基于能量代謝探討參麥注射液對高血壓心衰的干預機制

程彬 胡志希 李琳 鐘森杰 邱宏

〔摘要〕 目的 研究參麥注射液對高血壓心衰大鼠能量代謝的影響，揭示藥物干預機制。方法 通過高鹽飼料喂養(yǎng)Dah1/SS鹽敏感大鼠復制高血壓心衰模型，成模大鼠隨機分為模型組和參麥注射液組[大鼠腹腔注射參麥注射液6.0 mL/（kg·d）]，另設(shè)普通飼料喂養(yǎng)的正常組。藥物干預15 d，運用心臟彩超檢測左室射血分數(shù)值（left ventricular ejection fraction， LVEF）與左室短軸縮短率值（left ventricular fractional shortening， LVFS），ELISA法檢測血清單磷酸腺苷（adenosine monophosphate， AMP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、三磷酸腺苷（adenosine diphosphate， ADP）、N端前腦鈉肽（N-terminal pro-brain natriuretic peptide， NT-proBNP）含量;透射電鏡觀察心肌細胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化;Western blot法檢測大鼠心肌組織中腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase， AMPK）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator activated receptorsα， PPARα）、PPARγ 輔激活因子1α（proliferator-activated receptor gamma costimulator 1-α， PGC-1α）的蛋白表達量。結(jié)果 與正常組相比，模型組大鼠心肌細胞線粒體排列紊亂、形態(tài)扭曲、結(jié)構(gòu)破壞，心功能障礙;血清ATP顯著降低（P<0.01）、ADP上升（P<0.05）、AMP上升顯著（P<0.01）;心肌組織的AMPK表達上升（P<0.01），PPARα、PGC-1α降低（P<0.01）。與模型組相比，參麥注射液組大鼠心肌線粒體排列相對整齊，結(jié)構(gòu)恢復，心功能改善;ATP含量上升（P<0.01）、AMP含量下降（P<0.05）;AMPK降低（P<0.01）、PPARα與PGC-1α上升（P<0.01）。結(jié)論 參麥注射液通過調(diào)控AMPK、PPARα、PGC-1α相關(guān)蛋白表達，恢復線粒體結(jié)構(gòu)和功能，促進ATP生成，改善能量代謝障礙，從而優(yōu)化心功能。

〔關(guān)鍵詞〕 慢性心力衰竭;高血壓;參麥注射液;線粒體;能量代謝

〔中圖分類號〕R256.2;R541.6+1? ? ? ? 〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.08.007

Intervention Mechanism of Shenmai Injection on Hypertensive Heart Failure

Based on Energy Metabolism

CHENG Bin， HU Zhixi*， LI Lin， ZHONG Senjie， QIU Hong

（Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To study the effect of Shenmai Injection on energy metabolism of hypertensive heart failure rats and reveal the mechanism of drug intervention. Methods The hypertensive heart failure model was established by feeding Dah1/SS salt-sensitive rats with high-salt diet. The model rats were randomly divided into model group and Shenmai Injection group [rats were intraperitoneally with Shenmai Injection 6.0 mL/（kg·d）]， and the normal group fed with ordinary diet was additionally set up. After 15 days of drug intervention， left ventricular ejection fraction （LVEF） and left ventricular fractional shortening （LVFS） were detected by cardiac color Doppler ultrasonography. Serum adenosine monophosphate （AMP）， adenosine diphosphate （ADP）， adenosine triphosphate （ATP） and N-terminal pro-brain natriuretic peptide （NT-proBNP） were detected by ELISA. The morphological and structural changes of mitochondria of myocardial cells were observed by transmission electron microscopy. The protein expression levels of adenosine monophosphate-activated protein kinase （AMPK）， peroxisome proliferator activated receptors α （PPARα） and PPARγ coactivator 1α （PGC-1α） in rat cardiac tissue were detected by Western blot. Results Compared with the normal group， the mitochondria in the model group were disordered， distorted and destroyed， and the cardiac function was impaired; serum ATP was significantly decreased （P<0.01）， ADP was increased （P<0.05）， and AMP was significantly increased （P<0.01）; the expression of AMPK in myocardial tissue was increased （P<0.01）， while PPARα and PGC-1α were decreased （P<0.01）. Compared with model group， the myocardial mitochondria of rats in Shenmai Injection group were arranged relatively neatly， the structure was restored and the cardiac function was improved; ATP content increased （P<0.01）， AMP content decreased （P<0.05）; AMPK decreased （P<0.01）， PPARα and PGC-1α increased （P<0.01）. Conclusion By regulating the expression of AMPK， PPARα and PGC-1α-related proteins， Shenmai Injection can restore the structure and function of mitochondria， promote the generation of ATP and improve the energy metabolism disorder， so as to optimize the cardiac function.

〔Keywords〕 chronic heart failure; hypertension; Shenmai Injection; mitochondria; energy metabolism

課題組前期運用高鹽飼養(yǎng)Dah1/SS鹽敏感大鼠制備高血壓心衰大鼠模型，通過“以方測證”方法，發(fā)現(xiàn)參麥注射液比參附注射液療效更優(yōu)，已確證為慢性心衰心氣陰虛證 [1-3]?；诼孕乃バ臍怅幪撟C大鼠模型，進行了血漿代謝組學研究，鐘森杰等[4]利用前期研究成果進行了Meta分析，發(fā)現(xiàn)參麥注射液能夠有效優(yōu)化心衰的心臟能量供應，認為心衰的發(fā)生可能與心臟能量代謝相關(guān)。故本研究擬從能量代謝角度出發(fā)，以心肌線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)，血清三磷酸腺苷（adenosine triphosphate， ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate， ADP）、單磷酸腺苷（adenosine mono?

phosphate， AMP）表達水平，心肌組織腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase， AMPK）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator activated receptorsα，PPARα）、PPARγ 輔激活因子1α（proliferator-activated receptor gamma costimulator 1-α，PGC-1α）蛋白表達為觀察指標，揭示參麥注射液干預高血壓心衰的作用機制。

1 材料與方法

1.1? 動物

6周齡Dahl鹽敏感雄性大鼠28只，體質(zhì)量（230±10） g，由北京維通利華實驗動物有限公司提供（合格證編號：1100111911056756），所有大鼠均飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級實驗室內(nèi)，方案由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準編號：LL20190902402）。

1.2? 藥物與試劑

大鼠N 端前腦鈉肽（N-terminal pro-brain natriu?retic peptide， NT-proBNP）酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）試劑盒為武漢華美生物工程有限公司產(chǎn)品（貨號：CSB-E08752r;產(chǎn)品批號：T06035807）;高鹽、低鹽飼料為北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供;Gluta固定液（電鏡專用，2.5%）為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品（貨號：P1126）;參麥注射液（50 mL/瓶）購于正大青春寶藥業(yè)有限公司，國藥準字：Z33020019，產(chǎn)品批號：1909288;滅菌注射用水購于國藥集團容生制藥有限公司，國藥準字：H41024923;ADP檢測試劑盒為cloud-clone crop公司產(chǎn)品（產(chǎn)品批號：CEB069Ge 96T）; AMP檢測試劑盒為cloud-clone crop公司產(chǎn)品（產(chǎn)品批號：CEA003Ge 96T）;ATP檢測試劑盒為cloud-clone crop公司產(chǎn)品（產(chǎn)品批號：CEA349Ge 96T）;AMPK Western blot試劑盒購于英國abcam公司（貨號：ab32047）;PPARα Western blot試劑盒購于英國abcam公司（貨號：ab24509）;PGC-1α Western blot試劑盒購于英國abcam公司（貨號：ab54481）。

1.3? 主要儀器

全自動樣品研磨機（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司，型號：JXFSTPRP-24/32型）;小型臺式冷凍離心機（湖南湘儀儀器有限公司，型號：H1650R型）;彩色多普勒超聲診斷儀（深圳開立科技有限公司，型號：SonoScape-S2N型）;實驗小動物無創(chuàng)血壓計（美國Kent Scientific公司，型號：CODA型）;透射電子顯微鏡（日本電子株式會社，型號：JEM1400）;精密PH計（上海雷磁儀器廠，型號：E-201-C）;切片機（德國Leica Biosystems公司，型號：Leica UC-7）;數(shù)碼相機（德國EMSIS GMBH公司，型號：morada G3型）。

1.4? 模型制備

通過高鹽飼養(yǎng)Dah1/SS鹽敏感雄性大鼠的方式，復制高血壓心衰大鼠模型[1]。將28只6周齡Dah1/SS鹽敏感雄性大鼠，按照隨機數(shù)字表法分為正常組（8只）和造模組（20只），先適應性喂養(yǎng)至7周齡。隨后造模組予高鹽飼料（8%氯化鈉濃度）喂養(yǎng)，正常組繼續(xù)正常飼料喂養(yǎng)，共計20周。觀察一般行為及體征，每4周測量血壓1次，飼養(yǎng)20周運用SonoScape-S2N型彩色多普勒超聲診斷儀進行心臟彩超檢測，綜合衡量大鼠左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction， LVEF）與左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening， LVFS）。眼眶取血檢測血清NT-proBNP，綜合衡量，判斷成模。

1.5? 分組與給藥

造模組大鼠死亡3只。將造模成功的17只Dah1/SS鹽敏感雄性大鼠按照隨機數(shù)字表法分為模型組（9只），參麥注射液組（8只）。利用人與動物等效劑量換算（人體質(zhì)量按照60 kg），參麥注射液組大鼠每天腹腔注射6.0 mL/kg藥物，正常組與模型組大鼠每天腹腔注射6.0 mL/kg注射滅菌用水，給藥共計15 d。

1.6? ELISA法檢測ATP、ADP、AMP含量

用藥干預15 d之后，通過腹主動脈取血，離心取得血清，進行ELISA檢測ATP、ADP、AMP含量，具體操作按照試劑盒說明進行。

1.7? 透射電鏡檢測心肌線粒體

研究[5]證明高血壓心衰導致心臟左室肥厚及左室結(jié)構(gòu)異常，故取大鼠左心室部分，將其泡入電鏡固定液中，電鏡檢測步驟如下：（1）固定。取大約1 mm3組織若干塊，先后用2.5%戊二醛、PBS緩沖液以及1%鋨酸固定樣本。（2）脫水。用30%、50%乙醇脫水各10 min;然后用70%乙醇醋酸鈾（包埋前染色）3 h;80%、95%乙醇分別脫水10、15 min;用100%乙醇兩次各50 min;最后用環(huán)氧丙烷置換乙醇30 min。（3）浸透。先用環(huán)氧丙烷與環(huán)氧樹脂1∶1浸泡1～2 h，再用純環(huán)氧樹脂浸泡2～3 h。（4）包埋。純環(huán)氧樹脂包埋后入40 ℃烤箱烘烤12 h，再入60 ℃烤箱烘烤48 h。（5）切片。取出包埋塊后切片成超薄，用銅網(wǎng)撈片。（6）染色。先進行包埋，再用檸檬酸鉛進行染色處理。（7）拍照。先在透射電鏡下觀察，再用數(shù)碼相機記錄圖像。

1.8? Western blot法檢測AMPK、PPARα、PGC-1α蛋白表達量

用藥干預15 d之后，通過取材獲得大鼠左心室部分心肌組織，采用Western blot法檢測AMPK、PPARα、PGC-1α蛋白表達量，具體步驟如下：取約0.02 g心肌組織置于EP管中，加入300 μL RIPA裂解液于生物樣品均質(zhì)儀中反復研磨，直至肉眼不可見組織塊，將研磨好的液體轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管中，并置冰上充分裂解10 min。置于4 ℃低溫高速離心機離心，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，離心15 min。最后將離心后的蛋白上清轉(zhuǎn)移至另一支干凈的1.5 mL離心管中，并測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳法進行蛋白質(zhì)分離后經(jīng)轉(zhuǎn)膜，用1×PBST配制的5%脫脂奶粉封閉，滴加一抗工作液4 ℃孵育過夜，各指標的一抗稀釋比例分別為AMPK（1∶3 000），PPARα（4 μg/mL），PGC-1α（1：1 000）。一抗孵育結(jié)束后，用1×PBST洗3次，每次15 min。用1×PBST稀釋HRP標記的二抗，將稀釋后的二抗與膜共同室溫孵育60 min，孵育結(jié)束后，用1×PBST洗3次，每次10 min。最后使用ECL化學發(fā)光液與膜孵育1 min，用濾紙吸盡液體，塑封膜將膜包裹雜交膜，在暗盒內(nèi)與X膠片曝光1～120 min;顯影沖洗，將曝光后的底片掃描，并用Quantity-One專業(yè)灰度分析軟件進行分析。

1.9? 統(tǒng)計學分析

本研究采用SPSS 22.0軟件分析。計量資料若滿足正態(tài)性和方差齊性，采用“x±s”表示，兩組間采用成組t檢驗，不滿足方差齊性，則采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1? 高血壓心衰大鼠模型制備與驗證

與正常組相比，造模組大鼠精神亢奮，性格暴躁，出現(xiàn)不同程度的毛色晦暗無光澤、掉毛嚴重、精神萎靡、喜蜷臥、懶動、步態(tài)搖擺等現(xiàn)象。血壓值檢測發(fā)現(xiàn)，造模組大鼠血壓明顯高于正常組，基本穩(wěn)定在200 mm Hg以上，高血壓模型成功建立。造模20周后，與正常組相比，造模組血清NT-proBNP含量顯著升高（P<0.01）;LVEF與LVFS明顯降低（P<0.01）。見表1。

2.2? 參麥注射液對高血壓心衰大鼠心功能主要參數(shù)的影響

用藥15 d，與正常組相比，模型組LVEF值與LVFS值降低明顯（P<0.01），NT-proBNP明顯上升（P<0.01）;與模型組相比，參麥注射液組LVEF值和LVFS值均明顯上升（P<0.01），NT-proBNP顯著下降（P<0.01）。見表2。

2.3? 參麥注射液對高血壓心衰大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)影響

給藥后透射電鏡觀察各組大鼠心肌線粒體的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常組大鼠心肌線粒體數(shù)量較多，排列緊密，內(nèi)外膜完整，內(nèi)部嵴結(jié)構(gòu)清晰;模型組大鼠心肌線粒體排列紊亂，呈腫脹、扭曲狀，線粒體內(nèi)膜或外膜破裂，線粒體嵴模糊不清，部分線粒體出現(xiàn)了內(nèi)部組織缺失的空泡化現(xiàn)象;參麥注射液組大鼠心肌線粒體排列整齊，內(nèi)外膜相對完整，嵴結(jié)構(gòu)更加清晰完整，空泡化程度降低。見圖1。

2.4? 參麥注射液對高血壓心衰大鼠ATP、ADP、AMP含量的影響

與正常組相比，模型組大鼠ATP含量顯著降低（P<0.01），ADP和AMP含量上升（P<0.05）;與模型組大鼠相比，參麥注射液組大鼠ATP含量上升（P<0.05），AMP含量降低（P<0.05），ADP含量比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

2.5? 參麥注射液對高血壓心衰大鼠AMPK、PPARα、PGC-1α蛋白表達量影響

與正常組相比，模型組AMPK明顯上升，PPARα、PGC-1α明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組相比，參麥注射液組AMPK明顯降低，PPARα、PGC-1α明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表4、圖2。

3 討論

慢性心衰是各類心血管疾病的最終階段，是由于心臟結(jié)構(gòu)或功能異常導致心室充盈或射血能力受損的一組復雜臨床綜合征[6-7]。慢性心衰作為21世紀主要重大疾病之一，也是現(xiàn)代醫(yī)學研究的重點與難點。高血壓患者由于心肌細胞肥大、心肌纖維化以及周圍血管硬化等多種因素，導致心臟代償功能失調(diào)，出現(xiàn)左室肥厚，引起心臟能量代謝的變化，心臟供能不足，最終導致心衰[8]。本實驗是基于能量代謝，研究參麥注射液對高血壓誘導的射血分數(shù)保留性心衰的治療作用?，F(xiàn)代醫(yī)家一般將心衰常見證型分為心肺氣虛證、氣陰兩虛證、心腎陽虛證、氣虛血瘀證、痰飲阻肺證、陽虛水泛證、陰竭陽脫證等7類[9]。其中心氣陰兩虛證作為心衰臨床常見證型之一，前期研究成果顯著。本實驗選用的參麥注射液由元代名醫(yī)朱震亨的生脈散發(fā)展而來，主要包含紅參與麥冬兩種主要成分[10]，能夠補氣養(yǎng)陰以生津，有效改善心衰末期患者出現(xiàn)的短氣乏力、四肢倦怠、汗出口渴等癥狀，臨床推廣效果較好，特別是應用于慢性心衰心氣陰虛證患者。

實驗發(fā)現(xiàn)與正常組相比，模型組心衰大鼠心肌細胞線粒體排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則，呈腫脹、扭曲狀。經(jīng)參麥注射液治療后，心肌線粒體排列恢復，形狀相對規(guī)則，扭曲腫脹等情況改善，內(nèi)外膜相對完整，表明參麥注射液可有效恢復心肌細胞中的線粒體結(jié)構(gòu)。同時，AMPK明顯降低，PPARα、PGC-1α明顯上升（P<0.01），ATP含量上升、AMP含量下降（P<0.05），心肌細胞能量代謝逐漸恢復。上述結(jié)果反映，參麥注射液干預可有效恢復衰竭心臟的能量供應，從而改善心功能。

心臟正常的能量代謝是維持人體基本生理活動的基礎(chǔ)[11]，線粒體是細胞提供能量的主要部位，又被稱為“動力室”[12]。線粒體不僅能夠通過控制細胞內(nèi)氧化磷酸化以及線粒體酶的水平來調(diào)節(jié)能量代謝，還能夠儲存鈣離子，調(diào)節(jié)細胞凋亡[13]。心衰發(fā)生時，線粒體呼吸鏈受損使得活性氧大量產(chǎn)生，對線粒體產(chǎn)生沖擊，加重線粒體結(jié)構(gòu)的損傷。同時，活性氧還使鈣離子運轉(zhuǎn)機制異常，大量鈣離子超容量地進入到線粒體中，導致線粒體形態(tài)上出現(xiàn)了腫脹扭曲，不僅結(jié)構(gòu)受損，數(shù)量減少，功能更是被破壞[14-15]，這一點與本實驗結(jié)果一致。正常的心肌能量代謝，心肌細胞主要利用線粒體上的ATP進行直接供能，另外肌酸激酶能夠催化磷酸肌酸，使其快速將磷酸這一種物質(zhì)轉(zhuǎn)移給ADP，由此途徑生成ATP，從而促進ATP高水平的恢復，給心臟供能[16-17]。由此可見，在心臟能量產(chǎn)生以及利用的過程中，ATP等能量物質(zhì)發(fā)揮著巨大的作用。當慢性心衰發(fā)生時，心肌細胞內(nèi)的線粒體出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)被破壞，線粒體內(nèi)的ATP明顯降低，供能量顯著下降。此時體內(nèi)的ADP與AMP通過氧化磷酸化的途徑加快轉(zhuǎn)化為ATP，企圖逆轉(zhuǎn)心臟的失代償狀態(tài)，本次研究結(jié)果亦印證這一結(jié)論。

AMPK是一種可以調(diào)節(jié)線粒體能量代謝的酶類，當細胞能量不夠供應機體活動時被激活，而能量過剩時被抑制[18-20]，是調(diào)節(jié)機體能量不足的重要手段。心臟能夠適應性地利用所有各種類型的底物來滿足高能量的需求，并根據(jù)環(huán)境變化嚴格調(diào)節(jié)底物的利用，是AMPK能對心衰能量代謝起到調(diào)節(jié)作用的基礎(chǔ)[21]。當心衰發(fā)生時，受損的心肌產(chǎn)生的ATP不足以為機體提供所需的能量，此時AMP的含量以及AMP/ATP的值會上升，促使AMPK通路被激活。PPARα是AMPK下游靶分子，受AMPK的調(diào)控。心衰時，AMPK能夠激活大量的酶抑制PPARα的合成，提高心肌對葡萄糖的利用率，為衰竭的心肌細胞增加能量的供應。PPARα同時還能通過增加線粒體的脂肪酶活性，促進ATP的產(chǎn)生，提高脂肪酸的利用率，起到抑制心衰的作用[22]。AMPK調(diào)節(jié)心肌能量代謝的途徑，還包括通過調(diào)控PGC-1α實現(xiàn)。PGC-1α是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)輔激活因子，能夠調(diào)節(jié)與線粒體有關(guān)的調(diào)節(jié)因子的表達，并且抑制葡萄糖氧化，增加心肌細胞對葡萄糖攝取，增加ATP的含量以調(diào)節(jié)心衰[23]。

綜上所述，高血壓心衰病理過程中伴有線粒體結(jié)構(gòu)損傷和能量代謝障礙。參麥注射液可能是通過下調(diào)AMPK的蛋白表達，上調(diào)PPARα和PGC-1α的水平，改善能量代謝相關(guān)指標，有效恢復心肌細胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)，為衰竭心臟供給更多能量，從而改善心功能。本研究從能量代謝角度初步揭示參麥注射液對高血壓心衰的干預機制，在下一步研究中擬選取相關(guān)能量信號通路進行研究，通過研究能量相關(guān)路徑的傳導機制，從而尋找參麥注射液治療高血壓心衰的新靶點。

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