黃芩苷通過TGF-β1/ERK1/2信號通路抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖

劉潔 史紅健 熊雨 范婧瑩 蘇芮 王賢文 吳新正 江志超 何迎春

〔摘要〕 目的 探討黃芩苷（baicalin）對鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖及TGF-β1/ERK1/2信號通路的作用。方法 采用CCK8法檢測不同濃度黃芩苷（2.5、5、10、20、40、80 μmol·L-1）、順鉑（4 μg·mL-1）在24、36、48 h對CNE2細(xì)胞增殖的作用;細(xì)胞成像多功能檢測系統(tǒng)（CytationTM 5）實(shí)時(shí)監(jiān)測黃芩苷對CNE2增殖數(shù)量的變化;Western blot檢測黃芩苷對CNE2細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA、Survivin及TGF-β1/ERK1/2信號通路關(guān)鍵蛋白TGF-β1、p-ERK1/2的影響。結(jié)果 CCK8結(jié)果顯示，黃芩苷可抑制CNE2增殖（P<0.05或P<0.01），且隨著濃度升高，抑制作用增強(qiáng);CytationTM 5監(jiān)測結(jié)果顯示，黃芩苷可抑制CNE2細(xì)胞數(shù)量增多（P<0.05或P<0.01）;Western blot結(jié)果表明，黃芩苷下調(diào)了增殖相關(guān)蛋白PCNA（P<0.05）、Survivin（P<0.05）及TGF-β1/ERK1/2信號通路關(guān)鍵蛋白TGF-β1（P<0.05）、p-ERK1/2（P<0.05）的表達(dá)水平。加入TGF-β1（TGF-β1/ERK1/2信號通路激活劑）后，黃芩苷對TGF-β1、p-ERK1/2、PCNA、Survivin的抑制作用降低（P<0.05），同時(shí)降低了黃芩苷對CNE2細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)論 黃芩苷能夠抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖，并通過抑制TGF-β1/ERK1/2信號通路進(jìn)一步降低下游蛋白PCNA、Survivin的表達(dá)發(fā)揮作用。

〔關(guān)鍵詞〕 鼻咽癌;黃芩苷;細(xì)胞增殖;TGF-β1/ERK1/2信號通路

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.08.004

Baicalin Inhibits Nasopharyngeal Carcinoma Cell Proliferation Via TGF-β1/ERK1/2

Signaling Pathway

LIU Jie1， SHI Hongjian1，2，3， XIONG Yu1， FAN Jingying1，2，3， SU Rui1， WANG Xianwen2，3，4， WU Xinzheng2，3，

JIANG Zhichao2，3，5， HE Yingchun1，2，3*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Provincial Key Laboratory for the Prevention and Treatment of Ophthalmology and Otolaryngology Diseases with Traditional Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hunan Provincial Ophthalmology and Otolaryngology Diseases Prevention and Treatment with Traditional Chinese Medicine and Visual Function Protection Engineering and Technological Research Center， Changsha， Hunan 410208， China; 4. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 5. Brain Hospital of Hunan Province， Changsha， Hunan 410005， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of baicalin on proliferation and TGF-β1/ERK1/2 signaling pathway of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells. Methods CCK8 method was used to detect the effect of different concentrations （2.5， 5， 10， 20， 40， 80 μmol·L-1） of baicalin and cisplatin （4 μg·mL-1） on proliferation of CNE2 cells at 24， 36 and 48 hours. Cell imaging multifunctional detection system （CytationTM 5） was used to monitor the changes of baicalin on proliferation of CNE2 cells. Western blot was used to detect the effect of baicalin on PCNA， Survivin and the key proteins of TGF-β1/ERK1/2 signaling pathway TGF-β1， p-ERK1/2 in CNE2 cells. Results CCK8 results showed that baicalin could inhibit proliferation of CNE2 （P<0.05 or P<0.01）， and the inhibition increased with the increasing of concentration. The monitoring results of CytationTM 5 showed that baicalin could inhibit the quantity increasing of CNE2 cells （P<0.05 or P<0.01）. Western blot results showed that baicalin down regulated the protein expression levels of PCNA （P<0.05）， Survivin （P<0.05） and the key proteins of TGF-β1/ERK1/2 signaling pathway TGF-β1 （P<0.05） and p-ERK1/2 （P<0.05）. After adding transforming growth factor-β1 （TGF-β1， TGF-β1/ERK1/2 signal pathway activator）， the inhibitory effect of baicalin on TGF-β1， p-ERK1/2， PCNA and Survivin was decreased （P<0.05）， and the inhibitory effect of baicalin on CNE2 cell proliferation was also decreased. Conclusion Baicalin can inhibit the proliferation of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells， and further reduce the expression of downstream proteins PCNA and Survivin by inhibiting TGF-β1/ERK1/2 signaling pathway.

〔Keywords〕 nasopharyngeal carcinoma; baicalin; cell proliferation; TGF-β1/ERK1/2 signaling pathway

鼻咽癌發(fā)病地域特點(diǎn)明顯，主要在我國南部高發(fā)，由于其發(fā)病部位特殊、放化療敏感度較高，目前臨床依然采用放療為主的聯(lián)合治療[1]。近年來，隨著中醫(yī)藥的深入研究和挖掘，中醫(yī)藥及其活性成分抗腫瘤研究亦取得了較大突破，許多抗腫瘤單體的藥效及作用機(jī)制有了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為闡明中醫(yī)藥抗腫瘤機(jī)制提供了充分的理論依據(jù)[2]。

黃芩苷（baicalin）是中藥黃芩、半枝蓮等的主要活性成分之一，研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷具有廣泛的抗癌活性[3-4]，在鼻咽癌的研究中，WANG C等[5]研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可抑制自噬、逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細(xì)胞放療抵抗性，李靜等[6]證實(shí)，黃芩苷能夠抑制鼻咽癌荷瘤鼠腫瘤發(fā)生發(fā)展，但黃芩苷抑制鼻咽癌增殖的作用機(jī)制尚不明確。TGF-β1在大部分腫瘤中表達(dá)上調(diào)，是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的主要調(diào)控因子之一[7]，且劉婷等[8]的研究證實(shí)，TGF-β1能夠調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞株的增殖和遷移等行為。因此，探討黃芩苷對鼻咽癌細(xì)胞的作用和對TGF-β1信號通路的影響及兩者的相關(guān)性，可進(jìn)一步明確黃芩苷抗鼻咽癌的效應(yīng)及機(jī)制，為開發(fā)抗鼻咽癌的中藥單體豐富理論基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)擬研究黃芩苷對鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖的影響，并檢測其對增殖相關(guān)蛋白PCNA、Survivin及TGF-β1/ERK1/2的調(diào)控作用，以期為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1? 細(xì)胞株

人鼻咽癌CNE2細(xì)胞（批號：BNCC341794）購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

1.2? 主要藥物

黃芩苷（批號：P20A9F59353，純度≥98%）購于上海源葉生物科技有限公司;順鉑（Cisplatin，Cis）（批號：MKCM2435）購于美國Sigma公司;TGF-β1（批號：1218209）購于美國Pepro Tech公司;LY3200882（批號：C24H29N5O3）購于美國Target Mol公司。

1.3? 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基（批號：AE24464298）購自Hyclone公司;胎牛血清（批號：42A0378K）購自Gibco公司;胰蛋白酶消化液（批號：20201113）購自北京索萊寶公司;PCNA 抗體（批號：AH08154078）購自Bioss公司;Survivin 抗體（批號：15）、p-ERK1/2抗體（批號：24）、β-actin 抗體（批號：18）均購自CST公司;TGF-β1 抗體（批號：GR3252552-1）購自Abcam公司。

1.4? 主要儀器

雙人單面凈化工作臺（型號：SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司）;CO2培養(yǎng)箱（型號：HERAcell 150i，賽默飛世爾公司）;全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（型號：ELX800，BioTek公司）;細(xì)胞成像多功能檢測系統(tǒng)（型號：CytationTM 5，BioTek公司）;雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（型號：Odyssey-CLX，Gene有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? CCK8法檢測細(xì)胞增殖

常規(guī)消化細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞懸液至5 000個(gè)/100 μL，于96孔板中加入100 μL細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后棄上清液，加入含不同濃度黃芩苷（2.5、5、10、20、40、80 μmol·L-1）、Cis（4 μg·mL-1）的培養(yǎng)液。分別于24、36、48 h后棄上清，加入100 μL CCK8溶液，孵育1.5 h后于450 nm波長測吸光度，并計(jì)算細(xì)胞相對增殖指數(shù)。

細(xì)胞相對增殖指數(shù)=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）

2.2? CytationTM 5監(jiān)測細(xì)胞增殖

常規(guī)消化細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞懸液至5 000個(gè)/100 μL，于96孔板中加入100 μL細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后棄上清液，加入含不同濃度黃芩苷（5、10、20、40 μmol·L-1）、Cis（4 μg·mL-1）的培養(yǎng)液。將96孔板置于CytationTM 5細(xì)胞成像多功能檢測系統(tǒng)儀器內(nèi)，設(shè)置6 h拍照1次，總時(shí)長48 h。待監(jiān)測結(jié)束后，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，并計(jì)算細(xì)胞的相對增殖指數(shù)。

2.3? Western blot法檢測蛋白表達(dá)水平

根據(jù)CytationTM 5監(jiān)測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)黃芩苷20、 40 μmol·L-1的濃度抑制增殖效果較好，因此，設(shè)置對照組、黃芩苷20 μmol·L-1組、黃芩苷40 μmol·L-1組、Cis 4 μg·mL-1組干預(yù)細(xì)胞后進(jìn)行蛋白測定。后續(xù)機(jī)制部分研究以TGF-β1作為TGF-β1/ERK1/2信號通路激活劑，LY3200882作為信號通路抑制劑，具體分組如下：對照組、TGF-β1 10 ng·mL-1組、TGF-β1+黃芩苷組、黃芩苷40 μmol·L-1組、LY3200882 10 μmol·L-1組。

藥物處理CNE2細(xì)胞36 h后，提取總蛋白，按BCA試劑盒方法定量后，按照60 μg上樣量配置樣品體系。配備10% SDS-PAGE分離膠，待分離膠凝固后加入5%濃縮膠，將樣品加入相應(yīng)的泳道，先按40 V恒壓電泳，待樣品濃縮好后，逐步增加至90 V或120 V。電泳結(jié)束后按照轉(zhuǎn)膜夾黑色面→海綿→4層濾紙→膠→PVDF膜→4層濾紙→海綿→轉(zhuǎn)膜夾紅色面的順序放置好后，在轉(zhuǎn)膜槽倒入轉(zhuǎn)膜液，按照200 mA、2.5 h的條件在冰上濕轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜放入5%的脫脂奶粉室溫下封閉1 h，然后加入稀釋好的一抗溶液，放入4 ℃冰箱孵育過夜。第2天先用TBST洗膜3遍，每次10 min，然后加入相應(yīng)的熒光二抗室溫避光孵育1.5 h。結(jié)束后洗膜3次，每次10 min，最后用雙色紅外熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃膜，并用Image Studio軟件分析熒光強(qiáng)度。

2.4? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用“x±s”表示，服從正態(tài)分布且各組間方差齊時(shí)，采用單因素方差分析，LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)，用Games-Howell（A）檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 不同濃度黃芩苷抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖

與對照組比較，24 h各濃度黃芩苷組，36 h和48 h的黃芩苷20、40、80 μmol·L-1組和Cis 4 μg·mL-1組CNE2細(xì)胞增殖指數(shù)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與黃芩苷2.5 μmol·L-1組比較，不同時(shí)間點(diǎn)黃芩苷（20、40、80 μmol·L-1）組細(xì)胞增殖指數(shù)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。采用CytationTM 5進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測進(jìn)一步驗(yàn)證黃芩苷對CNE2細(xì)胞增殖的抑制作用，細(xì)胞在培養(yǎng)48 h后，黃芩苷各濃度組與對照組比較，CNE2細(xì)胞增殖明顯被抑制。見表1和圖1。

3.2? 黃芩苷抑制鼻咽癌細(xì)胞PCNA、Survivin蛋白表達(dá)水平

與對照組相比，黃芩苷40 μmol·L-1組PCNA和Survivin表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;黃芩苷 20 μmol·L-1組PCNA和Survivin表達(dá)水平下降不明顯（P>0.05）。黃芩苷 20 μmol·L-1組和黃芩苷40 μmol·L-1組相比，PCNA 和Survivin表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖2。

3.3? 黃芩苷抑制鼻咽癌細(xì)胞TGF-β1/ERK1/2信號通路

與對照組比較，黃芩苷 40 μmol·L-1組TGF-β1和p-ERK1/2的表達(dá)水平降低（P<0.05或P<0.01）;但黃芩苷20 μmol·L-1組表達(dá)水平降低不明顯（P>0.05）。與黃芩苷20 μmol·L-1組相比，黃芩苷40 μmol·L-1組TGF-β1和p-ERK1/2表達(dá)水平降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。

3.4? 黃芩苷通過TGF-β1/ERK信號通路抑制CNE2細(xì)胞增殖

與對照組相比，TGF-β1 10 ng·mL-1組TGF-β1、p-ERK1/2、PCNA和Survivin的表達(dá)水平上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;TGF-β1+黃芩苷組TGF-β1和p-ERK1/2表達(dá)水平均下調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;PCNA和Survivin的表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;黃芩苷40 μmol·L-1組和LY3200882組p-ERK、PCNA、Survivin的表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05或P<0.01），黃芩苷組TGF-β1下調(diào)（P<0.05），但LY3200882組TGF-β1下調(diào)不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與TGF-β1+黃芩苷組比較，黃芩苷40 μmol·L-1組TGF-β1、p-ERK1/2、PCNA表達(dá)降低不明顯（P>0.05），Survivin表達(dá)水平降低且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖4A、4B）。CytationTM 5監(jiān)測細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，TGF-β1 10 ng·mL-1組細(xì)胞增殖指數(shù)明顯上升，但與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)意義（P>0.05）。與TGF-β1+黃芩苷組相比，黃芩苷40 μmol·L-1組細(xì)胞增殖指數(shù)降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4C）。

4 討論

鼻咽癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，治療方案以放化療為主，輔以手術(shù)治療，但作用有限且黏膜糜爛、口干、神經(jīng)損傷等不良反應(yīng)明顯[9]。而我國傳統(tǒng)醫(yī)藥在鼻咽癌臨床應(yīng)用中療效顯著，能夠改善鼻咽癌患者的癥狀，提高生活質(zhì)量[10]。研究[11-12]表明，黃芩苷具有抗腫瘤作用，能夠抑制肺腺癌A549細(xì)胞上皮間質(zhì)化、抑制T細(xì)胞淋巴瘤增殖并誘導(dǎo)凋亡。

本研究首先通過CCK8檢測了黃芩苷對鼻咽癌細(xì)胞增殖活性的影響，結(jié)果表明，不同濃度黃芩苷均可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，且隨著濃度升高，抑制作用更加明顯。同樣，CytationTM 5實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，黃芩苷可抑制CNE2細(xì)胞數(shù)量的增長，進(jìn)一步表明黃芩苷可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖。PCNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，課題組前期研究表明，PCNA在鼻咽癌細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)[13-14]。Survivin是腫瘤標(biāo)志物之一，與鼻咽癌的分化增殖有關(guān)[15-16]。益氣解毒方和三萜類化合物齊墩果酸、茯苓酸、熊果酸及黃芪甲苷均可降低PCNA和Survivin表達(dá)水平，抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖[17-18]，表明藥物通過抑制PCNA和Survivin的活性可以發(fā)揮抗鼻咽癌作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩苷能夠下調(diào)鼻咽癌細(xì)胞中PCNA和Survivin的蛋白表達(dá)水平，提示黃芩苷抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖可能是通過抑制PCNA和Survivin實(shí)現(xiàn)的。

TGF-β主要參與細(xì)胞增殖、分化及免疫調(diào)節(jié)等過程，既可以在正常細(xì)胞中參與細(xì)胞正常生理過程，當(dāng)腫瘤發(fā)生時(shí)，又可以作為促腫瘤因子推動(dòng)腫瘤細(xì)胞的惡化[19]。TGF-β1是TGF-β超家族中研究得最多的，也是與腫瘤發(fā)生發(fā)展最密切的，因此，本研究通過Western blot檢測了黃芩苷對TGF-β1蛋白水平的影響，結(jié)果顯示，黃芩苷組的表達(dá)水平與對照組比較明顯下調(diào)（P<0.05），說明黃芩苷能夠抑制TGF-β1活性。TGF-β1/ERK1/2途徑屬于非Smad依賴性TGF-β信號通路中的一條，TGF-β1可以激活MAPK/ERK信號通路，其中以ERK1/2為主，引起一系列級聯(lián)反應(yīng)并產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)行為[20]。在本課題組的相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)ERK的活化可促進(jìn)PCNA、Survivin的蛋白表達(dá)水平[11，21]。而黃芩苷能夠降低p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平，說明黃芩苷對鼻咽癌細(xì)胞TGF-β1/ERK1/2信號通路具有抑制作用。在TGF-β1/ERK信號通路被激活后，黃芩苷對TGF-β1、p-ERK1/2、PCNA、Survivin的抑制作用減弱了，同時(shí)黃芩苷抑制CNE2細(xì)胞增殖的能力被降低，而LY3200882組蛋白表達(dá)水平和增殖率均降低，與黃芩苷組作用趨勢基本一致，說明黃芩苷可能作為TGF-β1的抑制藥物發(fā)揮抗鼻咽癌細(xì)胞增殖作用，提示黃芩苷抑制CNE2細(xì)胞增殖的作用可能是通過調(diào)控TGF-β1/ERK1/2信號通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了黃芩苷能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，其部分作用機(jī)制是通過抑制TGF-β1/ERK1/2信號通路，進(jìn)而降低下游蛋白PCNA、Survivin的表達(dá)。

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