不同產(chǎn)地翠冠梨果的GC-IMS 香氣指紋圖譜差異性分析

張文君 李慧冬 毛江勝 方麗萍 丁蕊艷 郭長英 顏朦朦 陳子雷，2

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所， 山東省食品質(zhì)量與安全檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100； 2. 山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 濟(jì)南 250014）

作為梨起源中心之一， 我國具有豐富的梨種質(zhì)資源， 據(jù)報(bào)道有 13 種和 1 600 多個(gè)品種[1]， 在世界梨產(chǎn)業(yè)中占有重要地位。 近幾年， 無論栽培面積還是產(chǎn)量都迅速發(fā)展， 梨屬新品種也在逐年增加[2～3]。但市售梨果分級粗糙、 品質(zhì)參差不齊， 品種名稱不規(guī)范、 產(chǎn)地不清， 優(yōu)勢品牌發(fā)展受到一定的限制[4]。

果實(shí)香氣可以客觀反映果實(shí)的風(fēng)味特性及成熟程度， 同時(shí)直接決定著果實(shí)及其加工品的品質(zhì)， 顯著影響市場競爭力[5～6]。 已有學(xué)者針對果品香氣物質(zhì)的鑒定與差異性進(jìn)行研究， 以期通過了解果品中的香氣化學(xué)組成[7～8]及各因素影響下梨果香氣的差異性， 優(yōu)化種植品種及產(chǎn)地規(guī)劃、 選擇適宜的采摘時(shí)間及貯藏方式[9～11]、 保證果品的品質(zhì)。 對于不同產(chǎn)地果品及其他農(nóng)產(chǎn)品， 大量文獻(xiàn)報(bào)道基于香氣指紋信息的產(chǎn)地差異性或判別研究可以通過不同產(chǎn)地產(chǎn)品關(guān)鍵香氣篩選與分析， 實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品產(chǎn)地與真假鑒別[12]。 這方面研究對象主要集中在茶葉[13]、 葡萄酒[14]、 水果[15]、 煙草[16]及咖啡豆[17]等產(chǎn)品， 經(jīng)研究可以確切了解不同產(chǎn)地產(chǎn)品之間的關(guān)鍵差異性揮發(fā)性香氣物質(zhì)， 分別為產(chǎn)品的產(chǎn)地鑒別提供理論依據(jù)、 關(guān)鍵鑒別指標(biāo)、 良好鑒別技術(shù)， 進(jìn)而亦可以據(jù)此實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量控制、 特色產(chǎn)區(qū)劃分、 優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)選擇、 地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)、 品牌競爭力提升等。 但目前， 未見基于揮發(fā)性香氣指紋信息的梨果產(chǎn)地差異性、 產(chǎn)地判別及溯源等方面的報(bào)道。

氣相色譜－離子遷移質(zhì)譜 （GC－IMS） 是以氣相為基礎(chǔ)， 根據(jù)氣相離子在弱電場中遷移率的不同，快速分析揮發(fā)性和半揮發(fā)性化合物的技術(shù)。 該聯(lián)用技術(shù)借助氣相色譜克服了離子遷移質(zhì)譜技術(shù)分離度差的局限性， 結(jié)合離子遷移質(zhì)譜的漂移時(shí)間分析，可提供更加豐富的三維化學(xué)信息[18]。 相比氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) （GC－MS）， GC－IMS 技術(shù)無需真空， 無需前處理， 靈敏度高、 簡單快速并且全面準(zhǔn)確[19]， 在食品風(fēng)味分析[20～21]和鑒偽[22～24]方面得到了飛速發(fā)展， 通過與化學(xué)計(jì)量學(xué)方法結(jié)合，GC－IMS 的分類率甚至可以達(dá)到100%， 逐漸成為食品風(fēng)味品質(zhì)評價(jià)、 食品真?zhèn)舞b別和原產(chǎn)地驗(yàn)證等領(lǐng)域的重要技術(shù)。 由此， 本研究應(yīng)用GC－IMS 技術(shù)對不同產(chǎn)地梨果中復(fù)雜香氣物質(zhì)進(jìn)行痕量分析，較為全面采集梨果香氣物質(zhì)指紋圖譜， 通過主成分和相似度分析， 判定香氣之間的差異性， 評價(jià)不同產(chǎn)地梨果之間的區(qū)分程度， 以期建立一種快速、 準(zhǔn)確的梨果產(chǎn)地區(qū)分方法， 為梨果產(chǎn)地鑒別及溯源提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

一、 材料與方法

（一） 材料與設(shè)備材料： 翠冠梨果分別采于福州（FZ）、 徐州（XZ）、 南昌（NC）、 武漢（WH）、宿州（SZ）及重慶（CQ）6 地。

設(shè)備： FlavourSpec?HS－GC－IMS 食品風(fēng)味分析與質(zhì)量控制系統(tǒng)[配有CTC 自動(dòng)頂空進(jìn)樣器、Laboratory Analytical Viewer （LAV） 分析軟件及GC×IMS Library Search Software 定性軟件]， 德國G.A.S 公司。

（二） HS-GC-IMS 測定條件GC： 載氣 N2（純度≥99.999%）； 進(jìn)樣針溫度為 45℃； 色譜柱FS－SE－54－CB－1 （15m， ID： 0.53 mm）； 固液膜厚度為 1 μm。 載氣流量為 0～2 min， 2 mL/min；2～20 min， 2～150 mL/min。 IMS： 漂移管長度為98 mm； 管內(nèi)線性電壓為500 V/cm； 漂移管溫度為45℃； 漂移氣 N2（純度≥99.999%）； 漂移氣流速為 150 mL/min； 放射源為射線 （氚，3H）； 離子化模式為正離子。

（三） 測試采集產(chǎn)地相同的梨果， 分別從每個(gè)梨果上豎切0.5 cm 厚的梨片， 去掉核果， 每次取3～5 個(gè)梨果上果肉 （帶皮）， 帶皮切成0.5 cm×0.5 cm 梨塊， 混合均勻， 取 2 g 樣品于 20 ml 頂空進(jìn)樣瓶中， 40℃孵化 20 min， 經(jīng)頂空進(jìn)樣 200 μL，用氣相離子遷移譜儀FlavourSpec?進(jìn)行測試。 每個(gè)樣品重復(fù)2 次。

（四） 數(shù)據(jù)處理經(jīng) LAV 和 GC×IMS Library Search Software 軟件分析得出樣品中揮發(fā)性有機(jī)物（volatile organic compounds， VOCs） 的差異譜圖，利用美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所 （National Institute of Standards and Technology， NIST） 數(shù)據(jù)庫和 IMS數(shù)據(jù)庫對物質(zhì)定性分析。 采用SPSS 22.0 進(jìn)行主成分分析 （principal components analysis， PCA）、 采用R 語言軟件進(jìn)行相似度分析。

二、 結(jié)果與分析

（一） 不同產(chǎn)地翠冠梨果中香氣物質(zhì)指紋信息的差異分析由LAV 分析軟件分析， 得到6 地翠冠梨中揮發(fā)性香氣成分的GC－IMS 指紋圖譜 （見圖 1）。 圖中縱坐標(biāo)為氣相保留時(shí)間 （retention time， RT）， 橫坐標(biāo)為離子遷移時(shí)間 （drift time，DT）。 圖譜中左側(cè)豎線為反應(yīng)離子峰 （reactant ion peak， RIP 約為 7.81～7.89 ms）。 RIP 右側(cè)的每一個(gè)點(diǎn)代表一種香氣物質(zhì)。 顏色代表物質(zhì)的濃度， 藍(lán)色表示濃度較小， 紅色表示濃度較大， 顏色越深表示濃度越大。 整個(gè)譜圖即代表了樣品的頂空成分。從圖1 中可以看出， 翠冠梨果香氣組分可以通過GC－IMS 技術(shù)很好地分離， 且可直觀看出樣品間的差異， 如圖1 中徐州與福州2 地梨果與其他4 地差異較為明顯； 重慶和宿州樣品中實(shí)線框區(qū)域的揮發(fā)性組分的含量與其他4 地差異顯著； 徐州與福州樣品中虛線框區(qū)域揮發(fā)性組分的種類及含量均與其他4 地有明顯不同。 基于揮發(fā)性物質(zhì)的氣相色譜保留時(shí)間和離子遷移時(shí)間對揮發(fā)性組分進(jìn)行定性分析， 以現(xiàn)有軟件內(nèi)置的NIST 保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫與IMS 遷移時(shí)間數(shù)據(jù)庫資料進(jìn)行鑒定， 共定性出43種揮發(fā)性物質(zhì) （見表1）， 其中酯類是主要的香氣物質(zhì)， 共32 種； 醇類、 醛類及酮類物質(zhì)也有檢出，種數(shù)分別為 6 種、 3 種、 2 種。 從峰值總量看， 重慶樣品含量最高， 為31 126 V/mV； 其次是徐州、南昌、 武漢， 在 28 678～28 924 V/mV 之間； 宿州和福州最低， 分別為23 920 V/mV、 22 227 V/mV。

表1 翠冠梨果中主要香氣物質(zhì)

圖1 6 地翠冠梨果香氣物質(zhì)離子遷移指紋圖譜

為進(jìn)一步了解不同產(chǎn)區(qū)翠冠梨果香氣物質(zhì)的變化情況， 基于Lav 軟件的Gallery Plot 分析可以直觀看到不同產(chǎn)地之間各香氣物質(zhì)的明顯差異 （見圖2）。 經(jīng)縱向比較發(fā)現(xiàn)， 福州樣品中M－己酸乙酯、M－戊酸乙酯、 D－戊酸乙酯、 M－2－甲基丁酸乙酯、 D－2－甲基丁酸乙酯、 D－丁酸乙酯、 M－2－甲基丙酸乙酯、 D－2－甲基丙酸乙酯、 丙酸乙酯、丁酸甲酯的響應(yīng)均低于其他5 地； 2－甲基丁酸甲酯、 M－己酸甲酯、 D－己酸甲酯在徐州、 福州樣品中響應(yīng)較低； 甲酸乙酯在福州、 南昌樣品中響應(yīng)較低； D－乙酸己酯在宿州樣品中響應(yīng)較低； 苯甲酸乙酯、 M－3－甲基丁酸乙酯及D－3－甲基丁酸乙酯、 M－乙酸丁酯及D－乙酸丁酯分別只在重慶、徐州、 福州樣品中響應(yīng)較高。 M－正己醇、 D－正己醇在宿州樣品中響應(yīng)較低， 其他產(chǎn)地樣品中則較高。 3－甲基丁醛在徐州樣品中響應(yīng)較高， 其余則較低。 丙酮在福州、 南昌樣品中有較高響應(yīng)， 但在徐州樣品中響應(yīng)較低。

圖2 6 地翠冠梨果Gallery Plot 分析

結(jié)合表1 進(jìn)行定量分析， 重慶樣品中的酯類物質(zhì)總峰值 （26 080 V/mV） 高于徐州 （25 315 V/mV）、 南昌 （23 181 V/mV）、 武漢 （24 161 V/mV）， 明顯高于宿州 （19 831 V/mV） 與福州（14 887 V/mV）。 主要酯類物質(zhì)為D－乙酸己酯、乙酸乙酯、 D－丁酸乙酯、 M－乙酸己酯、 丁酸甲酯、 D－己酸乙酯、 D－乙酸戊酯； D－乙酸己酯在徐州樣品中響應(yīng)峰值可達(dá)6 700 V/mV， 但在宿州樣品中僅有1 103 V/mV； 乙酸乙酯在徐州和重慶樣品中含量較高， 分別為 4 235、 3 874 V/mV， 其余樣品中峰值在2 757～3 249 V/mV 之間。 醇類物質(zhì)總峰值在徐州樣品中最高， 為3 081 V/mV， 其余樣品在2 368～2 688 V/mV 之間； 主要醇類物質(zhì)為乙醇、 M－正己醇、 M－（E） －2－己烯醇、 芳樟醇； 乙醇的峰值在 1 611～2 123 V/mV 之間， 為M－正己醇的 4～8 倍， 為 M－（E）－2－己烯醇的6～22 倍， 在徐州樣品和重慶樣品中響應(yīng)較高； 芳樟醇在各樣品中均有響應(yīng)， 峰值在98～219 V/mV之間， 重慶樣品中的響應(yīng)是其他4 地1.5 倍多。 醛類物質(zhì)總峰值同樣在徐州樣品中最高， 為425 V/mV， 其余樣品中響應(yīng)值均≤312 V/mV； 主要醛類為壬醛和3－甲基丁醛； 壬醛在宿州樣品中響應(yīng)最高， 是其他5 地的1.5 倍多； 3－甲基丁醛在徐州樣品中響應(yīng)最高， 是其他5 地的2 倍多。 福州與南昌樣品中酮類物質(zhì)總峰值較高， 分別為4 641、3 979 V/mV， 是武漢、 重慶及宿州樣品的 1.5 倍多， 徐州樣品的4 倍多； 丙酮為主要酮類物質(zhì)， 其峰值變化與總酮類峰值變化一致。 由此發(fā)現(xiàn)6 地翠冠梨果中各類香氣物質(zhì)峰值因梨果產(chǎn)地不同而有較大差異。

（二） 不同產(chǎn)地翠冠梨果香氣物質(zhì)的主成分分析通過SPSS 22.0 軟件， 對6 地翠冠梨樣品 43個(gè)香氣物質(zhì)進(jìn)行PCA， 分析得到各主成分的特征值、 方差貢獻(xiàn)率、 累積方差貢獻(xiàn)率 （見表 2）。 由表 2 可知， 特征值>1 的共 6 個(gè)主成分， 總方差99.71%的貢獻(xiàn)率來自前6 個(gè)主成分， 其方差貢獻(xiàn)率依次為 43.54%、 20.08%、 13.69%、 8.58%、8.29%和5.53%； 說明3 個(gè)主成分反映了原始變量的大部分信息。

表2 主成分方差貢獻(xiàn)率

根據(jù)主成分載荷得分可知， PC1 中載荷較高的正影響揮發(fā)性物質(zhì)主要有D－2－甲基丁酸乙酯、D－戊酸乙酯、 M－戊酸乙酯、 丁酸甲酯、 M－2－甲基丙酸乙酯、 D－己酸乙酯、 M－己酸乙酯、 M－己酸甲酯、 D－丁酸乙酯、 M－2－甲基丁酸乙酯、 庚酸乙酯、 D－2－甲基丙酸乙酯、 2－甲基丁酸甲酯，其中D－2－甲基丁酸乙酯的載荷量最高， 為0.977；載荷較高的負(fù)影響揮發(fā)性物質(zhì)有M－乙酸丁酯、D－乙酸丁酯， 最高載荷量為0.986。 PC2 中載荷較高的正影響揮發(fā)性物質(zhì)主要有乙酸丙酯、 M－3－甲基丁酸乙酯、 D－3－甲基丁酸乙酯、 3－甲基丁醛、乙醇， 其中乙酸丙酯的載荷量最高， 為0.958； 載荷較高的負(fù)影響揮發(fā)性物質(zhì)有丙酮， 其載荷量為0.818。 PC3 載荷較高的正影響揮發(fā)性物質(zhì)主要有壬醛， 載荷量為0.844； 載荷較高的負(fù)影響揮發(fā)性物質(zhì)有M－乙酸己酯、 M－正己醇， 其中M－乙酸己酯的載荷量最高， 為0.905。 上述物質(zhì)為不同產(chǎn)地翠冠梨果產(chǎn)區(qū)區(qū)分的主要貢獻(xiàn)者。

選取6 地翠冠梨果主成分得分繪制散點(diǎn)圖 （見圖3）， 發(fā)現(xiàn)平行樣品兩兩聚到一起， 但不同樣品完全區(qū)分開； 6 地梨果產(chǎn)區(qū)辨別度較高， 均能良好區(qū)分； 徐州和福州2 地樣品與其他4 地差異較大。

圖3 不同產(chǎn)地翠冠梨果香氣物質(zhì)的主成分分析

（三） 不同產(chǎn)地翠冠梨果的相似度分析利用LAV 軟件分析每種揮發(fā)性有機(jī)物信號峰的相對強(qiáng)度， 以樣品中某物質(zhì)濃度最大的信號峰定義為1，據(jù)此比較其他樣品中該物質(zhì)信號峰的強(qiáng)度， 可推斷出該揮發(fā)性有機(jī)物在不同樣品中的相對濃度， 綜合分析揮發(fā)性有機(jī)物的種類與相對濃度可以推斷出樣品的相似匹配度， 直觀反映翠冠梨果樣品之間的差異和區(qū)分度。 通過R 語言， 得到不同產(chǎn)地翠冠梨果香氣物質(zhì)的匹配矩陣 （見圖 4）。 如圖4 所示，顏色越靠近紅色， 匹配度高， 表示相似程度越高，區(qū)分度越低。 由圖中看出從香氣成分差異上看， 匹配度≥95%時(shí) （紅色區(qū)域）， 6 地翠冠梨果各自僅與同產(chǎn)地梨果相匹配； 當(dāng)匹配度在90%～95%時(shí)（橙色區(qū)域）， 樣品中僅有5%～10%的不同特征成分或成分含量明顯差異， 此時(shí)6 地樣品仍僅與同產(chǎn)地梨果相匹配， 具有良好辨識性； 當(dāng)匹配度在80%～90%時(shí)， FZ、 XZ 及 CQ 樣品中的香氣特征指紋與其他樣品差異明顯， 有較高識別性。 NC、SZ、 WH 也能較好辨識， 僅分別和 WH、 WH、 NC及SZ 有一定的相似性。 表明當(dāng)匹配度≥90%時(shí)，HS－GC－IMS 指紋特征譜圖中差異特征成分分析可以準(zhǔn)確區(qū)分6 地翠冠梨果。

圖4 不同產(chǎn)地翠冠梨果的匹配矩陣

三、 結(jié)論

相對于傳統(tǒng)的 GC－MS 法， GC－IMS 技術(shù)操作簡單， 無需樣品前處理， 20 min 即可完成香氣指紋信息的采集， 且GC－IMS 法樣品處理及分析的溫度較低， 可促使熱穩(wěn)定性較差的揮發(fā)物能夠更真實(shí)地被檢出， 實(shí)現(xiàn)揮發(fā)性組分更全面、 精確度更高的分析。 近幾年來該技術(shù)在食品風(fēng)味揮發(fā)物的定性定量分析及差異性分析中運(yùn)用廣泛， 但是未見在梨果香氣物質(zhì)研究中的應(yīng)用。 因此本實(shí)驗(yàn)選擇翠冠梨果為研究對象， 運(yùn)用GC－IMS 技術(shù)分析不同產(chǎn)地梨果揮發(fā)性香氣指紋圖譜， 通過信號峰的數(shù)量及強(qiáng)度綜合判斷不同產(chǎn)地翠冠梨果揮發(fā)性香氣物質(zhì)的差異程度； 根據(jù)樣品PCA 分析及相似度分析發(fā)現(xiàn)GC－IMS 技術(shù)采集的香氣指紋圖譜信息可以區(qū)分不同產(chǎn)地翠冠梨果， 這為梨果揮發(fā)物差異性分析、快速準(zhǔn)確的產(chǎn)地區(qū)分提供了一條新途徑。 在此基礎(chǔ)上， 若通過大量樣本的監(jiān)測和大數(shù)據(jù)分析， 可積累大量基于揮發(fā)性香氣物質(zhì)的梨果產(chǎn)地溯源理論基礎(chǔ)， 為實(shí)現(xiàn)梨果產(chǎn)地溯源模型的建立及修正提供可行依據(jù)； 基于揮發(fā)性香氣物質(zhì)的差異性篩選， 聯(lián)合代謝組學(xué)、 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析等， 可深度研究產(chǎn)地的因素、 果園管理過程等如何影響梨果香氣物質(zhì)的變化， 為優(yōu)化梨果種植及品質(zhì)提升提供重要理論參考， 同時(shí)基于揮發(fā)性香氣物質(zhì)指紋圖譜的梨果GC－IMS 差異性分析也將在梨果品質(zhì)評價(jià)、 品種選育、 香氣物質(zhì)數(shù)據(jù)庫的建立、 梨果加工工藝優(yōu)化等方面具有良好的應(yīng)用前景。