婦科千金膠囊與婦科千金片指紋圖譜的建立及其比較分析

粟倩 唐潔 張鵬 廖穎妍 謝菁琛 龔云 林麗美

〔摘要〕 目的 建立婦科千金膠囊與婦科千金片的指紋圖譜，為兩者鑒別與質(zhì)量評價提供實驗依據(jù)。方法 采用高效液相色譜法對40批婦科千金膠囊與40批婦科千金片進行測定，結(jié)合聚類分析、模式識別分析、相似度評價等對其進行比較。結(jié)果 首次建立了婦科千金膠囊與婦科千金片的指紋圖譜，共確定了23個共有峰，指認出了穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯兩個成分。聚類分析以及模式識別分析均可以明顯地將其分為兩類，并確定了穿心蓮內(nèi)酯為千金膠囊與婦科千金片的差異性成分。結(jié)論 該方法重復(fù)性好、準確率高，結(jié)合各類分析方法可以明確地區(qū)分婦科千金膠囊與婦科千金片，可用于對婦科千金膠囊與婦科千金片進行質(zhì)量控制與評價。

〔關(guān)鍵詞〕 婦科千金膠囊;婦科千金片;指紋圖譜;聚類分析;模式判別

〔中圖分類號〕R284.1? ? ? ?〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.08.010

Establishment and Comparative Analysis of Fingerprint Chromatogram of Fuke

Qianjin Capsule and Tablet

SU Qian1，2， TANG Jie1，2， ZHANG Peng2，3， LIAO Yingyan1，2， XIE Jingchen1，2， GONG Yun2，3*， LIN Limei1，2*

（1. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Key Laboratory for Quality Evaluation of Bulk Herbs of Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Zhuzhou Qianjin Pharmaceutical Co.， Ltd， Zhuzhou， Hunan 412007， China）

〔Abstract〕 Objective To establish the fingerprints of Fuke Qianjin Capsule and Fuke Qianjin Tablet， so as to provide experimental evidence for their identification and quality evaluation. Methods High performance liquid chromatographic method was developed to establish the fingerprint of 40 batches Fuke Qianjin Capsule and 40 batches Fuke Qianjin Tablet and the quality assessment was achieved by cluster analysis， pattern recognition analysis and similarity evaluation. Results It was the first time to establish the HPLC characteristic fingerprints of Fuke Qianjin Capsule and Fuke Qianjin Tablet. There were 23 common peaks in the fingerprints. Two components were identified as andrographolide and dehydrated andrographolide by comparing with reference standards. 80 batches of different capsules and tablets were obviously divided into two groups by cluster analysis and pattern recognition analysis and the results of classification were consistent， and andrographolide were determined as the main different chemical components of Fuke Qianjin Capsule and Fuke Qianjin Tablet. Conclusion This method can distinguish the Fuke Qianjin Capsule and Fuke Qianjin Tablet combined with various analysis methods with good repeatability and high accuracy. It can be used to control and evaluate the quality of Fuke Qianjin Capsule and Fuke Qianjin Tablet.

〔Keywords〕 Fuke Qianjin Capsule; Fuke Qianjin Tablet; fingerprint; cluster analysis; mode identification

婦科千金膠囊/片是婦科常用中成藥，由千金拔、金櫻根、功勞木、穿心蓮、當(dāng)歸、單面針、雞血藤以及黨參8味中藥材組成，是最早一批收載入國家基本藥物管理的中成藥[1]。婦科千金片于1979研制成功，婦科千金膠囊在2002年獲新藥證書，婦科千金片的研制成功為后來婦科千金膠囊的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)，起到了關(guān)鍵性的作用。該方具有清熱除濕、活血解毒、益氣補血等功效，臨床常用于治療濕熱瘀滯之帶下、腹痛、慢性盆腔炎、慢性前列腺炎、子宮內(nèi)膜炎、慢性宮頸炎等[2-3]。目前，多數(shù)研究[4-6]著重于婦科千金片/膠囊藥效驗證，兩者的指紋圖譜比較鮮有學(xué)者研究。婦科千金片/膠囊雖由相同藥材組成，但兩者制備工藝迥異，二者在成分方面的異同尚未可知。因此，本文在建立兩者指紋圖譜的基礎(chǔ)上并進行比較，尋找其共同點和差異性，為二者建立既具有一致性又兼顧差異性的質(zhì)量控制標(biāo)準提供參考。

模式識別是一個綜合、交叉的科學(xué)領(lǐng)域，廣泛運用于多個學(xué)科的分析工作，在中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)分析中十分常見。模式識別通過對識別對象的原始數(shù)據(jù)進行提取，優(yōu)選出能夠反映對象某一方面的特征參數(shù)，根據(jù)相似度評價將具有相似性的數(shù)據(jù)歸為一類[7]。目前，最常用的方法是主成分分析（principal component analysis， PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination

analysis， OPLS-DA），具有準確、簡便、除繁為簡等優(yōu)點。因此，本文采用PCA與OPLS-DA結(jié)合聚類分析等計量學(xué)手段對婦科千金片/膠囊指紋圖譜數(shù)據(jù)進行對比分析，尋求差異，以期為兩者的質(zhì)量標(biāo)準及鑒別提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1? 主要儀器

Waters2695高效液相色譜系統(tǒng)（包括Empower 工作站、四元梯度泵、紫外檢測器，美國Waters公司）;QUINTIX224-1cm分析電子天平（奧多利斯科學(xué)儀器公司）;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;Microfuge20R高速離心機（德國eppendorf公司）;Direct-Q 5 UV超純水機（蘇州賽恩斯儀器公司）;Epic C18（250 mm×4.6 mm 5 μm）色譜柱（北京東方銀銳科技有限公司）;0.22 μm微孔濾膜（上海興亞凈化股份有限公司）。

1.2? 主要試劑

80批樣品均由株洲婦科千金藥業(yè)提供，具體見表1（S1～S40為婦科千金膠囊，S41～S80為婦科千金片）;穿心蓮內(nèi)酯（YJ-110797，中國食品藥品檢定研究院）;脫水穿心蓮內(nèi)酯（YJ-110854，中國食品藥品檢定研究院）;甲醇（德國Merck公司色譜純）;乙腈（美國Fisher公司色譜純）;甲酸（天津化工研究所分析純）;水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1? 色譜條件

Epic C18色譜柱（250 mm×406 mm，5 μm）;流動相0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，5% B;10～50 min，5%～30% B;50～70 min，30%～90% B;70～80 min，90% B）;柱溫30 ℃;進樣體積10 μL;流速1 mL/min。

2.2? 對照品溶液的制備

精密稱取穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為0.408、0.163 mg/mL的混合對照品儲備液。

2.3? 供試品溶液制備

精密稱定婦科千金膠囊及婦科千金片0.5 g，置50 mL具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取60 min，取出冷卻至室溫，用70%甲醇補足失重。離心取上層清液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得[2，8]。

2.4? 條件優(yōu)化

2.4.1? 最佳波長的確定? 通過對254、268、280、316、320、326、360 nm波長進行篩選，發(fā)現(xiàn)在254 nm波長下，色譜峰數(shù)量最多，峰面積較大，峰分離效果較好。具體見圖1。因此，實驗選擇在這個波長下對藥材的指紋圖譜進行分析。

2.4.2? 提取溶劑的優(yōu)化? 通過對比不同濃度甲醇（50%、60%、70%、80%、90%、100%甲醇溶液）提取對指紋圖譜的影響，結(jié)果如圖2，可以看出在不同濃度下的指紋圖譜相似度很高，并沒有較大的區(qū)別，通過對每個峰的峰型以及峰高、分離度方面考慮，其中又以甲醇濃度70%效果最好，因此，本實驗考慮提取溶劑為70%甲醇。

2.4.3? 提取時間的優(yōu)化? 不同提取時間（20、30、40、50、60 min）對藥材的指紋圖譜的影響沒有明顯的差別，在30～60 min間圖譜各個峰面積相差較小，說明超聲提取30 min時藥材中的有效成分已基本提取完全。因此，為了提高實驗效率，考慮將提取時間30 min作為后續(xù)實驗條件。見圖3。

2.5? 方法學(xué)考察

2.5.1? 精密度實驗? 取同一份樣本S1，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，結(jié)果顯示各色譜峰的峰面積與保留時間RSD<3%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性實驗? 取同一份樣本S1，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，“2.1”項條件下測定，測得各對照品共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD均<3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.3? 穩(wěn)定性實驗? 取同一份樣本S1，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，“2.1”項條件下，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣分析，計算各色譜峰峰面積與保留時間的RSD值，結(jié)果顯示RSD<3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6? 指紋圖譜建立

80批樣本按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，將80批樣本色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》進行分析，確定共有峰、計算指紋圖譜相似度以及生成對照指紋圖譜。采用SIMCA-P 13.0軟件與SPSS 22.0軟件進行聚類、主成分等分析。共確定了23個共有峰，得到婦科千金膠囊與婦科千金片疊加圖如圖4，對照指紋圖譜和混合對照品色譜圖對比如圖5，通過對照品比對得知19、22號峰分別為穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯。

2.7? 相似度評價

將80批成品（S1～S40批為婦科千金膠囊，S41～S80批為婦科千金片）數(shù)據(jù)進行分析，計算所有批次成品的相似度，結(jié)果如表2所示，除了S20樣品相似度為0.896以外，其余79批藥材指紋圖譜相似度均大于0.9。表明婦科千金膠囊與婦科千金片指紋圖譜總體上相似，其產(chǎn)生的差異部分可能與不同制備方式、藥材的不同產(chǎn)地等有關(guān)。

2.8? 聚類分析

聚類分析是對具有一定相似性的數(shù)據(jù)進行分析分類的統(tǒng)計分析技術(shù)。將一組研究對象分為不同的類，同類間的數(shù)據(jù)具有較大的相似性，不同類之間具有明顯的差異[9]。以婦科千金膠囊與婦科千金片共有峰峰面積為變量，采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行聚類分析，當(dāng)歐式距離平方和為20時，80批數(shù)據(jù)可以分為兩類，一類為婦科千金膠囊，另一類為婦科千金片，能夠有效區(qū)分兩種不同的劑型。結(jié)果見圖6。

2.9? PCA

PCA是對眾多變量數(shù)據(jù)進行處理，刪除重復(fù)的變量，優(yōu)選出盡可能少的能反映原來指標(biāo)信息的變量的一種多元統(tǒng)計分析方法。這些變量之間具有明顯差異，通過這些變量分析找到各樣本之間的相似與疏遠關(guān)系[10]。為綜合評價婦科千金膠囊與婦科千金片的差異，將80批樣品共有峰數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 13.0軟件進行PCA，結(jié)果見圖7，可以看出婦科千金膠囊（S1～S40）與婦科千金片（S41～S80）之間具有明顯的界限，能夠進一步進行兩種不同劑型的區(qū)分。

2.10? OPLS-DA

OPLS-DA是一種用于判別分析的多變量統(tǒng)計分析方法，通過分解X、Y矩陣提取主成分，建立樣本變量與分類變量之間的回歸模型，從而來判斷研究對象的分類[11-12]。為了考察兩者間的相似性與差異性，對共有峰數(shù)據(jù)進一步分析，由模型驗證的參數(shù)圖可知，R2Y=0.96，Q2Y=0.954，說明該模型區(qū)別及預(yù)測程度良好，從OPLS-DA得分圖（圖8）同樣可以看出兩者具有明顯的區(qū)分。

2.11? 差異標(biāo)記物的篩選以及鑒定

根據(jù)OPLS-DA模型的VIP值來篩選導(dǎo)致差異性的主要成分，提取模型中23個變量的VIP值，一般認為VIP>1的變量對分類起著關(guān)鍵作用。如圖9所示：14號峰、5號峰、15號峰、8號峰、1號峰、12號峰、9號峰、7號峰、13號峰、4號峰、23號峰、16號峰、10號峰、2號峰、19號峰共15個峰的VIP均大于1。說明這些成分是引起婦科千金膠囊與婦科千金片成分差異的主要標(biāo)志性成分，其中19號峰為穿心蓮內(nèi)酯。

3 討論

本實驗對檢測波長210、254、268、280、320、360 nm，提取濃度50%、60%、70%、80%、90%、100%甲醇以及超聲提取時間30、40、50、60 min進行了優(yōu)選。最終確定采用色譜柱為Epic C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.1%甲酸，檢測波長為254 nm，70%甲醇提取，超聲提取30 min，得到的HPLC特征指紋圖譜色譜峰較多，峰型美觀，基線較平穩(wěn)，分離效果較好，此方法簡單易行、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好。

本文對40批婦科千金膠囊與40批婦科千金片建立了特征指紋圖譜。經(jīng)過軟件比對確定了23個共有峰。通過標(biāo)準品指認得到其中2個峰對應(yīng)的化合物分別為穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯，同時兩者也是《中華人民共和國藥典》中婦科千金片及婦科千金膠囊的質(zhì)控指標(biāo)，而其中穿心蓮內(nèi)酯為婦科千金片和婦科千金膠囊的差異性成分。片劑與膠囊大體上相似度較高，但各個峰的峰面積差異較大，膠囊組各個峰響應(yīng)值均明顯大于片劑組。聚類分析以及模式識別分析結(jié)果均顯示兩者具有明顯的區(qū)分，推斷兩者差異可能是由于婦科千金膠囊采取醇提加水提的制備方式，而片劑采用水提加藥材粉末的制備方式，造成了膠囊組各成分含量均高于片劑組。這也說明不同劑型中成藥不僅在服用簡便程度上有區(qū)別，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)也會有所差異。

本文首次建立了婦科千金膠囊與婦科千金片的比較指紋圖譜，并結(jié)合模式識別對婦科千金膠囊與婦科千金片進行評價。與前期僅報道的婦科千金片的指紋圖譜[13]相比，本文將株洲千金藥業(yè)股份有限公司的另一市場占有劑型婦科千金膠囊也作為研究對象，在相同條件下同時建立處方一致的婦科千金膠囊與婦科千金片指紋圖譜，通過相似性評價和模式識別等比較二者的相似性和差異性，不僅為該品種的質(zhì)量控制提供參考，增加市場對于藥品的選擇依據(jù)，也為后期市場需求推出其他劑型提供理論基礎(chǔ)。

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