大黃-3顆粒水提工藝的優(yōu)化

都麗娜，孟永梅

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059）

大黃-3為傳統(tǒng)蒙藥方劑，由大黃、訶子、天然堿組成，臨床用于治療大腸燥結(jié)、胃脹、腹痛、閉經(jīng)等[1]。本方臨床應(yīng)用的劑型為水煎湯劑，存在質(zhì)量難控、使用與運輸不便等缺點[2，3]，故應(yīng)在傳統(tǒng)湯劑的基礎(chǔ)上研制顆粒劑等新劑型，以便更好地服務(wù)于臨床。顆粒劑系原料藥物與適宜的輔料混合制成具有一定粒度的干燥顆粒狀制劑[4]，是現(xiàn)代民族藥物發(fā)展的一種常用劑型，成品質(zhì)量穩(wěn)定，具有劑量小，便于儲存、攜帶、運輸?shù)忍攸c[5]。與傳統(tǒng)飲片相比，中藥配方顆粒管理方式具有較多的優(yōu)勢[6]，且中藥配方顆粒內(nèi)部調(diào)劑出錯率與發(fā)藥出錯率均低于傳統(tǒng)中藥飲片[7]。中藥配方顆?？朔藗鹘y(tǒng)中藥湯劑煎煮過程繁瑣、量大難喝、質(zhì)量難控等諸多缺點的同時，一定程度上保證了中藥辯證施治的特色，使中藥療效得到充分的發(fā)揮[8]。有相關(guān)研究指出，其治療有效率與患者滿意程度顯著優(yōu)于傳統(tǒng)飲片[9]。蒙藥湯劑的制備與用藥方式與中藥湯劑十分相似，有部分研究者也將蒙藥湯劑制成了顆粒劑[10～12]，故本實驗綜合考慮各劑型的優(yōu)缺點，選擇將蒙藥大黃-3湯改制為顆粒劑。

方中大黃的主要活性成分蒽醌類化合物已被證實具有多種生物活性，如抗炎、抗腫瘤、抗纖維化等作用，對心腦血管、肺、肝、腦等多個器官組織具有保護作用[13，14]。且本方的泄下作用與蒽醌類化合物息息相關(guān)[15～18]。本實驗為了使其制備方式接近于臨床，用水為溶劑對藥材進行了提取[19]。大黃味苦、酸，性涼、稀、輕、動，主要有瀉下、抗菌與抗病毒、促進傷口愈合[20]、止血、抗癌[21]、抗炎、抗氧化[22]等藥理作用。方中訶子為“蒙藥之王”，味澀，性平，具有祛邪、解毒、調(diào)理體素等作用，主治赫依病，協(xié)日病，巴達干病，赫依、希拉、巴達干合并癥和聚合癥等。方中堿花為咸水湖邊生成主含碳酸鈉的分枝狀結(jié)晶，質(zhì)較輕，無臭，味咸、苦、微甘，有消食、消滯、導(dǎo)泄、驅(qū)蟲、防腐、解毒、祛巴達干作用。

為了保證該制劑的質(zhì)量及臨床療效，本實驗通過考察飲片粉碎過篩粒度、浸泡時間、液料比以及提取時間對該制劑總蒽醌含量與干浸膏得率的影響，對其進行優(yōu)化以得到大黃-3顆粒的最佳水提工藝。

1 材料與儀器

1.1 儀器

ACCHROM S6000高效液相色譜儀（中國華譜有限公司）；SECURA225D-1CN型電子天平（1·10-5電子天平，中國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；SECURA224-1CN型電子天平（1·10-4電子天平，中國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮公司）；BRANSONIC-5800型超聲波清洗機（美國必能信公司）；DHG-9420A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；LYOQuest軟件凍干機（西班牙泰事達公司）；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；Milli-Q Ditect超純水系統(tǒng)（北京博奧恒信生物有限公司）。

1.2 試劑

蘆薈大黃素（批號：110795-201710，純度98.3%）、大黃酸（批號：110757-201607，純度99.3%）、大黃素（批號：110756-201512，純度98.7%）、大黃酚（批號：110795-201712，純度98.4%）、大黃素甲醚（批號：110758-201616，純度99.0%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（美國Fisher公司，色譜純）；磷酸、三氯甲烷、鹽酸為分析純。

1.3 藥材

大黃（批號：190501030，河北濟鑫堂藥業(yè)有限公司）、訶子（批號：1910010113，河北聯(lián)康藥業(yè)有限公司）、堿面（批號：20140461，東營百佳益中藥飲片有限公司）經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院渠弼教授鑒定為正品，均符合2020年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）一部相關(guān)要求。

2 方法

2.1 總蒽醌含量測定方法

2.1.1 色譜條件 總蒽醌含量測定方法采用2020版《中國藥典》waters色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μM）；以甲醇：0.1%磷酸溶液（85：15）為流動相；檢測波長為254 nm；柱溫30℃；體積流量1 mL·min-1；進樣量為10 μL。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱取本品粉末（大黃：訶子：堿面=1∶1∶1，過四號篩）約0.30 g，置錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密移取續(xù)濾液5 mL，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中。用少量三氯甲烷洗滌容器，并加入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，加入甲醇制成蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚質(zhì)量濃度分別為1.4 μg·mL-1、2.75 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、5.5 μg·mL-1和3.5 μg·mL-1的混合對照品溶液。

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2.1.4 陰性對照品溶液的制備 按處方比例去除大黃-3湯中的大黃，按“2.1.2”項下的方法制備陰性對照品溶液。

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1 專屬性試驗 取上述混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液，使用“2.1.1”項下的實驗方法進樣測定，記錄色譜峰，詳見圖1。由圖1可知，在混合對照品溶液和供試品溶液色譜圖上有相同保留時間的色譜峰，該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC色譜圖

2.1.5.2 線性關(guān)系考察 取“2.1.3”項中所制對照品溶液，使用“2.1.1”項下的實驗方法進樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）進行回歸，得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的方程分別為Y=4782603.175X-4510.3556（r=0.9995）、Y=2280531.75X+660.7399（r=0.9998）、Y=2741113.471X-232.834（r=0.9998）、Y=3401413.952X-3878.0111（r=0.9999）、Y=4667871.938X-18,203.0823（r=0.9994）。分別在0.25～0.37 μg·mL-1、0.14～0.504 μg·mL-1、0.16～0.304 μg·mL-1、0.38～0.57 μg·mL-1、0.75～0.25 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5.3 精密度試驗 取上述供試品（取大黃、訶子、堿面三味藥粉，過10目篩，加入10倍超純水，浸泡12 h，回流提取10 min，提取2次過篩，合并濾液，再將濾液凍干72 h所得。）在“2.1.1”項色譜條件下各進樣測定6次，測得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚峰面積RSD分別為0.48%、1.26%、1.29%、1.30%、1.75%，儀器精密度良好。

2.1.5.4 重復(fù)性試驗 取同一批供試品，按“2.1.2”項下方法制備6份供試品溶液，使用“2.1.1”項下的實驗方法進樣測定，測得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚含有量RSD分別為1.71%、1.61%、1.72%、1.04%、0.82%，該方法重復(fù)性良好。

2.1.5.5 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，使用“2.1.1”項下的實驗方法，于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h進樣測定，測得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚含有量RSD分別為0.97%、1.64%、1.47%、1.76%、1.77%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5.6 加樣回收率實驗 分別取同一批供試品0.3 g，加入相當(dāng)于提取粉中成分含有量50%、100%、150%的對照品后，按“2.1.2”項下方法制備，使用“2.1.1”項下的實驗方法進樣測定，計算回收率。結(jié)果測得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚平均加樣回收率在95.68%～103.49%范圍，RSD均低于0.95%。

2.2 單因素試驗方法

使用單因素試驗方法，以總蒽醌含有量及干浸膏率為評價指標(biāo)，對飲片粉碎粒度、浸泡時間、液料比以及提取時間等4個方面對大黃-3的水提工藝進行考察篩選。

2.2.1 飲片粉碎粒度 取3份大黃-3粉各30 g，分別過10目、40目、60目篩，置于300 mL超純水中，浸泡10 h，回流提取30 min后放冷。將放冷的藥物以兩層紗布過濾后，將濾液放入-80℃冰箱中冷凍過夜，第二天進行冷凍干燥。再測定提取物的干浸膏率與總蒽醌含量。

2.2.2 浸泡時間 取6份大黃-3粉各15 g，均過10目篩，置于150 mL超純水中，分別浸泡0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h及8 h后回流提取30 min，放冷。按“2.2.1”項下的方法，測定提取物的干浸膏率與總蒽醌含量。

2.2.3 液固比 取5份大黃-3粉各15 g，過10目篩，分別置于60 mL、90 mL、120 mL、180 mL及240 mL超純水中，浸泡30 min后回流提取30 min，放冷。按“2.2.1”項下的方法，測定提取物的干浸膏率與總蒽醌含量。

2.2.4 提取時間 取5份大黃-3粉各15 g，過10目篩，分別置于240 mL超純水中，浸泡30 min后，分別回流提取10 min、20 min、30 min、60 min、90 min及120 min，放冷。按“2.2.1”項下的方法，測定提取物的干浸膏率與總蒽醌含量。

3 結(jié)果

3.1 飲片粉碎粒度的考察

中藥飲片粉碎后過10目篩后的粉末所提取出的藥物干浸膏率與總蒽醌含量最高（見表1）。

表1 飲片粉碎粒度的考察結(jié)果

3.2 浸泡時間的考察

藥物浸泡0.5 h時所提取出的藥物干浸膏率最高，浸泡1 h時總蒽醌含量最高，本實驗優(yōu)先考慮了藥物干浸膏率，且浸泡時間為0.5 h時提取工藝更加簡便易操作，故本實驗選取浸泡0.5 h進行下一步實驗。（見表2）。

表2 對浸泡時間的考察結(jié)果

3.3 對液固比（溶劑倍數(shù)）的考察

將藥物浸泡于16倍水時所提取出的藥物干浸膏率與總蒽醌含量最高（見表3）。

表3 對液固比（溶劑倍數(shù)）的考察結(jié)果

3.4 對提取時間的考察

藥物回流提取10 min時所提取出的藥物總蒽醌含量最高，雖干膏率不是最高的，但提取時間短，操作更方便（見表4）。

表4 對提取時間的考察結(jié)果

3.5 樣品含有量測定及檢驗試驗結(jié)果

取3批提取物，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，平行3份，使用“2.1.1”項下的實驗方法進樣測定，初步確定在家條件下，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚與大黃素甲醚含有量分別為0.33 mg·g-1、0.35 mg·g-1、0.11 mg·g-1、1.02 mg·g-1與0.23 mg·g-1。且3批提取物中各成分含量檢測結(jié)果滿足RSD值小于2%，表明該提取方法穩(wěn)定可行。以平均值-20%為下限，確定含有量分別不得低于蘆薈大黃素0.26 mg·g-1、大黃酸0.28 mg·g-1、大黃素0.09 mg·g-1、大黃酚0.82 mg·g-1與大黃素甲醚0.18 mg·g-1，總蒽醌含量不得低于1.63 mg·g-1。實驗結(jié)果為大黃-3中總蒽醌的開發(fā)利用提供了參考依據(jù)，單因素篩選水提工藝具有一定的參考意義。

4 討論

湯劑為中醫(yī)（蒙醫(yī)）臨床用藥的傳統(tǒng)劑型[23]，多以水為溶劑進行煎煮。大黃-3湯的傳統(tǒng)劑型也為湯劑，但其煎煮方法較多的依靠經(jīng)驗判斷，無明確規(guī)定，且目前對大黃-3湯的提取工藝研究甚少，故本實驗以蒙藥大黃-3提取物的干浸膏率與提取物中所含總蒽醌含量為依據(jù)，從四個方面對蒙藥大黃-3顆粒的水提工藝進行了單因素試驗篩選，最終確定最佳工藝為大黃-3粉末過10目篩，加16倍水，浸泡0.5 h，回流提取10 min。該工藝操作簡單，節(jié)約時間，穩(wěn)定性好，具有廣闊的發(fā)展前景，可為蒙藥大黃-3的有效成分研究及相關(guān)制劑開發(fā)提供參考。

但是本實驗的實驗方法比較簡單，不能明確這4個因素對實驗結(jié)果的影響程度以及各個實驗因素之間的相互影響作用，應(yīng)在此實驗的基礎(chǔ)上開展進一步的實驗，尋找更科學(xué)的提取工藝。