紅托竹蓀液體菌種發(fā)酵條件配方優(yōu)化研究

劉 錫， 葛萃萃， 羅 倩， 王 瑩， 向 準(zhǔn)， 劉忠玄 ， 楊澍雨

(1.貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院， 貴陽(yáng) 550018； 2.浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司， 浙江 杭州 310009；3.貴州師范學(xué)院， 貴陽(yáng) 550012； 4.貴州省生物研究所， 貴陽(yáng) 550009)

紅托竹蓀(DictyophoraRubrovolotaZang)是一種清香型大型食用真菌[1]，是我國(guó)四大人工栽培竹蓀(紅托竹蓀，長(zhǎng)裙竹蓀，棘托竹蓀和短裙竹蓀)中品質(zhì)最好，價(jià)格最高，形態(tài)最美的一種，素有“蘑菇皇后，真菌之花，面紗女郎，林中之王”等美譽(yù)[2]。紅托竹蓀經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高，近年來(lái)相關(guān)產(chǎn)品價(jià)格也逐年增長(zhǎng)，2016—2019年，貴州省紅托竹蓀干品產(chǎn)地批發(fā)價(jià)從500元·kg-1逐年上升到800元·kg-1。由于紅托竹蓀栽培難度較高，干品產(chǎn)量差異較大，產(chǎn)量從50～150 kg·(667 m2)-1不等，其較高的經(jīng)濟(jì)效益吸引了不少企業(yè)和個(gè)人進(jìn)行投資，廣東，四川，湖南，廣西等省均有從貴州省引種進(jìn)行馴化栽培，但到目前為止，除貴州省外，其他地區(qū)沒(méi)有形成穩(wěn)定的規(guī)模化栽培，原因可能與貴州省獨(dú)特的高涼地理氣候環(huán)境有關(guān)。

紅托竹蓀是貴州獨(dú)具特色的優(yōu)勢(shì)食用菌，其產(chǎn)量占全國(guó)紅托竹蓀總產(chǎn)量的90%以上，貴州省織金縣為中國(guó)紅托竹蓀之鄉(xiāng)，織金紅托竹蓀于2010年獲得國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品。紅托竹蓀在貴州省產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)程中，其顯著的生物學(xué)特征表現(xiàn)有菌種生長(zhǎng)速度慢，抗逆性較差，這導(dǎo)致紅托竹蓀菌種生產(chǎn)周期長(zhǎng)[3]，病蟲(chóng)害(特別是紅托竹蓀的腐爛病)發(fā)生嚴(yán)重[4-5]，這一技術(shù)瓶頸制約了紅托竹蓀產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，致使其種植規(guī)模一直徘徊在330～670 hm2。增強(qiáng)紅托竹蓀菌種抗逆性和縮短菌種生產(chǎn)周期[6-8]，在生產(chǎn)中采用栽培菌棒直接覆土栽培[9-12]，改變傳統(tǒng)栽培模式，是促進(jìn)紅托竹蓀產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)。為此，本研究擬優(yōu)化紅托竹蓀液體菌種配方，提高菌種生長(zhǎng)速度，縮減菌種生產(chǎn)周期，降低菌種污染率，破除技術(shù)瓶頸，促進(jìn)紅托竹蓀產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1供試菌株

紅托竹蓀HT-027，來(lái)源于貴州省生物研究所。

1.1.2儀 器

振蕩培養(yǎng)全溫?fù)u床AHBS-E 200；電子天平BSA 224 S；智能型人工氣候箱RQX-400 B；單人凈化工作臺(tái)SW-CJ-1 F；超聲波清洗器JN-3200 DTS；電熱鼓風(fēng)干燥箱101-1 BS；循環(huán)水多用真空泵SHB-3。

1.1.3玻璃器皿

錐形瓶，培養(yǎng)皿，試管，玻棒，移液槍，燒杯，玻璃漏斗，量筒，布氏漏斗等。

1.1.4藥品與其他材料

葡萄糖，白砂糖，蔗糖，蛋白胨， MgSO4·7 H2O，酵母膏，氯化銨，半乳糖，尿素，磷酸二氫鉀，硝酸鎂，羥甲基纖維素鈉，玉米面，小米面，紅薯，馬鈴薯， 瓊脂等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基制作

1) 母種制備：將紅托竹蓀試管種接種于不同配方培養(yǎng)基里，進(jìn)行培養(yǎng)并觀察。待出現(xiàn)菌絲時(shí)，進(jìn)行隔天觀察，記錄菌絲封面時(shí)間、菌絲長(zhǎng)度及長(zhǎng)勢(shì)等指標(biāo)。計(jì)算菌絲平均滿管時(shí)間及生長(zhǎng)速度。

制作方法：稱取200 g削皮馬鈴薯塊加水煮沸，用玻璃棒輕戳馬鈴薯塊，可呈粉狀脫落即可，煮液用四層紗布過(guò)濾后，在濾液中加入20 g瓊脂，加熱過(guò)程中用玻璃棒進(jìn)行攪拌，直到瓊脂完全溶于水中，在溶液中加入白砂糖，MgSO4·7 H2O，磷酸二氫鉀，用玻棒攪拌至藥劑完全溶液后，用水定容至1 000 mL燒杯中，pH值不需要調(diào)節(jié)，趁熱將培養(yǎng)基裝入錐形瓶中，用棉塞進(jìn)行密封，在高溫條件下進(jìn)行滅菌。將滅菌后的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)(約10 mL)，待培養(yǎng)基凝固后，在培養(yǎng)皿中心位置接入紅托竹蓀菌種，以上操作均在超凈工作臺(tái)進(jìn)行。隨后，將其放入溫度設(shè)置為26 ℃的人工氣候箱中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，待培養(yǎng)皿布滿菌絲后，用作液體培養(yǎng)基菌種。其他培養(yǎng)基制作方法同上。

2) 基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，蛋白胨2 g，磷酸二氫鉀1 g，MgSO4·7 H2O 0.5 g，用水定容至1 000 mL，pH自然[13]。制作方法同上。

1.2.2紅托竹蓀菌種液體培養(yǎng)

無(wú)菌條件下，用0.5 cm打孔器沿培養(yǎng)皿母種邊緣取菌塊若干，在每個(gè)裝有100 mL基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的三角瓶中加入4塊0.5 cm直徑母種菌塊，置于26 ℃條件下靜置培養(yǎng)，48 h后，菌種塊在液體培養(yǎng)基表面開(kāi)始萌發(fā)，出現(xiàn)菌絲時(shí)，以120 r·min-1的轉(zhuǎn)速恒溫水浴振蕩器培養(yǎng)，培養(yǎng)的第3天開(kāi)始，每72 h取3瓶，觀察菌絲體顏色，稱量菌絲干重，共觀察30 d。

菌絲干重的測(cè)量方法：首先將濾紙?jiān)诤嫦渲懈稍镏梁阒?，用萬(wàn)分之一電子天平稱量濾紙質(zhì)量，再將濾紙放置在相應(yīng)大小的布氏漏斗中，將培養(yǎng)液從三角瓶中全部倒出至布氏漏斗過(guò)濾，再用蒸餾水過(guò)濾清洗濾紙2次，將濾紙和附著在濾紙上的菌絲一起放入恒溫干燥箱(50 ℃)干燥至恒重，用萬(wàn)分之一電子天平稱量干燥后濾紙質(zhì)量，用過(guò)濾后濾紙質(zhì)量減去過(guò)濾前濾紙質(zhì)量，即是菌絲干重。

1.2.3碳源的篩選

以葡萄糖、半乳糖、白砂糖等為碳源各20 g，空白對(duì)照培養(yǎng)基不加白砂糖，每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)，接種后第18天，各處理經(jīng)過(guò)過(guò)濾、無(wú)菌水濾洗、干燥、稱量，得到不同碳源培養(yǎng)條件下菌絲體干重[14]。

1.2.4氮源的篩選

以酵母膏、氯化銨的氮源分別代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，空白對(duì)照培養(yǎng)基不加氮源，各設(shè)5個(gè)重復(fù)，接種后第18天，各處理按照過(guò)濾、無(wú)菌水濾洗、干燥、稱量進(jìn)行，得到各種氮源條件下菌絲體干重[15]。

1.2.5紅托竹蓀菌絲體液體發(fā)酵正交試驗(yàn)

以蛋白胨(A)，面粉(B)，接菌量(C)，發(fā)酵時(shí)間(D)為因子，設(shè)計(jì)L16(34)正交試驗(yàn)，每個(gè)處理各設(shè)5個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)為菌絲體干重，根據(jù)結(jié)果探討并優(yōu)化紅托竹蓀菌絲體發(fā)酵技術(shù)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅托竹蓀母種菌絲生長(zhǎng)狀況記錄及分析

2.1.1紅托竹蓀母種在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

由表3可知，紅托竹蓀母種在各種淀粉培養(yǎng)基和樺槁木屑培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，其中面粉培養(yǎng)基生長(zhǎng)最旺盛，菌絲密度高(特濃密)。雖然在松針培養(yǎng)基中也可生長(zhǎng)，但菌絲長(zhǎng)勢(shì)較弱，菌絲密度不高，生長(zhǎng)稀疏。

表3 紅托竹蓀母種在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Table 3 Growth of D. rubrovolota in different media

2.1.2紅托竹蓀母種在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率

由圖1可知，紅托竹蓀母種在不同供試培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，其中面粉培養(yǎng)基生長(zhǎng)速率最快，第15天菌落直徑為4.7 cm；在松針培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率最慢，第15天菌落直徑為1.0 cm。試驗(yàn)結(jié)果表明，紅托竹蓀母種在玉米，面粉，馬鈴薯及松針-馬鈴薯等淀粉類培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率相對(duì)較快，在松針，樺槁的木屑類培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率相對(duì)較慢。

2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)紅托竹蓀菌絲體干物質(zhì)積累的影響

由圖2 可知，菌絲在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)第3天開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，第21天菌絲干重達(dá)到最高，隨后菌絲干重開(kāi)始下降。菌絲體顏色在第3天開(kāi)始出現(xiàn)淡紫紅色，培養(yǎng)至21 d，瓶壁菌絲顏色漸漸變暗。結(jié)果表明，以基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基為基質(zhì)，紅托竹蓀HT-027作為母種，在溫度為26 ℃進(jìn)行培養(yǎng)的時(shí)間以15～21 d為宜。

2.3 碳源對(duì)紅托竹蓀菌絲體生長(zhǎng)的影響

由表5可知，小麥粉和玉米粉是紅托竹蓀液體發(fā)酵過(guò)程中最容易吸收的供試碳源，以其作為碳源的菌絲體生長(zhǎng)量(干重)分別為0.49 g和0.48 g。小麥粉和玉米粉在0.05和0.1水平上沒(méi)有顯著差異，但與其他供試碳源存在極顯著差異；其次容易被紅托竹蓀吸收的碳源分別是米粉，小米粉，葡萄糖，馬鈴薯粉，紅薯粉和蔗糖，在相同培養(yǎng)條件下，菌絲體生長(zhǎng)量(干重)分別為0.42 g，0.41 g，0.39 g，0.38 g，0.32 g和0.24 g；紅托竹蓀菌絲體對(duì)羥甲基纖維素鈉，半乳糖，松針吸收很弱；菌絲體生長(zhǎng)量(干重)僅為0.17 g，0.16 g和0.11 g；空白對(duì)照(ck)最弱，生長(zhǎng)極其緩慢，菌絲生長(zhǎng)量?jī)H為0.10 g。

表4 不同碳源對(duì)紅托竹蓀菌絲體生長(zhǎng)的影響Table 4 Effects of different carbon sources on mycelium growth of D. rubrovolota

表5 不同氮源對(duì)紅托竹蓀菌絲體生長(zhǎng)的影響Table 5 Effects of different nitrogen sources on mycelium growth of D. rubrovolota

2.4 氮源對(duì)紅托竹蓀菌絲體生長(zhǎng)的影響

由表6可知，蛋白胨和酵母膏是紅托竹蓀在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中最易吸收的供試氮源，菌絲體生長(zhǎng)量分別為0.61 g和0.58 g。蛋白胨和酵母膏對(duì)其他供試的氮源在0.05和0.1水平上存在極顯著差異；其次是碳酸氫銨，磷酸二氫銨，硝酸銨，氯化銨和硝酸鎂，在相同培養(yǎng)條件下，菌絲體生長(zhǎng)量(干重)分別為0.27 g，0.26 g，0.25 g，0.23 g和0.22 g；紅托竹蓀菌絲體對(duì)尿素吸收很弱；菌絲體生長(zhǎng)量(干重)僅為0.11 g；空白對(duì)照(ck)最弱，菌絲體生長(zhǎng)量(干重)為0.10 g，生長(zhǎng)極其緩慢。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，蛋白胨是供試氮源中紅托竹蓀液體培養(yǎng)基最佳氮源。

2.5 紅托竹蓀菌絲體液體發(fā)酵正交試驗(yàn)

通過(guò)紅托竹蓀HT-027液體發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果可知，菌株HT-027培養(yǎng)基的最優(yōu)組合是A3B1C3D2，即在蛋白胨0.1%，面粉1%，接菌量為8塊(直徑0.5 cm，圓形)，培養(yǎng)時(shí)間為15 d的條件下，HL-027具有最好的菌絲生長(zhǎng)量，100 mL液體培養(yǎng)基中菌絲干重為0.76 g(表6)。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析Table 6 Orthogonal test results and intuitive analysis

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

1) 紅托竹蓀在液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，第3天時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第21天菌絲體干重達(dá)到最大，隨后小幅度下降。因此可以判斷制備紅托竹蓀液體菌種制備時(shí)間控制在12～18 d為宜。

2) 篩選的多種供試碳源中，面粉是紅托竹蓀最好的碳源，液體培養(yǎng)18 d后，紅托竹蓀菌絲體干重達(dá)到0.49×10-2g·mL-1；紅托竹蓀最適宜的氮源是蛋白胨和酵母膏，在相同條件下，菌絲體干重達(dá)到0.55×10-2g·mL-1和0.51×10-2g·mL-1。

3) 正交試驗(yàn)結(jié)果表明，紅托竹蓀HT-27菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)組合是A3B1C3D2，即蛋白胨0.1%，玉米粉1%，接菌量為8塊(直徑0.5 cm，圓形)，時(shí)間15 d條件下，HT-027具有最好的菌絲生長(zhǎng)量，100 mL液體培養(yǎng)基中菌絲干重為0.76 g，在該條件下HT-027菌絲球長(zhǎng)勢(shì)最好，菌球致密，大小均勻，數(shù)量眾多。

3.2 討 論

1) 紅托竹蓀菌絲體在受到光線，摩擦等因素的干擾下，菌絲會(huì)由白色變成淺紫紅色，這可能是菌種應(yīng)急代謝的一種反應(yīng)，通常情況下，這個(gè)特征明顯的紅托竹蓀菌種具有較好的抗逆性，出菇特性較好，將之作為衡量菌種質(zhì)量的一個(gè)指標(biāo)進(jìn)行深入研究，對(duì)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有較大意義。

2) 紅托竹蓀供試碳源篩選過(guò)程中，淀粉類碳源能為紅托竹蓀提供較好的營(yíng)養(yǎng)供給，而其他碳源不容易被吸收；供試氮源中，生物質(zhì)氮源(蛋白胨，酵母膏)普遍比較容易被紅托竹蓀菌種吸收，植物容易吸收的氨態(tài)氮和硝態(tài)氮紅托竹蓀不容易吸收，表明紅托竹蓀對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收具有一定選擇性，深入研究易被紅托竹蓀吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以提高紅托竹蓀的生產(chǎn)效率，獲得更好的經(jīng)濟(jì)效益。