GGT在小鼠皮膚成纖維細胞中的表達及抑制酶活性對COL-I表達的影響

姜瑛 王祥 張蕾 常懷廣

【摘要】目的：觀察γ-谷?；D(zhuǎn)移酶（gamma-glutamyl transferase， GGT）在小鼠皮膚成纖維細胞中的表達，探究抑制其活性后對細胞存活率及Ⅰ型膠原表達的影響。方法：胰酶、膠原酶兩步消化法分離新生C57BL/6小鼠皮膚成纖維細胞并在培養(yǎng)板中培養(yǎng)至穩(wěn)定貼壁生長；免疫組化方法檢測GGT在小鼠皮膚成纖維細胞中的表達；生長噻唑藍（MTT）法檢測不同濃度GGsTOP對體外培養(yǎng)小鼠皮膚成纖維細胞存活率的影響；免疫熒光觀察COL-I的表達。結(jié)果：GGT在小鼠皮膚成纖維細胞中廣泛表達。抑制劑GGsTOP可以促進小鼠皮膚成纖維細胞增殖，并且使細胞內(nèi)Ⅰ型-膠原（type I collagen， COL-I）蛋白水平的表達增強。結(jié)論：GGT 在小鼠皮膚成纖維細胞中廣泛表達，抑制GGT酶活性后促進Ⅰ型-膠原表達，提示抑制劑GGsTOP可能促進創(chuàng)面愈合再上皮化過程。

【關(guān)鍵詞】γ-谷?；D(zhuǎn)移酶；皮膚成纖維細胞；細胞增殖；Ⅰ型-膠原；再上皮化

[中圖分類號]R363 [文獻標(biāo)識碼]A [文章編號]2096-5249（2021）05-0014-04

GGT is expressed in mouse skin fibroblast and GGT inhibitory activities is involved in the upregulation of CollagenⅠ expression in the mouse skin fibroblast

Jiang Ying1， 2， Wang Xiang1， Zhang Lei2， Chang Huai-guang2*（1. HaiShu Dentistry Department of Stomatological， NingBoZheJiang 315000， China； 2. NingBo Vocational College of Health， Department of Stomatology， NingBo ZheJiang 315000， China）

[Abstract] Objective： To observe the gamma glutamyl transferase （GGT） expression on mouse skin fibroblasts（MSF）， and explore whether inhibitory activity of GGT influence cell survival and collagen typeⅠ（COL-1） expression. Methods： Primary mouse dermal fibroblast cells were isolated from neonatal C57BL/6 mice by trypsin-collagen two-step digestion. The expression of GGT was analyzed by immunohistochemistry， and the effects of GGsTOP on proliferation of mouse skin fibroblasts cells were evaluated by MTT assay. The collagen type Ⅰ expression wasmeasured by immunofluorescence. Results： GGT was widely expressed on mouse skin fibroblasts. Inhibitors GGsTOP promoted mouse skin fibroblasts proliferation， and immunofluorescence showed that the protein expressions of COL-1were up-regulated. Conclusion： GGT was widely expressed in mouse skin fibroblast cells， inhibitors GGsTOP was related to the up-regulation of the expression of COL-1 while inhibition activity of GGT， inhibitors GGsTOP may promote on the re-epithelialization process of wound healing.

[Key words] gamma glutamyl transferase； skin fibroblast； cell proliferation； collagen type I； re-epithelialization

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyltransferase， GGT）是γ-谷氨酰基循環(huán)的關(guān)鍵酶，表達在細胞表面，參與內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子白三烯及前列腺素的代謝。臨床上，通常把血清中GGT水平升高作為肝臟疾病，酒精中毒，中風(fēng)和糖尿病的指標(biāo)[1-5]，并且在許多癌癥中，包括肺癌，肝癌，前列腺癌，乳腺癌中可發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)的GGT活性升高；生理學(xué)上，GGT活性維持細胞內(nèi)谷胱甘肽氧化還原的平衡，調(diào)節(jié)細胞氧化應(yīng)激水平[6]，這些過程均與皮膚組織愈合再上皮化的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[7]。為此，本研究的目的是觀察GGT在小鼠皮膚成纖維細胞中的表達情況，及抑制GGT酶活性后對小鼠皮膚成纖維細胞存活以及細胞外基質(zhì)Ⅰ型-膠原的表達情況。

1 材料和方法

1.1動物C57BL/6 小鼠4只，鼠齡約為4周，由寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物實驗中心提供。

1.2 藥品與試劑 GGsTOP （日本W(wǎng)ako）；N-乙?；腚装彼?（NAC）（美國Sigma）；抗GGT單克隆抗體（ab55138，英國abcom）；抗Ⅰ型膠原多克隆抗體（ab34710，英國abcom）；DMEM培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；0.25%胰酶-EDTA（美國hyclone）；二甲基亞砜（dimathylsulfoxide，DMSO，美國Sigma）；噻唑藍（MTT）（美國Sigma）；姬姆薩染液（碧云天生物技術(shù)有限公司）；抗熒光淬滅封片液（碧云天生物技術(shù)研究所）；GGsTOP溶液配制：將10mg GGsTop溶于10mL去離子水配制成10mM儲存液，-80℃保存。實驗前用DMEM培養(yǎng)液將其稀釋成不同濃度條件培養(yǎng)液。

1.3儀器 超凈工作臺（上海力申科學(xué)儀器公司，中國，型號：HFsafe-1200TE）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Fisher，美國，型號：371）；倒置顯微鏡（Leica，德國，型號：DMIL-LED）；熒光顯微鏡（Nikon，日本）全波長酶標(biāo)儀（BioTek，美國，型號：Epoch）；離心機（Eppendorf，德國，型號：5702 R）；微孔板振蕩器（Thermo Fisher，美國，型號：4625-1CEM）；電子天平（METTLER TOLEDO，中國，型號：EL204）。

1.4方法 ①小鼠原代皮膚成纖維細胞的分離培養(yǎng)及處理：來自新出生1～3 d的小鼠皮膚在含有0. 25%胰蛋白酶的離心管中4℃消化過夜。次日分離真皮并用0. 5 mg/ mLⅠ型膠原酶于37℃消化45 min，細胞混懸液過篩后用含10%FBS的DMEM 重懸后種培養(yǎng)皿，差速貼壁法去除非成纖維細胞。②姬姆薩染色染色法鑒定成纖維細胞形態(tài)學(xué)：爬片細胞經(jīng)4%多聚甲醛固定，姬姆薩染液染色40 min后加入等量PBS混染5min，雙蒸水沖洗、干燥后光鏡下觀察。③GGT在細胞中的小鼠皮膚成纖維細胞表達：取第四代小鼠皮膚成纖維細胞接種于24×24規(guī)格無菌處理的載玻片上，接種密度3×104/片。待細胞貼壁后棄掉原培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛固定，按照兩步法免疫組化檢測試劑盒使用說明書進行GGT抗體染色，光鏡下觀察。④MTT法檢測牙周膜細胞的增殖：PDLC以2×103/孔接種于96孔板，待細胞貼壁后，無血清 DMEM液同步過夜。不同濃度抑制劑GGsTOP（5、10、20和50 μM）條件培養(yǎng)液培養(yǎng)，每濃度設(shè)8復(fù)孔，并設(shè)置調(diào)零孔。 1、3、5、7d后，每孔加MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，結(jié)晶物充分溶解；選擇 490 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收值。⑤免疫熒光檢測COL-Ⅰ蛋白表達：實驗分組：實驗對照組、GGsTOP組、GGsTOP+NAC組、IgG陰性對照組。皮膚成纖維細胞胰酶消化，密度1×105/mL接種于處理好的24×24規(guī)格蓋玻片上培養(yǎng)24h后，PBS漂洗3次，5min/次。按照實驗分組加入不同試劑，放入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。4%多聚甲醛室溫固定細胞30min，PBS漂洗3次，5 min/次。0.2% TritonX-100作用15min，PBS漂洗3次，5 min/次。滴加非免疫山羊血清封閉液，室溫下孵育1h，傾去多余液體，不洗。滴加1%BSA稀釋的一抗，同時以同型對照（兔多抗IgG）作為陰性對照，4°C下孵育過夜。次日PBS漂洗3次，5，滴加1%BSA稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠熒光二抗或FITC標(biāo)記羊抗兔二抗（1： 200），室溫孵育1h。PBS漂洗3次，5 min/次，DAPI復(fù)染細胞核，室溫孵育10min。PBS漂洗3次，5 min/次，熒光顯微鏡下圖像采集。

1.5統(tǒng)計分析 采用SPSS 13.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計包對實驗資料進行方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01表示差異有統(tǒng)計學(xué)顯著意義。

2 結(jié)果

2.1小鼠皮膚成纖維細胞原代培養(yǎng)及鑒定 經(jīng)過40min消化后，鏡下觀察部分細胞從組織游離。培養(yǎng)后1～2d，鏡下觀察部分游離出的細胞失去活力，漂浮培養(yǎng)液中；并可見活細胞已貼壁，形態(tài)為梭形、圓形或多角形。圓形和多角形為上皮細胞樣形態(tài)，梭形為典型的成纖維細胞形態(tài)。早期上皮細胞生長占有優(yōu)勢，培養(yǎng)4d后（如圖1 a），成纖維細胞生長占優(yōu)勢。培養(yǎng)7d左右，成纖維細胞基本鋪滿瓶底，匯合成單層，并混有少量鋪路石樣、扁平狀多角形的上皮細胞（如圖1 b）。傳代后成纖維細胞長梭形，漩渦樣生長（如圖1 c）。

2.2 GGT在小鼠皮膚成纖維細胞中的表達組織學(xué)結(jié)果

在Nikon ECLIPSE 80i顯微鏡下觀察，使用Nikon DS-Ri采集系統(tǒng)、NIS-Elements BR3.0圖文處理系統(tǒng)攝片。免疫細胞化學(xué)染色顯示小鼠皮膚成纖維細胞膜有棕黃色顆粒，進一步證實GGT作為膜蛋白，在小鼠皮膚成纖維細胞呈陽性表達（如圖2）。

2.3 GGsTOP對小鼠成纖維細胞增殖的影響 與對照組相比，光鏡顯微鏡下不同濃度GGsTOP沒有對小鼠皮膚成纖維細胞的細胞形態(tài)產(chǎn)生影響，細胞長梭形，沒有出現(xiàn)壞死的細胞，并呈漩渦樣生長（如圖3A）。 MTT結(jié)果顯示濃度為5、10、20和50 μM GGsTOP處理1、3、5d后沒有對細胞存活率產(chǎn)生影響，而10 μM GGsTOP在7d時較對照組增殖活性增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（如圖4B）。以上結(jié)果說明5～50 μM GGsTOP對小鼠皮膚成纖維細胞是安全濃度，并且10 μM GGsTOP可以促進小鼠皮膚成纖維細胞增殖。

2.4 GGsTOP促進小鼠皮膚成纖維細胞COL-I合成免疫熒光 結(jié)果顯示，COL-I定位于細胞質(zhì)中，在細胞核中不表達。10和20 μM GGsTOP組細胞中COL-I有明顯的陽性信號表達，且信號明顯強于對照組；Ig G組（Negative） COL-I信號表達為陰性（如圖5）。

3 討論

γ-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶是維持細胞內(nèi)和細胞外谷胱甘肽平衡的關(guān)鍵酶，并且作為判斷肝損傷程度常用的臨床指標(biāo)。GGT在不同的組織和器官表達和功能具有差異性。據(jù)研究，GGT在腎近曲小管、肝膽小管和腦毛細血管中免疫組織化學(xué)強陽性表達[8]。本研究關(guān)注皮膚成纖維細胞中GGT的陽性表達，并且發(fā)現(xiàn)抑制酶活性加入抑制劑GGsTOP后細胞表現(xiàn)為長梭形，并且沒有出現(xiàn)壞死的細胞，表現(xiàn)出健康的成纖維細胞形態(tài)[9]。先前有研究表明GGT的傳統(tǒng)抑制劑acivicin可以使癌細胞生長停滯[10]。并且也有研究證明acivicin可以延長果蠅生命周期，具有抗衰老的功能[11]。因此，我們分析可能是不同的細胞類型、分化的不同階段及培養(yǎng)條件共同決定了GGsTOP促進增殖的作用。

研究表明GGT活性的改變可以使細胞內(nèi)出現(xiàn)短暫的氧自由基ROS的改變，Zalata[12]觀察精子內(nèi)GGT的活性與ROS的產(chǎn)生呈反比例關(guān)系，也就是抑制GGT活性可以促進ROS產(chǎn)生。該觀點也與Johnsen等人研究一致[13]。目前有許多研究證實ROS作為一種信號分子，直接參與了細胞運動的調(diào)控。創(chuàng)口附近的表層細胞層內(nèi)形成的ROS對于損傷機制十分敏感，可以直接激活MAPK信號通路，并且ROS可以通過BMP/SMAD信號通路促進成纖維細胞的遷移[14]。

COL-Ⅰ是細胞外基質(zhì)的重要成分[15]，其正常合成可以促進細胞增殖，對創(chuàng)面的愈合起到至關(guān)重要的作用[16]。細胞外基質(zhì)對細胞的增殖、分化和遷移產(chǎn)生重要影響，也參與了創(chuàng)面愈合的過程[17]。在創(chuàng)面修復(fù)早期，成纖維細胞被激活、合成并參與分泌膠原，膠原蛋白在瘢痕形成和創(chuàng)面愈合中均起到一定作用。有實驗證實[18]，小鼠創(chuàng)面難愈合與結(jié)締組織含量降低有關(guān)，而結(jié)締組織含量又與成纖維細胞和膠原蛋白的減少密切相關(guān)，這提示了膠原蛋白在細胞增殖和創(chuàng)面愈合中的作用。創(chuàng)面的愈合與瘢痕形成有關(guān)，瘢痕形成一般認為細胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）過度沉積和降解減少的結(jié)果[19]。基于以上原因，我們決定分析GGsTOP作用下小鼠成纖維細胞COL-Ⅰ蛋白水平的變化。通過結(jié)果分析，在不同濃度的GGsTOP均可以在轉(zhuǎn)錄后水平促進COL-Ⅰ蛋白表達，加入抗氧化劑NAC抑制COL-Ⅰ的合成。該結(jié)果說明GGsTOP可以通過上升小鼠成纖維細胞中COL-Ⅰ水平促使不成熟的皮膚成纖維細胞向成熟的具有功能的皮膚成纖維細胞分化。然而GGsTOP通過何種具體機制發(fā)揮功能仍需進一步研究。

總之，我們首次證實了GGT在小鼠皮膚成纖維細胞中表達。GGT的新型抑制劑GGsTOP沒有抑制小鼠成纖維細胞生長，并且與COL-Ⅰ的表達相關(guān)；并且也同樣證實了GGsTOP促進牙周膜細胞COL-Ⅰ的表達可能與內(nèi)源性ROS的改變有關(guān)，加入抗氧化劑NAC抑制COL-Ⅰ的合成。因此，以上結(jié)果為GGsTOP作為一種輔助皮膚組織愈合的藥物提供了可能。

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基金項目：寧波市自然科學(xué)基金資助項目 （編號：202003N4187）

作者簡介：姜瑛（1986.11-），女，滿族，遼寧，博士，主治醫(yī)師；研究方向：口腔醫(yī)學(xué)。

*通信作者：常懷廣，博士，副主任醫(yī)師；研究方向：口腔醫(yī)學(xué)。