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    苦蕎CCT基因家族生物信息學(xué)及表達(dá)分析*

    2021-09-22 14:28:18石桃雄趙佳利陳慶富
    廣西科學(xué) 2021年3期
    關(guān)鍵詞:基序苦蕎擬南芥

    石桃雄,趙佳利,田 桃,陳慶富,鄧 嬌

    (貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心,貴州貴陽(yáng) 550001)

    0 引言

    蕎麥?zhǔn)且环N廖科(Polygonaceae)蕎麥屬(FagopyrumMill.)的雙子葉小雜糧作物,甜蕎(FagopyrumesculentumMoench)和苦蕎(FagopyrumtataricumGaertn.)是其常見的兩個(gè)栽培種[1]??嗍w含有豐富的多酚化合物、類黃酮和不飽和脂肪酸等生物活性物質(zhì),能夠降低膽固醇、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)高血壓、抗炎和治療糖尿病等[2,3]。此外,苦蕎還含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、多種維生素和纖維素等成分,是谷類作物中唯一具有七類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作物[4]。因此,苦蕎是一種很好的藥食兩用作物,具有非常高的藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,且具有廣泛的環(huán)境適應(yīng)能力,能帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)[3,5,6]。

    花期是植物生命周期中一個(gè)十分重要的發(fā)育階段,對(duì)經(jīng)濟(jì)作物的生態(tài)適應(yīng)性、產(chǎn)量和品質(zhì)等有著非常重要的影響??嗍w花期的早晚與產(chǎn)量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系[7],因此研究蕎麥開花的調(diào)控機(jī)理對(duì)提高苦蕎產(chǎn)量至關(guān)重要。據(jù)報(bào)道,植物CCT(即CO、COL和TOC1)轉(zhuǎn)錄因子家族具有調(diào)控花期、生物鐘和響應(yīng)光周期等功能[8,9]。此外,CTT基因還通過激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與抵抗干旱、鹽、高溫、低溫等非生物性脅迫,減少這些非生物性脅迫對(duì)植物造成的危害[10,11]。因此CCT基因在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆境脅迫方面發(fā)揮著重要的作用。

    CCT基因編碼的蛋白都含有CCT結(jié)構(gòu)域,是由CO-LIKE蛋白、CONSTANS (CO)蛋白和TIMING OF CABl (TOCl)蛋白的C末端的43個(gè)保守的氨基酸殘基組成[12]。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的不同,CCT基因家族分為3個(gè)亞家族,分別為CONSTANS-like(COL)亞家族、CCTmotif (CMF)亞家族和PRR亞家族。COL亞家族所編碼蛋白均包含1-2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域,CMF亞家族所編碼蛋白僅含有1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域,而PRR亞家族所編碼蛋白均含有1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域和1個(gè)Receiver-like (REC)結(jié)構(gòu)域[13]。目前,CCT基因家族已在擬南芥[14]、水稻[8]、小麥[11]、玉米[15]和毛竹[16]等多個(gè)物種中被報(bào)道。擬南芥的CCT基因家族有40個(gè)成員,其中CO基因是最先被發(fā)現(xiàn)的,它在長(zhǎng)日照條件下能促進(jìn)開花,突變后擬南芥表現(xiàn)出晚花性狀[17];TOC1基因通過晝夜節(jié)律調(diào)控開花光周期[18];COL1基因在抵抗鹽、干旱和溫度等非生物脅迫中起到重要作用[14]。水稻中有41個(gè)CCT基因,最新研究發(fā)現(xiàn)至少有18個(gè)成員參與了水稻的開花過程,其中有4個(gè)新發(fā)現(xiàn)的成員參與抽穗期的調(diào)控;3個(gè)基因OsCCT22、OsCCT38和OsCCT41表現(xiàn)出在長(zhǎng)日照條件下抑制開花,在短日照條件下促進(jìn)開花的作用,而OsCCT03在長(zhǎng)、短日照條件下均能促進(jìn)水稻開花[8]。玉米中的CCT基因家族成員比其他物種稍多,共有57個(gè),其中有15個(gè)成員與花期顯著相關(guān)[15],而且ZmCOL3基因?qū)﹂_花、莖節(jié)數(shù)、總?cè)~片株高和穗位高均有影響,呈現(xiàn)出多功能的特點(diǎn)[19]。

    在模式植物和大宗作物中CCT基因家族調(diào)控花期的研究報(bào)道已有不少,但在蕎麥中還未見報(bào)道。本研究利用生物信息學(xué)工具對(duì)苦蕎CCT基因家族進(jìn)行全基因組范圍的鑒定,并對(duì)其理化特性、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化和表達(dá)模式等進(jìn)行分析,擬為進(jìn)一步探究苦蕎CCT基因家族功能,并利用該基因家族改良蕎麥品種奠定基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 苦蕎基因組中CCT基因的篩選及理化性質(zhì)分析

    苦蕎品種‘cv.Pinku1’ 的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)及其注釋信息均從NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)下載(http://www.mbkbase.org/Pinku1/)。從擬南芥信息資源數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR (https://www.arabidopsis.org/)下載CCT基因家族序列作為本地BLAST的參考序列(query序列)。運(yùn)用TBtools(v1.082)軟件進(jìn)行BLAST比對(duì),得到苦蕎CCT基因家族候選序列。再運(yùn)用 Conserved Domain Database (CDD)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structu- re/bwrpsb.cgi)對(duì)這些CCT基因的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析,從候選序列中篩選出含有CCT結(jié)構(gòu)域的序列,確認(rèn)為苦蕎的CCT基因家族成員。

    運(yùn)用ExPaSy提供的在線Protparam軟件(https://web.expasy.org/protparam/),分析苦蕎CCT基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì),包括氨基酸殘基的個(gè)數(shù)、相對(duì)分子量、等電點(diǎn)和親水性等。

    1.2 CCT基因染色體分布

    運(yùn)用TBtools (v1.082)軟件繪制苦蕎CCT基因在染色體上的分布圖并對(duì)其進(jìn)行共線性分析。

    1.3 CCT基因結(jié)構(gòu)、保守基序及結(jié)構(gòu)域分析

    首先運(yùn)用MEME在線工具(http://meme-suite.org/)分析苦蕎CCT蛋白的氨基酸序列的保守基序,基序個(gè)數(shù)設(shè)置為10個(gè);然后用TBtools(v1.082)軟件將預(yù)測(cè)結(jié)果xml文件進(jìn)行可視化;最后利用TBtools(v1.082)軟件分析苦蕎CCT基因結(jié)構(gòu),并利用CDD數(shù)據(jù)庫(kù)分析CCT基因保守結(jié)構(gòu)域。

    1.4 CCT基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

    利用MEGA 7.0軟件的Cluster W程序?qū)嗍w和擬南芥的CCT基因家族進(jìn)行多序列比對(duì),采用Neighbor Joining (NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

    1.5 苦蕎CCT基因的表達(dá)分析

    采用Zhang等[20]發(fā)表的苦蕎‘cv.Pinku1’的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),根據(jù)4種組織(根、莖、葉和花)中的FPKM值,利用TBtools(v1.082)軟件繪制CCT基因表達(dá)水平的熱圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 苦蕎CCT基因家族成員的鑒定及在染色體的定位

    以擬南芥40個(gè)CCT基因家族成員為參考序列,并結(jié)合CCT基因家族特有的CCT結(jié)構(gòu)域,在苦蕎基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中共鑒定出35個(gè)CCT基因家族成員。染色體定位分析表明,苦蕎35個(gè)CCT基因在8條染色體上均有分布,其中7號(hào)染色體上分布的CCT基因數(shù)目最多,有9個(gè);其次是8號(hào)染色體上,分布了8個(gè)成員(圖1)。分別有5個(gè)、4個(gè)和3個(gè)CCT基因定位在2號(hào)、1號(hào)和5號(hào)染色體上。3號(hào)、4號(hào)和6號(hào)染色體上各分布了2個(gè)CCT基因。共有8對(duì)CCT基因發(fā)生片段復(fù)制現(xiàn)象(圖1),分別為FtPinG0006138300.01.T01和FtPinG0004072200.01.T01、FtPinG0004072200.01.T01和FtPinG0009564600.01.T01、FtPinG0009564600.01.T01和FtPinG0003531700.01.T01、FtPinG0001582600.01.T01和FtPinG0004578000.01.T01、FtPinG0008789300.01.T01和FtPinG006802300.01.T01、FtPinG0008422500.01.T01和FtPinG0007624400.01.T01、FtPinG0007624400.01.T01和FtPinG0004084100.01.T01以及FtPinG0004084100.01.T01和FtPinG0008422500.01.T01。

    圖1 苦蕎FtCCT基因在染色體上的分布及片段復(fù)制

    2.2 苦蕎FtCCT系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)、保守基序及結(jié)構(gòu)域

    系統(tǒng)發(fā)育分析可將苦蕎35個(gè)CCT基因分成三大類(圖2a),共含有10個(gè)保守基序(圖2b)。第Ⅰ類包含了大部分成員,共26個(gè),又可細(xì)分為4小組:第1小組有10個(gè)CCT基因,除FtPinG0004084100.01.T01和FtPinG0007042800.01.T01只含有Motif 1,其他都含有Motif 1和Motif 8;第2小組含4個(gè)成員,除FtPinG0005510100.01.T01缺少M(fèi)otif 10,其他3個(gè)都具有4個(gè)Motif (Motif 1、Motif 5、Motif 6、Motif 10);第3小組由4個(gè)CCT基因組成,其中FtPinG0005690000.01.T01只含有Motif 1,其他3個(gè)含有Motif 1 和Motif 2;第4小組由8個(gè)成員組成,其中FtPinG0006138300.01.T01僅含有Motif 1,F(xiàn)tPinG0006374000.01.T01含有Motif 1、Motif 2,其他6個(gè)CCT基因由Motif 1、Motif 2、Motif 4和Motif 9 組成。第Ⅱ類由6個(gè)CCT基因組成,其中2個(gè)CCT基因僅含有Motif 7,2個(gè)含有Motif 1和Motif 7,還有2個(gè)含有Motif 1、Motif 2和Motif 7。第Ⅲ類只有3個(gè)CCT基因成員,都含有Motif 1、Motif 5和Motif 10 (圖2a,b)。

    35個(gè)苦蕎CCT基因中,6個(gè)CCT基因(FtPinG0004084100.01.T01、FtPinG0007042800.01.T01、FtPinG0005690000.01.T01、FtPinG0006138300.01.T01、FtPinG0009634400.01.T01和FtPinG0004756400.01.T01)只含有1個(gè)基序,其他29個(gè)CCT基因含有2-4個(gè)基序(圖2a,b)。除了兩個(gè)成員(FtPinG0009634400.01.T01和FtPinG0004756400.01.T01)不具有Motif 1,其他33個(gè)CCT基因成員都具有Motif 1,占比達(dá)到94%;12個(gè)CCT基因成員具有Motif 2的基因,比例為34%。這說明Motif 1和Motif 2可能為苦蕎CCT基因家族最保守的基序(圖2b)。在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://pfam.xfam.org/),Motif 1被注釋為CCT結(jié)構(gòu)域,Motif 2和Motif 4被注釋為B-box結(jié)構(gòu)域,Motif 3和Motif 6被注釋為和調(diào)節(jié)信號(hào)響應(yīng)相關(guān)的結(jié)構(gòu)域,Motif 5被注釋為GATA zinc finger,Motif 10被注釋為tify結(jié)構(gòu)域,Motif 7、Motif 8和Motif 9的注釋未知。

    圖2 苦蕎FtCCT基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹(a)、保守基序(b)及基因結(jié)構(gòu)(c)

    苦蕎的35個(gè)CCT基因內(nèi)含子數(shù)目為1-8,其中FtPinG0005619800.01.T01含有的內(nèi)含子數(shù)目最多,有8個(gè);其次是FtPinG0005184600.01.T01、FtPinG0007821700.01.T01和FtPinG0002597300.01.T01(均位于第Ⅰ類第2小組中),均含有7個(gè)內(nèi)含子(圖2c),9個(gè)CCT基因成員只有1個(gè)內(nèi)含子。

    苦蕎CCT基因家族所編碼蛋白中含有5種主要的保守結(jié)構(gòu)域,分別是CCT、B-box、Znf-GATA、tify和REC (圖3),其中CTT結(jié)構(gòu)域在所有苦蕎CCT基因編碼蛋白中都有出現(xiàn),說明該結(jié)構(gòu)域在植物進(jìn)化過程中高度保守??嗍wCCT基因家族中的CMF亞家族的成員最多(18個(gè)),此亞族所編碼的蛋白都含有1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域,其中還有3個(gè)含有tify結(jié)構(gòu)和Znf-GATA結(jié)構(gòu)域,并且這3個(gè)蛋白的大小相似;COL亞家族由13個(gè)CCT基因組成,所編碼蛋白中除了4個(gè)成員只含有1個(gè)B-box和1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域外,其他成員都含有2個(gè)B-box和1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域;PRR亞家族中的CCT基因數(shù)目最少,只有4個(gè),所編碼蛋白由1個(gè)CCT和1個(gè)REC結(jié)構(gòu)域組成。

    圖3 苦蕎FtCCT基因家族保守結(jié)構(gòu)域

    2.3 苦蕎FtCCT基因家族的理化性質(zhì)

    對(duì)35個(gè)FtCCT基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析表明,CCT基因家族編碼的蛋白質(zhì)含有117-753個(gè)氨基酸殘基,相對(duì)分子質(zhì)量為4 082.90-82 741.52 Da,預(yù)測(cè)的理論等電點(diǎn)為4.96-9.51,且以偏酸性和中性居多。預(yù)測(cè)的苦蕎CCT基因家族蛋白質(zhì)的親水指數(shù)均為負(fù)值,表明蛋白質(zhì)均屬于親水性蛋白,其中以FtPinG0007624400.01.T01的親水性最強(qiáng),平均親水指數(shù)為-9.180 (表1)。

    表1 苦蕎FtCCT基因家族的理化性質(zhì)

    續(xù)表1

    2.4 苦蕎FtCCT基因家族進(jìn)化分析結(jié)果

    系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)苦蕎和擬南芥CCT基因家族成員可分為三大類:Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ(圖4)。其中,Ⅰ類中的基因數(shù)目最豐富,由29個(gè)擬南芥CCT基因和22個(gè)苦蕎CCT基因組成,可以進(jìn)一步分為 ⅠA和 ⅠB兩個(gè)亞類;Ⅱ類包含8個(gè)擬南芥和10個(gè)苦蕎的CCT基因成員;Ⅲ類中擬南芥和苦蕎各3個(gè)CCT基因成員。

    根據(jù)姚新轉(zhuǎn)等[21]對(duì)擬南芥CCT基因家族的分類方法,可以將苦蕎的35個(gè)CCT基因家族分為COL、CMF和PRR 3個(gè)亞家族(圖4),與圖3的結(jié)果基本一致。其中CMF亞家族包含了分布在進(jìn)化樹上的Ⅱ類和Ⅲ類中的全部CCT成員,以及IA和IB兩個(gè)亞類中的小分支;COL亞家族主要分布在進(jìn)化樹中的IA亞類以及IB亞類中的一個(gè)分支上;PRR亞家族由IB的一個(gè)分支組成。

    圖4 苦蕎和擬南芥CCT基因家族系統(tǒng)進(jìn)化

    2.5 苦蕎CCT基因家族在組織中的表達(dá)模式

    苦蕎35個(gè)CCT基因在根、莖、葉和花4個(gè)組織中的表達(dá)模式如圖5所示,有5個(gè)CCT基因在根中表達(dá)水平高,推測(cè)可能與根的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控有關(guān);只有1個(gè)CCT基因在莖中顯著高表達(dá),推測(cè)其可能參與莖的生長(zhǎng)發(fā)育過程。在葉中表達(dá)水平較高的CCT基因的數(shù)目較多,而且大多數(shù)是CMF亞家族成員,他們可能參與葉的生長(zhǎng)發(fā)育與光形態(tài)建成。在花中表達(dá)水平較高的CCT基因的數(shù)目也較多,主要是COL和CMF亞家族成員,這些基因可能參與調(diào)控開花過程,比如開花時(shí)間、花期長(zhǎng)短等。

    圖5 苦蕎CCT基因家族在不同組織中的表達(dá)模式

    3 討論

    植物CCT基因家族在調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆境脅迫中起著至關(guān)重要的作用,并且大多數(shù)成員參與開花調(diào)控,與作物的產(chǎn)量也息息相關(guān)[8,16,22,23]。本研究在全基因組水平上共鑒定到35個(gè)苦蕎FtCCT基因,數(shù)目與其他物種相差不大,含有1-8個(gè)內(nèi)含子(圖2)。這些苦蕎CCT蛋白等電點(diǎn)為4.96-9.51,絕大多數(shù)以酸性為主,均為親水性蛋白(表1)。35個(gè)苦蕎FtCCT基因在8條染色體上均有分布,且8對(duì)FtCCT基因發(fā)生了片段復(fù)制事件(圖1)。片段重復(fù)在CCT基因家族成員的擴(kuò)增中可能起著重要的作用,推測(cè)這些同源性較高的復(fù)制基因具有相似的生物學(xué)功能??嗍wCCT蛋白與其他物種一樣含CCT、B-box、Znf-GATA、tify和REC等5種主要的保守結(jié)構(gòu)域(圖3)。所有的苦蕎CCT蛋白都含有CCT結(jié)構(gòu)域,說明該結(jié)構(gòu)域在植物進(jìn)化過程中高度保守。

    為更好地了解苦蕎FtCCT基因家族成員的分類和可能具有的功能,本研究將40個(gè)擬南芥AtCCT家族成員與35個(gè)苦蕎FtCCT家族成員進(jìn)行蛋白序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果表明,兩者的CCT基因具有較高的同源性,說明CCT基因在物種間比較保守,可能具有相似的功能。根據(jù)姚新轉(zhuǎn)等[21]對(duì)擬南芥AtCCT基因家族的分類方法,苦蕎的35個(gè)FtCCT基因家族也可以分為COL、CMF和PRR 3個(gè)亞家族,且CCT基因家族的功能可能與Motif以及結(jié)構(gòu)域相關(guān)。Putterill等[17]研究表明,擬南芥的AtCO基因(At15840.1)屬于COL亞家族,具有促進(jìn)開花的功能,苦蕎中兩個(gè)AtCO同源基因FtPinG0008999600.01.T01和FtPinG0009408600.01.T01在花組織中具有較高的表達(dá)水平(圖5),因此推測(cè)FtPinG0008999600.01.T01和FtPinG0009408600.01.T01可能具有相似的功能,并且苦蕎的COL亞家族的12個(gè)成員中有7個(gè)在花組織中高表達(dá)(圖5),這與擬南芥的COL亞家族中的大部分成員參與擬南芥開花時(shí)間的調(diào)控一樣[18]。屬于擬南芥PRR亞家族的TOC1被報(bào)道影響晝夜節(jié)律[24],苦蕎中的同源基因FtPinG0005510100.01.T01可能也參與生物鐘的調(diào)控。PRR亞家族的4個(gè)成員中有2個(gè)在花中高表達(dá),在根和葉中各有1個(gè)表達(dá)水平較高(圖5),因此,不同的成員可能對(duì)不同組織的生長(zhǎng)發(fā)育起著調(diào)控作用。CMF亞家族對(duì)谷類作物的馴化和適應(yīng)起著重要作用,且對(duì)開花起著抑制作用[25,26],而苦蕎中的CMF亞家族的成員最豐富,其中有8個(gè)成員在葉中高表達(dá),有6個(gè)在花中高表達(dá),還有少數(shù)成員在根和莖中具有較高的表達(dá)水平,這些基因可能調(diào)控不同組織的生長(zhǎng)發(fā)育。因此,苦蕎CCT基因家族中的有些成員可能與擬南芥的同源基因具有相似的功能,而特異的Motif和結(jié)構(gòu)域可能是不同亞家族成員之間功能差異的主要原因。

    4 結(jié)論

    植物CCT基因家族在調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、花期和抗逆境脅迫中起著至關(guān)重要的作用。本研究在全基因組水平上共鑒定出35個(gè)苦蕎CCT基因,在8條染色體上均有分布??嗍wCCT基因編碼的蛋白的等電點(diǎn)為4.96-9.51,絕大多數(shù)以酸性為主,均為親水性蛋白。基于CCT、B-box、Znf-GATA、tify和REC等5種主要的保守結(jié)構(gòu)域,將苦蕎的CCT基因家族劃分為CMF、COL和PRR 3個(gè)亞家族??嗍w和擬南芥CCT基因具有較高的同源性。在葉和花中高表達(dá)的CCT基因數(shù)目較多,推測(cè)這些基因可能參與了生長(zhǎng)發(fā)育、光形態(tài)建成或開花調(diào)控過程。以上研究結(jié)果為進(jìn)一步探究苦蕎CCT基因家族功能,以及利用該基因家族改良蕎麥花期奠定了基礎(chǔ)。

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