巖藻黃素抗D-gal誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞衰老作用及機(jī)制研究*

朱敏敏，李云鵬，張 淼，李曉雙，成 敏，周珍瓊，劉順梅，4**

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院科研處，山東濰坊 261053；3.濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東濰坊 261053；4.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心，山東濰坊 261053)

0 引言

自噬(Autophagy)是一種自降解過(guò)程，通過(guò)清除體內(nèi)衰老和受損的細(xì)胞器以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的自我更新。適度的自噬通過(guò)消化、降解胞內(nèi)受損的DNA、功能失調(diào)的線粒體等降低氧化應(yīng)激，可延緩細(xì)胞的衰老[1,2]，但自噬過(guò)度也會(huì)加速細(xì)胞的衰老。在衰老進(jìn)程中，細(xì)胞自噬作用呈下調(diào)趨勢(shì)。然而，自噬可被機(jī)體內(nèi)外的多種因素誘導(dǎo)而發(fā)生，自噬能調(diào)整細(xì)胞在應(yīng)激條件下的存活能力，不同因素誘導(dǎo)的自噬作用增強(qiáng)是多種真核生物壽命延長(zhǎng)所必需的[3,4]。研究表明自噬與細(xì)胞衰老具有非常密切的關(guān)系，是極其重要的衰老相關(guān)的調(diào)節(jié)機(jī)制[5,6]。自噬與阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，自噬相關(guān)通路的缺陷可能會(huì)導(dǎo)致上述疾病的發(fā)生[7,8]。由此看來(lái)，能調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞自噬的物質(zhì)可能會(huì)對(duì)神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防具有重要意義，對(duì)這類物質(zhì)的研究有可能為神經(jīng)退行性疾病的防治提供新思路和新藥物。

巖藻黃素(Fucoxanthin，F(xiàn)UCO)是廣泛存在于褐藻和硅藻中的類胡蘿卜素，具有抗癌[9,10]、抗氧化[11,12]、降血糖[13,14]等多種生物活性。Lashmanova等[15]和 Moskalev等[16]用果蠅和線蟲研究發(fā)現(xiàn)FUCO具有延緩衰老的作用，本課題組也發(fā)現(xiàn)FUCO可抑制H2O2引起的人WI-38細(xì)胞早衰[17]，Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)FUCO能通過(guò)調(diào)控自噬途徑減輕外傷對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用。

鑒于神經(jīng)自噬與個(gè)體衰老、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生都具有非常密切的關(guān)系，本研究利用D-gal誘導(dǎo)建立神經(jīng)細(xì)胞衰老模型，研究FUCO抗神經(jīng)細(xì)胞衰老的作用，并探討自噬是否參與其抗衰老作用過(guò)程，以期為FUCO的藥用活性研究提供理論基礎(chǔ)，為我國(guó)豐富的海藻資源的高值化利用及衰老相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防治療提供理論指導(dǎo)與參考。

1 材料與方法

1.1 材料

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific，150i)；酶標(biāo)儀(Thermo Scientific，Multiskan Go)；透射電子顯微鏡(日立，HT-7700)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(ProteinSimple，F(xiàn)luorChem Q)。

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y細(xì)胞，上海酶研生物科技有限公司)；FUCO(Sigma，純度為≥95%)；D-半乳糖(D-Galactal，D-gal，索萊寶生物科技有限公司，純度為99.0%)；噻唑藍(lán)(MTT)、丙二醛(MDA)及SA-β-半乳糖苷酶染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；雷帕霉素(Med Chem Express)；β-actin小鼠單克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；mTOR、LC3及ATG5兔單克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(Cell Signaling Technology)。

FUCO的配制：將50 mg FUCO用10 mL二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)溶解，渦旋振蕩促進(jìn)FUCO充分溶解，F(xiàn)UCO終濃度為7 588 μmol/L，分裝后置于冰箱-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

D-gal的配制：稱取適宜質(zhì)量的D-gal，用DMEM高糖培養(yǎng)基溶解，配成濃度為300 mg/mL的母液，在超凈工作臺(tái)用0.22 μm一次性無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾，分裝后置于冰箱-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 D-gal對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

實(shí)驗(yàn)分組：設(shè)空白對(duì)照組(僅用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng))和不同濃度D-gal組(DMEM培養(yǎng)基中分別含5，10，20，30，40，50 mg/mL D-gal)，每組6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，空白對(duì)照組吸棄孔內(nèi)原有培養(yǎng)基，加入新的DMEM培養(yǎng)基，其余各組吸棄孔內(nèi)原有培養(yǎng)基，加入含不同濃度D-gal的DMEM培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。12 h后按照MTT試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組的細(xì)胞活力。

1.2.2 D-gal對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞SA-β-半乳糖苷酶活性的影響

根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，5 mg/mL的D-gal處理組細(xì)胞活力與空白對(duì)照組相差很小，故本實(shí)驗(yàn)中D-gal最低濃度選擇10 mg/mL。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組(僅用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng))和不同濃度D-gal組(培養(yǎng)基中含10，20，30，40，50 mg/mL D-gal)，每組3個(gè)復(fù)孔。

將細(xì)胞接種于12孔板中，藥物處理方法同1.2.1節(jié)。依據(jù)SA-β-半乳糖苷酶染色試劑盒說(shuō)明書的方法步驟檢測(cè)各組細(xì)胞SA-β-半乳糖苷酶的活性。在光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞藍(lán)染情況，每個(gè)復(fù)孔隨機(jī)選取3個(gè)視野(每組共選取9個(gè)視野)計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及藍(lán)染陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算各組SA-β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞率(藍(lán)染陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%)。

1.2.3 FUCO對(duì)D-gal誘導(dǎo)衰老的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組(Con)、D-gal模型組(Mod，30 mg/mL D-gal)、維生素E對(duì)照組(VE，30 mg/mL D-gal +50 μmol/L VE)和3個(gè)FUCO組。FUCO組分別用F5 (30 mg/mL D-gal + 5 μmol/L FUCO)、F10 (30 mg/mL D-gal +10 μmol/L FUCO)和F20 (30 mg/mL D-gal+20 μmol/L FUCO)表示，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞懸液以5×103個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h后，空白對(duì)照組和模型組吸棄孔內(nèi)原有培養(yǎng)基，更換新的DMEM培養(yǎng)基，其余各組吸棄孔內(nèi)原有培養(yǎng)基，換為含不同濃度藥物的培養(yǎng)基。各組置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)2 h后，除空白對(duì)照組外，其余各組均加入D-gal溶液，使其終濃度為30 mg/mL，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活力。

1.2.4 FUCO對(duì)D-gal誘導(dǎo)衰老的SH-SY5Y細(xì)胞SA-β-半乳糖苷酶活性的影響

實(shí)驗(yàn)分組和藥物處理同1.2.3節(jié)。將細(xì)胞接種于12孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后按照SA-β-半乳糖苷酶染色試劑盒說(shuō)明書的檢測(cè)方法，檢測(cè)各組細(xì)胞的SA-β-半乳糖苷酶活性。顯微鏡下每個(gè)復(fù)孔隨機(jī)選取3個(gè)視野計(jì)數(shù)SA-β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞率(同1.2.2節(jié))。

1.2.5 FUCO對(duì)D-gal誘導(dǎo)衰老的SH-SY5Y細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化物(MDA)含量的影響

將細(xì)胞接種于含有DMEM培養(yǎng)基的無(wú)菌培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分組和藥物處理同1.2.3節(jié)，藥物處理結(jié)束后，將各組細(xì)胞吸棄原有培養(yǎng)基，PBS清洗兩次，每皿各加入150 μL裂解液(磷酸酶抑制劑∶蛋白酶抑制劑∶RIPA裂解液=1∶1∶100，體積比)，冰上裂解20 min。裂解結(jié)束后用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集裂解液于1.5 mL離心管中，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，按照MDA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組細(xì)胞的MDA含量。MDA含量=樣品MDA含量/單位重量的蛋白含量。

1.2.6 FUCO對(duì)D-gal誘導(dǎo)衰老的SH-SY5Y細(xì)胞自噬體的影響

實(shí)驗(yàn)分組同1.2.3節(jié)，另設(shè)自噬陽(yáng)性對(duì)照雷帕霉素組(Rapamycin，RAP，DMEM培養(yǎng)基中含有20 μmol/L的RAP)和自噬陰性對(duì)照3-甲基腺嘌呤組(3-methyladenine，3-MA，DMEM培養(yǎng)基中含有5 μmol/L的3-MA)。細(xì)胞以1×107個(gè)/皿接種于無(wú)菌平皿中，24 h后，空白對(duì)照組和模型組吸棄孔內(nèi)原有培養(yǎng)基，更換新的DMEM培養(yǎng)基，其余各組吸棄孔內(nèi)原有培養(yǎng)基，換為含不同濃度藥物的培養(yǎng)基。培養(yǎng)2 h后，空白對(duì)照組吸棄原有培養(yǎng)基，更換新的DMEM培養(yǎng)基，其余各組均加入D-gal溶液至其終濃度為30 mg/mL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。12 h后收集各組細(xì)胞用3%戊二醛固定過(guò)夜，梯度酒精脫水后用環(huán)氧樹(shù)脂包被，超薄切片后固定于銅網(wǎng)中，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛分別固定15-30 min，在透射電子顯微鏡下觀察自噬體的形成情況。

1.2.7 FUCO對(duì)D-gal誘導(dǎo)衰老的SH-SY5Y細(xì)胞自噬相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)分組和藥物處理同1.2.6節(jié)。經(jīng)D-gal處理12 h后，各組細(xì)胞在冰上進(jìn)行裂解，收集細(xì)胞裂解液于離心管中，4℃、12 000 r/min離心，取上清用聚氰基丙烯酸正丁酯法(BCA法)檢測(cè)蛋白濃度。每組各取20 μg總蛋白至加樣孔中進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、洗滌后，目的蛋白分別與β-actin小鼠單克隆抗體溶液、mTOR、LC3及ATG5兔單克隆抗體溶液在4℃孵育過(guò)夜;次日，洗掉一抗后，上述目的蛋白再分別用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗和山羊抗兔二抗溶液在室溫孵育2 h，然后用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影，用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 SH-SY5Y細(xì)胞衰老模型的建立

2.1.1 D-gal對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

不同濃度D-gal處理SH-SY5Y細(xì)胞12 h后各組細(xì)胞活力見(jiàn)圖1。設(shè)空白對(duì)照組細(xì)胞活力為100%，與對(duì)照組相比，5，10，20，30，40，50 mg/mL D-gal組細(xì)胞活力分別降至(94.24±9.03)%、(93.68±7.83)%、(88.10±11.07)%、(80.78±6.91)%、( 49.66±7.87)%、(37.92±4.41)%，細(xì)胞活力隨D-gal的濃度增加明顯下降。顯微鏡下觀察可見(jiàn)空白對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞邊緣清晰，而高濃度D-gal處理的細(xì)胞邊緣模糊，細(xì)胞變圓且數(shù)量減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明D-gal濃度超過(guò)30 mg/mL時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大毒性作用。

*:P<0.05 D-gal組 vs 空白對(duì)照組

2.1.2 D-gal對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞SA-β-半乳糖苷酶活性的影響

如圖2所示，與空白對(duì)照組相比，經(jīng)D-gal處理的SH-SY5Y細(xì)胞均有不同程度的藍(lán)染，10，20 mg/mL D-gal組細(xì)胞藍(lán)染程度較淺，30，40，50 mg/mL D-gal組細(xì)胞藍(lán)染程度加深，且部分細(xì)胞變圓，體積增大，細(xì)胞數(shù)量減少。不同濃度D-gal組的SA-β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞率均較空白對(duì)照組明顯增高(P<0.05)。上述結(jié)果表明D-gal可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞早衰，可用于建立細(xì)胞衰老模型。

*:P<0.05 D-gal組 vs 空白對(duì)照組

2.2 FUCO對(duì)D-gal誘導(dǎo)衰老的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

如圖3所示，設(shè)空白對(duì)照組細(xì)胞活力為100%，與空白組相比，模型組細(xì)胞活力下降明顯，為(73.56±5.98)%，且兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，VE組的細(xì)胞活力增加(P<0.05)。5,10 μmol/L FUCO處理組的細(xì)胞活力分別為(90.11±7.17)%、(84.71±6.33)%，均比模型組細(xì)胞活力明顯增高(P<0.05)，20 μmol/L FUCO組細(xì)胞活力與模型組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明FUCO可抑制D-gal引起的細(xì)胞活力下降，具有較好的抗細(xì)胞衰老作用。

#:P<0.05 Mod vs Con，*:P<0.05 藥物組 vs Con

2.3 FUCO對(duì)D-gal誘導(dǎo)衰老的SH-SY5Y細(xì)胞SA-β-半乳糖苷酶活性的影響

如圖4所示，與空白對(duì)照組相比，模型組的細(xì)胞藍(lán)染程度加深，藍(lán)染細(xì)胞陽(yáng)性率增高。與模型組相比，VE組的藍(lán)染細(xì)胞陽(yáng)性率降低(P<0.05)，且藍(lán)染程度變淺；5,10 μmol/L FUCO組藍(lán)染細(xì)胞陽(yáng)性率較模型組明顯減少(P<0.05)，且藍(lán)染程度下降；與模型組相比，20 μmol/L FUCO組藍(lán)染細(xì)胞陽(yáng)性率減少，但與模型組之間無(wú)明顯差異(P>0.05)。SA-β-半乳糖苷酶活性增加是細(xì)胞衰老的重要標(biāo)志物，也是檢測(cè)衰老的金標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明FUCO可以逆轉(zhuǎn)D-gal引發(fā)的細(xì)胞衰老，具有較強(qiáng)的抗衰老活性。

#:P<0.05 Mod vs Con，*:P<0.05 藥物組 vs Con

2.4 FUCO對(duì)D-gal誘導(dǎo)衰老的SH-SY5Y細(xì)胞MDA含量的影響

從圖5可以看出，模型組細(xì)胞的MDA含量明顯高于空白對(duì)照組，為空白組MDA含量的5倍多。VE組及5,10 μmol/L FUCO組的MDA含量明顯低于模型組(P<0.05)，20 μmol/L FUCO組的MDA含量低于模型組，但二者之間無(wú)明顯差別(P>0.05)。

#:P<0.05 Mod vs Con，*:P<0.05 藥物組 vs Con

2.5 FUCO對(duì)D-gal誘導(dǎo)衰老的SH-SY5Y細(xì)胞自噬體的影響

如圖6所示，空白對(duì)照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，線粒體數(shù)目較多，細(xì)胞偶爾出現(xiàn)自噬體(箭頭)。Mod組部分細(xì)胞出現(xiàn)體積變大、核仁變小甚至消失、線粒體腫脹等不良狀態(tài)，狀態(tài)好的細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量較少，但狀態(tài)不好的細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量自噬體。與模型組比，VE組的細(xì)胞邊界清晰，核仁清楚，自噬體數(shù)目有增多趨勢(shì)；F5組細(xì)胞狀態(tài)好，線粒體數(shù)目較多，胞質(zhì)內(nèi)自噬體數(shù)量也較模型組中狀態(tài)良好的細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量有所增多；F10和F20組自噬體明顯增多，且隨FUCO濃度增大而增多，高倍鏡下可清楚地觀察到自噬體中包含著多種細(xì)胞內(nèi)容物。自噬陽(yáng)性對(duì)照RAP組的自噬體數(shù)目最多，自噬陰性對(duì)照3-MA組細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)目比RAP組明顯減少。透射電子顯微鏡下觀察自噬體形成情況可以直觀反映細(xì)胞內(nèi)自噬作用大小，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明FUCO可以增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的自噬活性。

圖6 FUCO對(duì)D-gal誘導(dǎo)衰老的SH-SY5Y細(xì)胞自噬體的影響

2.6 巖藻黃素對(duì)D-gal誘導(dǎo)衰老的SH-SY5Y細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響

圖7所示為自噬相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果。與空白組相比，模型組ATG5蛋白表達(dá)和p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)比值均上調(diào)(P<0.05)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)比值下調(diào)(P<0.05)。與模型組相比，VE組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)比值輕度上調(diào)，p-mTOR/mTOR比值下調(diào)(P<0.05)。F5組ATG5、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和p-mTOR/mTOR比值均較模型組有所下調(diào)，F(xiàn)10、F20及自噬陽(yáng)性對(duì)照RAP組細(xì)胞的ATG5和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯較模型組上調(diào)(P<0.05)，p-mTOR/mTOR比值明顯下調(diào)(P<0.05)。自噬陰性對(duì)照3-MA組ATG5和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值較RAP組下調(diào)，p-mTOR/mTOR比值較RAP組上調(diào)。

#：P<0.05 Mod vs Con，*：P<0.05 藥物組 vs Con

3 討論

3.1 D-gal誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞建立細(xì)胞衰老模型

D-gal是建立衰老模型的常用誘導(dǎo)劑[19]。Li等[20]的研究表明濃度高于30 mg/mL的D-gal可明顯引起SH-SY5Y細(xì)胞活力下降，Shen等[21]用55 mmol/L D-gal誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞一周成功建立細(xì)胞衰老模型。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，D-gal濃度過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡，結(jié)合細(xì)胞活力和SA-β-半乳糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選用30 mg/mL的D-gal處理細(xì)胞12 h成功建立SH-SY5Y細(xì)胞衰老模型，該結(jié)果與Li等[20]實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

3.2 FUCO對(duì)D-gal誘導(dǎo)衰老的SH-SY5Y細(xì)胞的抗衰老作用

細(xì)胞衰老時(shí)會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞活力下降、SA-β-半乳糖苷酶活性增加、MDA含量升高等狀況。本研究通過(guò)檢測(cè)上述3個(gè)指標(biāo)探討FUCO對(duì)D-gal誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的干預(yù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，5，10 μmol/L的FUCO能明顯抑制D-gal引起的細(xì)胞活力下降(P<0.05)，20 μmol/L的FUCO作用不明顯(P>0.05)，且隨著FUCO濃度的增大，細(xì)胞活力表現(xiàn)出一定下降趨勢(shì)。FUCO對(duì)D-gal引發(fā)的衰老標(biāo)志物SA-β-半乳糖苷酶的活性增高也具有較好的抑制效應(yīng)，表現(xiàn)為5，10 μmol/L FUCO組比D-gal模型組的SA-β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，細(xì)胞藍(lán)染程度較淺；20 μmol/L FUCO組SA-β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞率比模型組降低，但兩組之間無(wú)明顯差異(P>0.05)。上述結(jié)果與本課題組前期研究[17]中發(fā)現(xiàn)5，10 μmol/L的FUCO可抑制H2O2誘導(dǎo)的WI-38細(xì)胞的活力下降和SA-β-半乳糖苷酶活性增高結(jié)果相似。

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)物，MDA的含量升高是細(xì)胞衰老的重要標(biāo)志之一。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組比空白組細(xì)胞的MDA含量明顯增高，而5-20 μmol/L的FUCO可明顯降低D-gal誘導(dǎo)的MDA含量增高。Zeng等[22]發(fā)現(xiàn)3 μmol/L FUCO就可明顯降低TBT誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)的MDA含量。上述結(jié)果表明FUCO可抑制外界刺激引發(fā)的細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，延緩細(xì)胞衰老的發(fā)生。

以上關(guān)于細(xì)胞活力、SA-β-半乳糖苷酶活性和MDA含量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)5，10 μmol/L FUCO的抗衰老作用效果相差很小，20 μmol/L FUCO的抗衰老效果與前二者比相差較大，3個(gè)FUCO組沒(méi)有表現(xiàn)出特別明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。Zhang等[18]在研究FUCO對(duì)外傷引起的小鼠繼發(fā)性腦損傷的干預(yù)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，灌胃給藥的50，100,200 mg/kg 3個(gè)劑量中100 mg/kg的抗損傷作用效果最好，腦室注射給藥的 0.01，0.05,0.1 mmol/L 3個(gè)劑量中0.05 mmol/L的抗損傷效果最好，該研究中兩種給藥方式都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的藥物量效關(guān)系。綜合考慮本研究及Zhang等[18]的研究結(jié)果，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的量效關(guān)系的原因可能是設(shè)置的3個(gè)FUCO 濃度不太合適，應(yīng)設(shè)置更多的濃度梯度，例如可在低于5 μmol/L及10-20 μmol/L增設(shè)適當(dāng)?shù)乃幬餄舛?，這樣有可能會(huì)檢測(cè)到較明顯的量效關(guān)系，下一步將驗(yàn)證該設(shè)想。

Lashmanova等[15]研究表明0.3-5.0 μmol/L FUCO能延長(zhǎng)黑腹果蠅和秀麗隱桿線蟲的壽命。無(wú)毛老鼠局部使用0.001%的FUCO溶液預(yù)處理可減輕UVB誘導(dǎo)的光老化過(guò)程中皺紋的形成[23]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，F(xiàn)UCO對(duì)D-gal誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞衰老具有較好的抑制作用。

3.3 FUCO對(duì)D-gal誘導(dǎo)衰老的SH-SY5Y細(xì)胞自噬的影響

自噬是細(xì)胞的一種生存策略，細(xì)胞自噬對(duì)于維持細(xì)胞和個(gè)體的健康具有重要作用。適度激活細(xì)胞自噬具有抗衰老作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平已成為抗衰老的重要策略。有研究表明FUCO可通過(guò)Nrf2自噬途徑在顱腦外傷模型中提供神經(jīng)保護(hù)作用[18]，表明FUCO可能會(huì)通過(guò)調(diào)控自噬途徑來(lái)對(duì)抗D-gal引起的神經(jīng)細(xì)胞衰老。但目前還未發(fā)現(xiàn)有FUCO介導(dǎo)自噬途徑抗衰老的研究報(bào)道。因此，本研究探討了FUCO對(duì)D-gal誘導(dǎo)衰老的SH-SY5Y細(xì)胞自噬的影響作用。

透射電子顯微鏡觀察自噬體形成的研究結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞發(fā)生自噬的水平較低，而D-gal模型組細(xì)胞自噬體數(shù)量明顯比空白組高，這與前人使用D-gal誘導(dǎo)細(xì)胞或動(dòng)物衰老研究的結(jié)果相似[24,25]，說(shuō)明D-gal可引起細(xì)胞發(fā)生自噬。與模型組相比，F(xiàn)10、F20和RAP組細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量明顯比模型組增多，Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的結(jié)果也顯示上述3個(gè)組中細(xì)胞內(nèi)的ATG5和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白比值較模型組上調(diào)，p-mTOR/mTOR蛋白比值較模型組下調(diào)，表明上述3組細(xì)胞的自噬作用比模型組增強(qiáng)。從Western blot檢測(cè)結(jié)果可以看出，隨著FUCO濃度增大，F(xiàn)5、F10和F20組的ATG5和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)比值表現(xiàn)出明顯濃度依賴性，p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)比值未表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，僅有F10和F20兩組的p-mTOR/mTOR比值隨濃度增加表達(dá)下調(diào)，該結(jié)果也與這兩組的ATG5和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值表現(xiàn)出的自噬增強(qiáng)趨勢(shì)相吻合。F5組細(xì)胞的ATG5和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值較模型組下調(diào)，意味著自噬作用減弱，這與透射電子顯微鏡結(jié)果顯示F5組細(xì)胞較模型組自噬作用增強(qiáng)不一致，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)F5組的p-mTOR/mTOR比值較模型組顯著下調(diào)(P<0.05)，這與其自噬體數(shù)目較模型組增多是吻合的。針對(duì)F5組自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)與透射電子顯微鏡觀察結(jié)果不一致的問(wèn)題，將通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

從自噬體及自噬相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，F(xiàn)UCO在5-20 μmol/L濃度范圍內(nèi)可增強(qiáng)細(xì)胞自噬，其中20 μmol/L FUCO組自噬作用最強(qiáng)。綜合分析本研究細(xì)胞活力、SA-β-半乳糖苷酶活性和MDA含量檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)20 μmol/L FUCO對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用并不明顯，5,10 μmol/L FUCO的抗細(xì)胞衰老作用明顯優(yōu)于20 μmol/L?？紤]到20 μmol/L FUCO組的自噬作用最強(qiáng)，猜想F20組很有可能是由于過(guò)度激活自噬，對(duì)細(xì)胞造成了一定的傷害。這一猜想與胡晶晶等[26]在研究大鼠心肌缺血再灌注損傷中提到的過(guò)度自噬是損傷的原因，抑制自噬過(guò)度激活可減輕損傷的觀點(diǎn)類似。綜上所述，我們認(rèn)為FUCO可通過(guò)適度激活自噬途徑抑制D-gal誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞衰老。

值得注意的是，盡管透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示模型組的自噬體數(shù)目比空白對(duì)照組多，但模型組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白比值較空白組下調(diào)，p-mTOR/mTOR蛋白比值較空白組上調(diào)，這二個(gè)比值與細(xì)胞自噬增強(qiáng)時(shí)該蛋白的變化趨勢(shì)不吻合。但是，考慮到自噬與衰老過(guò)程都是由多條信號(hào)通路共同介導(dǎo)完成，其中mTOR、SIRT1以及p53等是多條信號(hào)通路的交叉點(diǎn)[27]，是調(diào)控二者的關(guān)鍵蛋白，受眾多因素的調(diào)控，特別是mTOR分子，他是自噬調(diào)控信號(hào)通路中一個(gè)關(guān)鍵位置的激酶，多種信號(hào)分子可調(diào)節(jié)其活性，mTOR上游的MAPK/Erk1/2、PI3K-1/Akt等信號(hào)都會(huì)影響mTOR的活性，Yu等[28]也發(fā)現(xiàn)FUCO可通過(guò)激活PI3K-1/Akt并抑制Erk途徑保護(hù)H2O2引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷。p53蛋白也可影響mTOR的活性，p53在特定位置的適度過(guò)表達(dá)可抑制mTOR，激活自噬，而其過(guò)度表達(dá)反而會(huì)抑制自噬，使細(xì)胞表現(xiàn)出衰老的癥狀[27]。因此，對(duì)于模型組的p-mTOR/mTOR和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)與透射電子顯微鏡結(jié)果不一致的問(wèn)題，還需通過(guò)排除自噬調(diào)控復(fù)雜通路中其他蛋白對(duì)自噬的影響才能闡明原因。

4 結(jié)論

本研究中細(xì)胞活力、SA-β-半乳糖苷酶活性和MDA含量檢測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)UCO在5-10 μmol/L時(shí)對(duì)D-gal誘導(dǎo)衰老的神經(jīng)細(xì)胞具有明顯的抑制作用，20 μmol/L FUCO的抗衰老作用較差。對(duì)細(xì)胞自噬體形成及自噬相關(guān)蛋白的研究結(jié)果表明，F(xiàn)UCO很可能是通過(guò)適度激活細(xì)胞自噬來(lái)發(fā)揮其抗衰老作用。