響應(yīng)面法優(yōu)化紫丁香愈傷組織誘導(dǎo)條件及防褐化研究

郭彩珍

(呂梁學(xué)院生命科學(xué)系， 山西 呂梁 033000)

anti-browning agent

紫丁香(SyringaoblataLind.)別名丁香、華北紫丁香、百結(jié)、情客，具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。紫丁香的葉和樹皮均可入藥；從紫丁香中提取的紫丁香苷有強(qiáng)烈的抗肝毒作用[1-2]。但因紫丁香是木本植物，相比較草本植物需要較長的營養(yǎng)生長期，這是利用傳統(tǒng)育種方法改良其性狀的主要障礙，所以木本植物的遺傳轉(zhuǎn)化遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于草本植物，而利用植物細(xì)胞離體培養(yǎng)技術(shù)對研究紫丁香的高頻再生體系及高效遺傳轉(zhuǎn)化體系都有一定幫助[3]。

植物外植體在進(jìn)行離體培養(yǎng)時，容易發(fā)生組織和細(xì)胞的褐化、玻璃化及枯死現(xiàn)象[4-5]，會很大程度地影響組織細(xì)胞的生長繁殖以及其愈傷組織的誘導(dǎo)。關(guān)于紫丁香的栽培及化學(xué)成分的研究等方面已有過報道，但是對其外植體進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織方面的研究較少[6-7]。本試驗以紫丁香為材料，從最佳外植體的篩選、愈傷組織誘導(dǎo)條件的優(yōu)化及不同抗褐化劑對紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)情況的影響方面進(jìn)行綜合研究，以期為紫丁香植物資源保護(hù)和愈傷組織的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材 料

紫丁香采自呂梁學(xué)院校園內(nèi)。采用的試劑為6-BA、NAA、2,4-D(均為分析純)；聚乙烯吡咯炕酮(PVP)、活性炭(AC)、檸檬酸(CA)。

2 方 法

2.1 紫丁香誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體篩選

先將紫丁香的根、莖、葉和花用紫外燈滅菌30 min，后依次用75%酒精浸泡30 s、0.1%次氯酸鈉消毒20 min、蒸餾水沖洗4～5次，將紫丁香葉、莖和花剪成0.5 cm×0.5 cm大小，根長大約為0.5 cm[5]，然后在改良的MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2,4-D 0.4 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1培養(yǎng)基上進(jìn)行接種，光照13 h·d-1，溫度(23±2)℃，經(jīng)過3周的培養(yǎng)后觀察其愈傷組織的生長情況及誘導(dǎo)率：

誘導(dǎo)率(%)=(紫丁香誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)目/紫丁香共接種的外植體數(shù))×100%，

同時觀察愈傷組織生長狀況：+++為生長非常好、++為生長較好、+為生長非常差，根據(jù)指標(biāo)進(jìn)行誘導(dǎo)紫丁香愈傷組織最佳外植體的篩選。

2.2 單因素實驗

按表1中的激素濃度比例配置MS培養(yǎng)基，進(jìn)行紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)的單因素試驗。進(jìn)行3周的培養(yǎng)后觀察其愈傷組織的質(zhì)地、生長情況和愈傷組織數(shù)目，根據(jù)公式進(jìn)行其誘導(dǎo)率的計算。

表1 單因素試驗濃度

表2 響應(yīng)面實驗的因素和水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化紫丁香愈傷組織的誘導(dǎo)工藝

利用Design-Expert 8.0.6軟件按照表2中的因素水平進(jìn)行響應(yīng)面實驗，以紫丁香愈傷組織的誘導(dǎo)率為響應(yīng)值，優(yōu)化紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)的工藝。

2.4 不同抗褐化劑對紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在經(jīng)過響應(yīng)面試驗確定的最佳改良MS培養(yǎng)基中分別添加不同的抗褐化劑(AC、PVP、CA)見表3，對紫丁香莖愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察3周后記錄外植體褐化和愈傷誘導(dǎo)狀況，從中選出其最佳的抗褐化劑。

表3 不同濃度的抗褐化劑Table 3 Different concentrations of anti-browning agents

目視觀察其愈傷組織的褐化程度：-表示培養(yǎng)基成半透明狀，無褐化情況；+表示其切口處有褐色物質(zhì)；++表示培養(yǎng)基有少許的變色，切口處有褐色物質(zhì)；+++表示周圍培養(yǎng)基大范圍變色及發(fā)生嚴(yán)重褐變；++++表示培養(yǎng)基周圍有深度黑色及發(fā)生嚴(yán)重褐變。

愈傷組織大小的判斷標(biāo)準(zhǔn)：A是其愈傷的直徑大于0.5 cm；B是其愈傷的直徑大于0.3 cm；C是其愈傷的直徑小于0.3 cm。

褐化率(%)=(愈傷組織發(fā)生褐化的數(shù)目/共接種的數(shù)目)×100%

3 結(jié)果與分析

3.1 最佳外植體篩選

將紫丁香4種外植體接種到改良培養(yǎng)基中，進(jìn)行3周的愈傷組織誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)，都可以成功誘導(dǎo)出其愈傷組織，但其愈傷組織間有較大差異。由表4可見，莖的誘導(dǎo)率最高，達(dá)83.3%，且褐化率較低及生長狀況較好；葉誘導(dǎo)率為56.7%，褐化率為40%；根的誘導(dǎo)率較高，為73.3%，但褐化嚴(yán)重、生長狀況較差；花的誘導(dǎo)率最低，為46.7%，但生長狀況非常差。綜合分析，誘導(dǎo)紫丁香愈傷組織的最佳外植體是莖。

表4 不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)情況Table 4 Comparison of callus induction from different explants

3.2 單因素實驗

3.2.16-BA對紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表5可知，當(dāng)2,4-D和NAA濃度一定，6-BA濃度達(dá)到0.5 mg·L-1時，紫丁香愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，達(dá)76.7%,且愈傷組織生長狀況非常好；當(dāng)濃度低于或高于0.5 mg·L-1時，其誘導(dǎo)率呈下降趨勢且生長狀況較差。如果培養(yǎng)基中分裂素的含量超過一定值時，會相應(yīng)抑制其愈傷組織的誘導(dǎo)[10]。因此，6-BA濃度為0.5 mg·L-1時紫丁香愈傷組織的誘導(dǎo)率最高且生長情況最好。

表5 6-BA對紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 5 Effects of 6-BA on callus induction from S. oblata stem

3.2.22,4-D對紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表6可知，當(dāng)6-BA與NAA濃度一定，2,4-D濃度達(dá)到0.3 mg·L-1時，誘導(dǎo)率達(dá)到最高，愈傷組織的生長情況也是最好；但當(dāng)2,4-D濃度低于或高于0.3 mg·L-1時，其愈傷組織的誘導(dǎo)率下降，生長狀況較差。適度的生長素濃度會在一定程度上促進(jìn)愈傷組織的形成，而如果生長素的濃度過高時又會升高多酚氧化酶的活性，使褐化加重[10-11]。因此，2,4-D濃度為0.3 mg·L-1時，紫丁香愈傷組織的誘導(dǎo)率最高且生長情況最好。

表6 2,4-D對紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 6 Effects of 2,4-D on callus induction from S. oblata stem

3.2.3NAA對紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表7可知，當(dāng)2,4-D與6-BA濃度一定，NAA濃度為0.2 mg·L-1時，其誘導(dǎo)率達(dá)到最高；但當(dāng)NAA濃度低于或高于0.2 mg·L-1時，其誘導(dǎo)率開始下降，愈傷組織的生長狀況非常差。由此可見，紫丁香愈傷組織誘導(dǎo)的NAA濃度最佳為0.2mg·L-1。

表7 NAA對愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 7 Effects of NAA on callus induction

3.3 利用響應(yīng)面法對紫丁香莖愈傷組織的誘導(dǎo)工藝進(jìn)行優(yōu)化

3.3.1建立模型和方差分析

利用響應(yīng)面法，根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件建立3因素3水平的組合試驗，優(yōu)化紫丁香愈傷組織的誘導(dǎo)工藝，結(jié)果見表8。

表8 響應(yīng)面法試驗數(shù)據(jù)Table 8 Tested data from response surface method

對表8的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合后，得到其回歸方程：

誘導(dǎo)率=-26.490 00+203.750 00×6-BA+266.650 00×2,4-D+93.600 00×NAA-7.500 00×6-BA×2,4-D+2.500 00×6-BA×NAA+67.500 00×2,4-D×NAA-172.750 00×6-BA2-427.750 00×2,4-D2-272.750 00×NAA2

根據(jù)方差分析和顯著性檢驗的結(jié)果(表9)可知：該回歸模型的p<0.000 1極顯著，失擬項(p=0.164 8>0.05)不顯著，表明該響應(yīng)面的回歸模型擬合度良好，能較好地預(yù)測和分析紫丁香愈傷組織的誘導(dǎo)率。其各影響因素都對愈傷組織的誘導(dǎo)率有顯著影響但其影響大小不同，影響紫丁香愈傷組織誘導(dǎo)率的顯著性順序為6-BA>2,4-D>NAA。

表9 方差分析Table 9 Variance analysis

3.3.2各影響因素的交互作用分析

紫丁香愈傷組織誘導(dǎo)率與各工藝條件之間的響應(yīng)面和等高線見圖1、圖2、圖3。

通過紫丁香愈傷組織誘導(dǎo)率與各工藝條件之間的響應(yīng)面和等高線，可以反映出各因素之間的交互作用對其響應(yīng)值影響的顯著性，各因素間相互作用越強(qiáng)響應(yīng)面的曲線越陡[8-9]。 圖1、圖2、圖3表明，6-BA和NAA、NAA和2,4-D、6-BA和2,4-D之間的相互作用對其誘導(dǎo)率的影響相對較小，這個結(jié)論與方差分析的結(jié)果一致。

3.3.3模型的驗證實驗

根據(jù)軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行分析：誘導(dǎo)紫丁香莖段愈傷組織的最佳配比為6-BA濃度為0.5 mg·L-1，NAA濃度為0.2 mg·L-1，2,4-D濃度為0.3 mg·L-1，在此條件下重復(fù)3次試驗，其誘導(dǎo)率平均為84.5%。由此可知通過響應(yīng)面法優(yōu)化誘導(dǎo)條件的參數(shù)可靠，可用于實際操作。

3.4 抗褐化劑對紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)情況的影響

抗褐化劑的種類和濃度對紫丁香莖愈傷組織生長狀況的影響見表10。3種抗褐化劑對其生長情況都能產(chǎn)生一定影響,紫丁香外植體褐化程度為AC

表10 抗褐化劑種類和濃度對愈傷組織生長的影響Table 10 Effects of types and concentrations of anti-browning agents on callus growth

4 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，紫丁香莖段為愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體；其誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為：MS+6-BA 0.50 mg·L-1+2,4-D 0.3 mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1；紫丁香莖愈傷組織誘導(dǎo)的最佳抗褐化劑是濃度為0.2 g·L-1的CA。

植物生長激素在誘導(dǎo)愈傷組織的過程中起到非常重要的作用，而生長激素種類和含量不同，其誘導(dǎo)愈傷組織的影響也不同[10]；褐化問題在愈傷組織培養(yǎng)過程中普遍存在，這兩方面都對誘導(dǎo)外植體的脫分化和再分化有重大影響[11]。在本次試驗中發(fā)現(xiàn)3種植物生長調(diào)節(jié)劑及其不同濃度對紫丁香愈傷組織的影響是有差異的；PVP與AC作為無機(jī)吸附劑，其吸附性較好，能夠防止植物體自身酚類物質(zhì)的排出。而CA是抗氧化劑，可以通過改變周圍的氧化還原電勢而抑制酚類物質(zhì)氧化，但是具體的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。