。 LC－MS/MS 可以高靈敏度識別毒素， 目前已廣泛用于海洋生物毒素分析， 但它需要復(fù)雜的儀器和具有很強(qiáng)的操作能力的專業(yè)人員。 毛細(xì)管電泳法[28]是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道， 以高壓直流電場為驅(qū)動力， 根據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離分析方法， 該方法檢測速度快、 高效， 但干擾因素多， 僅能用于毒素的實(shí)驗(yàn)室定量檢測。 綜上所述， 現(xiàn)有的海洋生物毒素檢測方法都具有一定局限性， 尋找一種簡單方便、 靈敏度高的快速檢測方法成為當(dāng)務(wù)之急。 以下是目前已經(jīng)報(bào)道的海洋生物毒素適配體序列、 親和力等信息及其篩選方法 （見表2）。

表2 目前已經(jīng)報(bào)道的海洋生物毒素適配體序列、 親和力等信息及其篩選方法

石房蛤毒素 （STX） 是水產(chǎn)品質(zhì)量和安全檢測中最重要項(xiàng)目之一[29]。 就現(xiàn)階段來看， 該毒素主要采用小鼠生物檢測法和免疫分析法[30]。 在2012 年，HANDY 等[31]首次報(bào)道了篩選STX 特異性適配體的研究， 第一次將核酸適配體技術(shù)應(yīng)用于海洋生物毒素檢測研究。 由于STX 相對分子質(zhì)量小， 與核酸分子結(jié)合較難， 因此在該研究中引入了一個(gè)載體——KLH， 形成了 STX－Jeffam－ine－KLH 復(fù)合物， 進(jìn)而通過SELEX 技術(shù)對適配體序列進(jìn)行篩選， 經(jīng)過10個(gè)循環(huán)的篩選， 最終得到了單一的高特異性的核酸序列——適配體APTSTX1。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)， 該適配體能穩(wěn)定、 高特異性地結(jié)合STX。 2013 年，HU 等[32]又通過 SELEX 技術(shù)篩選出了STX 抗體分子的高特異性適配體F3， 它不會和其他毒素結(jié)合，可成為STX 的替代品， 解決了STX 分離純化難的問題， 滿足了逐漸發(fā)展的STX 檢測技術(shù)對大量標(biāo)準(zhǔn)毒素的需求。 近年來隨著對STX 適配體的研究越來越深入， 逐漸地從序列的獲取轉(zhuǎn)變?yōu)閷π蛄械倪M(jìn)一步修飾， 進(jìn)而改變其二級結(jié)構(gòu)， 這一技術(shù)能夠極大地提高結(jié)合力和特異性。 2015 年， ZHENG等[33]在HANDY 等的基礎(chǔ)上對原有的適配體進(jìn)行了基因定點(diǎn)誘變和敲除等改造， 得到了一個(gè)新的適配體， 這個(gè)新的適配體對STX 的親和力更高， 比原來的適配體APTSTX1 親和力高出30 倍。

膝溝藻毒素 1/4 （GTX1/4） 是麻痹性貝類毒素， 含量較低， 但毒性劇烈， 無法利用常規(guī)手段檢測[34]。 由于存在結(jié)構(gòu)相似但功能不同的同類物 （如GTX2/3、 STX、 neo－STX 等）， 傳統(tǒng)的小鼠生物檢測法特異性差， 假陽率高， 無法快速高效地檢測[35]。2016 年， 焦炳華和王梁華教授課題組[36～37]改進(jìn)了傳統(tǒng)的 MB－SELEX 技術(shù)， 采用了新型 GO－SELEX 技術(shù)來篩選獲得GTX1/4 適配體。 經(jīng)檢測證明， GO－SELEX 技術(shù)與 MB－SELEX 技術(shù)相比，能獲得更多克隆的適配體序列， 所獲得的產(chǎn)物對于GTX1/4 有更好的特異性， 利用該技術(shù)篩選出GTX1/4 的新型適配體 GO18－Td[37]。 通過生物素－鏈霉素耦合的方法， 加工成BLI 適配體傳感器， 并與生物膜干涉技術(shù)聯(lián)用， 用于GTX1/4 的實(shí)際檢測。 該傳感器能夠穩(wěn)定檢測的濃度范圍是0.2～200.0 ng/mL， 檢測的最低值達(dá) 50 pg/mL， 且不和其他類海洋生物毒素樣品發(fā)生交叉反應(yīng)， 特異性極高。

大田軟海綿酸 （OA） 是腹瀉性貝類毒素中的主要成分。 目前主要采用小鼠生物檢測法作為OA的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法[38]， 但局限性強(qiáng)。 EISSA 等[39]利用SELEX 技術(shù)篩選出OA 的第一個(gè)特異性適配體。他們將OA 與磁珠進(jìn)行孵育， 再以磁珠為介質(zhì)與預(yù)先建立的隨機(jī)核酸分子庫結(jié)合， 4 個(gè)循環(huán)后， 采用反向篩選的方式將其中未和磁珠結(jié)合的非特異性核酸片段排除， 最終成功篩選出OA 的高特異、 高親和核酸適配體OA34。 利用OA34 構(gòu)建基于EIS 檢測的無標(biāo)記適配體傳感器， 該傳感器能檢測的范圍為 0.1～60.0 ng/mL， 最低檢測限為 70 pg/mL[40]。

短裸甲藻毒素 （BTX） 是一種經(jīng)典的神經(jīng)性貝類毒素， 致死性極強(qiáng)， 小鼠腹腔注射LD50為200 mg/kg[41]。 為提高對該毒素的檢測水平， 2014 年EISSA 等[42]通過SELEX 技術(shù)篩選出了具有高親和性的適配體BT10， 經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)， 最終確定了適配體與BTX 的最佳孵育條件， 即30 min、 pH7.5、C（Mg2+）＝10 mmol/L。 在此條件下篩選得到的適配體有更高的親和性和靈敏度， 最終可以加工成無標(biāo)記的適配體傳感器， 該傳感器的檢測最低濃度為106 pg/mL。 而且， BT10 也具有較高的特異性， 與BTX 的 2 個(gè)同類物 BTX－2、 BTX－3 有很高的親和力， 而與所檢測的其他海洋生物毒素?zé)o交叉反應(yīng)。 2016 年， TIAN 等[43]通過 12 輪篩選獲得適配體 Bap5， 與適配體 BT10 相比， Bap5 對 BTX－2具有更高的親和性， 不和其他類海洋生物毒素樣品發(fā)生交叉反應(yīng)， 適合開發(fā)為BTX－2 檢測試劑盒。

核酸適配體技術(shù)在檢測海洋生物毒素方面具有操作簡單、 靈敏度高、 選擇性好、 檢測成本低的優(yōu)點(diǎn)， 基于其高靈敏度和穩(wěn)定性， 可以開發(fā)出多種檢測試劑盒和試紙。 近年來， 有眾多學(xué)者選擇研究海洋生物毒素的特異性適配體， 使得核酸適配體技術(shù)在海洋生物毒素檢測領(lǐng)域獲得長足的發(fā)展（見表3）。

表3 基于核酸適配體檢測海洋生物毒素

四、 結(jié)語

海洋生物毒素是一種具有劇烈毒性的物質(zhì)， 對人體健康造成嚴(yán)重危險(xiǎn)。 因此， 開發(fā)一種能夠快速檢測海洋生物毒素的方法變得十分迫切。 核酸適配體技術(shù)作為一種新型的海洋生物毒素檢測方法， 雖然在靈敏度方面不如大型儀器檢測法， 但相比其他檢測技術(shù)， 具有操作簡單、 快速、 成本低， 不需要對被測樣品進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理， 更不需要昂貴的儀器和專業(yè)的操作， 其靈敏度完全能滿足日常檢測的需要， 是一種非常有前景的檢測技術(shù)。

就現(xiàn)在而言， 基于核酸適配體技術(shù)的檢測基本還是以定性為主， 研發(fā)出穩(wěn)定、 高靈敏度、 高通量、 可現(xiàn)場定量的檢測技術(shù)就顯得極為重要， 是未來的發(fā)展方向。