內(nèi)生真菌對高寒草地紫花針茅凋落物分解的影響

宋梅玲，王玉琴，王宏生，鮑根生

（省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海省高寒草地適應(yīng)性管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810016）

凋落物分解是陸地生態(tài)系統(tǒng)中碳素周轉(zhuǎn)和礦質(zhì)養(yǎng)分循環(huán)的重要過程［1］，并且具有調(diào)節(jié)土壤有機(jī)物組成的作用［2］，是釋放礦質(zhì)養(yǎng)分供植物生長的重要過程，并由此影響陸地生態(tài)系統(tǒng)凈生產(chǎn)力［3］。凋落物分解率可以被生物和非生物因素所影響，決定分解率的因素主要有3個(gè)，分別為氣候因素（如溫度和水分）、凋落物質(zhì)量（如化學(xué)成分）以及分解生物的特性和數(shù)量（如細(xì)菌、真菌和土壤無脊椎動物）［4］。最初的凋落物質(zhì)量（如：C/N、纖維素、木質(zhì)素）可以影響參與凋落物分解的微生物的多度、組成和活性，而這些也反過來決定凋落物的分解速率和養(yǎng)分循環(huán)［5］。

近年來，各國學(xué)者對于內(nèi)生真菌與其宿主植物（禾草）和食草動物之間的相互關(guān)系及其在不同生態(tài)環(huán)境中的多樣性已開展了大量的研究［6－9］。內(nèi)生真菌與禾草在生態(tài)系統(tǒng)中維持著一種互利共生的關(guān)系，對于內(nèi)生真菌來說，宿主禾草保證了其在植物體內(nèi)生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)和可靠有效的傳播，而對于禾草來說，內(nèi)生真菌通過其自身產(chǎn)生的次生代謝物保護(hù)了植物，使其免受外界環(huán)境脅迫的危害［10－11］。這種共生關(guān)系已經(jīng)被證明可以影響生態(tài)系統(tǒng)過程，如土壤呼吸、凋落物分解等［12－13］。內(nèi)生真菌通過改變微生物量及微生物群落結(jié)構(gòu)，或宿主植物凋落物的數(shù)量和質(zhì)量［14－15］影響凋落物分解速率。

紫花針茅（Stipa purpurea）草原是青藏高原地區(qū)高寒草地中分布面積較廣、最具有代表性的草地類型。其建群種紫花針茅系寒旱生植物，粗蛋白含量高，粗纖維少，營養(yǎng)價(jià)值比較高［16］，且具有耐寒、耐旱、耐踐踏和抗風(fēng)沙等特性［17－18］。主要分布在海拔1900～5150 m的高原地帶，是青藏高原、帕米爾高原和中亞高山地帶的特有植物［19］。紫花針茅內(nèi)生真菌主要為無性繁殖的Epichlo?屬內(nèi)生真菌，近年來，有關(guān)紫花針茅與內(nèi)生真菌之間相互關(guān)系的研究較多，如紫花針茅內(nèi)生真菌分離和鑒定，紫花針茅內(nèi)生真菌共生體對根寄生危害的響應(yīng)等［19－20］。然而，關(guān)于內(nèi)生真菌對紫花針茅凋落物分解的影響及其機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。

本研究通過對比帶內(nèi)生真菌與不帶內(nèi)生真菌紫花針茅之間的凋落物分解特征差異，明確內(nèi)生真菌對宿主植物凋落物分解過程的影響（包括凋落物重量和質(zhì)量等變化），以期揭示禾草內(nèi)生真菌對草地生態(tài)系統(tǒng)元素循環(huán)中凋落物分解的作用，為禾草內(nèi)生真菌共生體在高寒草地的利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 凋落物采集

2017年9月，于青海省海北州海晏縣（N 37°04′01″，E 100°52′48″）天然草場采集紫花針茅花序，每單株裝于一個(gè)信封袋。將采自野外的紫花針茅花序分別按照李春杰等［21－22］的方法進(jìn)行內(nèi)生真菌檢測，采集帶菌植株的種子并通過高溫高濕法進(jìn)行去除內(nèi)生真菌的處理，建立帶內(nèi)生真菌（E+）與不帶內(nèi)生真菌（E－）無性繁殖系種群。將處理好的E+、E－種子分別種植于花盆中，置于溫室，使其自然生長。待植株長到枯黃時(shí)，采集地上植株，自然風(fēng)干，作為凋落物備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2018年12月，將E+、E－紫花針茅植株凋落物分別剪成5 cm的小段，稱取5.00 g裝入1 mm孔徑的尼龍網(wǎng)袋（大小為：10 cm×10 cm），共計(jì)36個(gè)網(wǎng)袋，放置到海北州海晏縣試驗(yàn)點(diǎn)，每個(gè)網(wǎng)袋間距大于10 cm，放置前清除地上植物組織，確保網(wǎng)袋均勻平鋪在地表與土壤直接接觸，并用大頭針固定。在放置網(wǎng)袋后的第0、3、6、8、10、12個(gè)月隨機(jī)采集凋落物網(wǎng)袋，每次每個(gè)處理采集3個(gè)網(wǎng)袋，以備后續(xù)試驗(yàn)用。

1.3 分析方法

網(wǎng)袋取出后，將凋落物全部取出，放置到實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干，之后過0.25 mm篩后稱重。根據(jù)Olson［23］的指數(shù)分解模型公式，計(jì)算凋落物分解速率k值：

式中：X表示經(jīng)過t年分解時(shí)間后凋落物的殘留量；X0為凋落物初始量（5 g）。根據(jù)此公式，可模擬出凋落物殘留率隨時(shí)間變化的指數(shù)回歸方程，進(jìn)而推算出不同凋落物分解50%即半分解時(shí)間和分解95%所需的時(shí)間。

每次采集的網(wǎng)袋中的樣品都需要測定其全氮、木質(zhì)素和纖維素含量。其方法為：全N含量運(yùn)用全自動凱氏定氮儀（Kjeltec 2300 Auto SystemⅡ，F(xiàn)oss Tecator AB，瑞典）進(jìn)行測定。木質(zhì)素和纖維素的含量則依據(jù)酸性洗滌纖維法進(jìn)行測定［24］。同時(shí)，計(jì)算每個(gè)分解階段的凋落物木質(zhì)素/N以及N殘留率、木質(zhì)素殘留率和纖維素殘留率等。

元素殘留率（R）：

式中：Ct為t時(shí)刻凋落物元素含量（mg·g－1）；Xt為t時(shí)刻凋落物干重（g）；C0為初始元素含量（mg·g－1）；X0為初始干重（g）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 17.0（SPSS，Inc.，Chicago，IL）軟件進(jìn)行分析，E+與E－之間凋落物重量、全N、木質(zhì)素和纖維素含量、木質(zhì)素∶N、纖維素∶N以及全N、木質(zhì)素和纖維素的殘留率等的差異顯著性采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，內(nèi)生真菌對紫花針茅凋落物重量、全N、木質(zhì)素和纖維素含量、木質(zhì)素∶N、纖維素∶N以及全N、木質(zhì)素和纖維素的殘留率等不同時(shí)間的影響采用重復(fù)度量方差分析方法進(jìn)行檢驗(yàn)，顯著性區(qū)間定義為95%水平。

2 結(jié)果與分析

隨著時(shí)間的延長，E+與E－紫花針茅凋落物重量都大幅度下降，其中0～8個(gè)月，凋落物重量下降速度較快，而8～12個(gè)月，下降速度趨于平緩（圖1）。相對而言，E+紫花針茅的凋落物重量下降速度比E－快，且自第6個(gè)月以后，E+植株的凋落物重量顯著低于E－（P＜0.05，圖1）。時(shí)間和內(nèi)生真菌均對紫花針茅凋落物重量產(chǎn)生了顯著影響（P＜0.001），二者之間無顯著交互作用（P＞0.05，表1）。

圖1 E+和E-紫花針茅凋落物重量隨時(shí)間的變化Fig.1 The change of E+and E-S.purpurea litters weight over time

E+與E－紫花針茅凋落物分解系數(shù)分別為0.793和0.616（表2）。據(jù)此推算出，E+紫花針茅凋落物的半分解時(shí)間為0.84年，分解95%的時(shí)間為3.75年。而E－紫花針茅凋落物的半分解時(shí)間為1.14年，分解95%的時(shí)間為4.87年（表2）。因此，內(nèi)生真菌縮短了紫花針茅植株凋落物的分解時(shí)間。

表2 E+和E-紫花針茅凋落物分解特征參數(shù)Table 2 Decomposition characteristics parameters of E+and E-S.purpurea litters

E+和E－紫花針茅凋落物中全氮含量隨時(shí)間的延長有增加的趨勢，其中，第6、10和12個(gè)月，E+紫花針茅凋落物中全氮含量均顯著高于E－（P＜0.05，圖2a），內(nèi)生真菌和時(shí)間對凋落物全氮含量產(chǎn)生了顯著影響，且二者之間有顯著的交互作用（P＜0.05，表1）。另一方面，E+和E－紫花針茅凋落物中木質(zhì)素含量均隨著時(shí)間的延長迅速降低（圖2b），至第8個(gè)月時(shí)，E+和E－凋落物中木質(zhì)素含量均降至初始含量的1.5%以下，且隨著時(shí)間的延長，E+凋落物的木質(zhì)素含量由初始的顯著高于E－（P＜0.05），逐漸變?yōu)榕cE－無顯著差異（P＞0.05，圖2b）；時(shí)間對紫花針茅凋落物的木質(zhì)素含量有顯著影響（P＜0.001），內(nèi)生真菌與時(shí)間對木質(zhì)素含量無顯著的交互作用（P＞0.05，表1）。E+和E－紫花針茅凋落物中纖維素含量與木質(zhì)素含量有相同的變化趨勢，均隨著分解時(shí)間的延長而逐漸降低（圖2c），不同的是，E+凋落物中纖維素含量始終低于E－，并在第3、8、10、12個(gè)月時(shí)達(dá)到顯著水平（P＜0.05，圖2c）；內(nèi)生真菌和時(shí)間對紫花針茅凋落物纖維素含量的影響顯著，但二者之間沒有顯著的交互作用（表1）。

表1 內(nèi)生真菌在不同的時(shí)間對紫花針茅凋落物重量以及全氮、木質(zhì)素和纖維素含量的重復(fù)度量方差分析Table 1 Repeated measures ANOVA for the effects of endophyte at different times on litter weight，total N，lignin and cellulose contents of S.purpurea litters

圖2 E+和E-紫花針茅凋落物中全氮、木質(zhì)素和纖維素含量隨時(shí)間的變化Fig.2 The change of total N，lignin and cellulose contents in E+and E-S.purpurea litters over time

E+和E－紫花針茅凋落物中木質(zhì)素∶氮值均隨著時(shí)間的延長而逐漸降低（圖3a）。E+凋落物中木質(zhì)素∶氮值始終高于E－，并在分解第3和6個(gè)月時(shí)達(dá)到顯著水平（P＜0.05），在此過程中，內(nèi)生真菌對紫花針茅凋落物中木質(zhì)素∶氮值未造成顯著影響，但是時(shí)間對其比值影響顯著，二者無明顯的交互作用（表3）。另一方面，E+和E－紫花針茅凋落物中纖維素∶氮值也隨著時(shí)間的延長而降低，但是E+凋落物中纖維素∶氮值始終低于E－，并在第3、6、10、12個(gè)月時(shí)差異顯著（P＜0.05，圖3b），內(nèi)生真菌和時(shí)間對紫花針茅凋落物中纖維素∶氮值產(chǎn)生了顯著的影響，但二者之間無明顯的交互作用（表3）。

圖3 E+和E-紫花針茅凋落物中木質(zhì)素∶氮和纖維素∶氮隨時(shí)間的變化Fig.3 The change of lignin∶N and cellulose∶N ratios in E+and E-S.purpurea litters over time

E+和E－紫花針茅凋落物中氮?dú)埩袈示S著時(shí)間的延長而逐漸下降（圖4a），相對E－來說，在分解后期E+凋落物氮?dú)埩袈首兓呌谄骄徤踔劣猩叩内厔荨５降?和10個(gè)月時(shí)，E+凋落物氮?dú)埩袈曙@著低于E－（P＜0.05，圖4a）。E+和E－紫花針茅凋落物中木質(zhì)素殘留率均隨著時(shí)間的延長而逐漸下降，在此過程中，E+與E－之間差異不顯著（P＞0.05，圖4b）。纖維素與木質(zhì)素殘留率有相同的變化趨勢，即E+和E－凋落物中纖維素殘留率均隨著時(shí)間的延長而降低，至第8和10個(gè)月時(shí)，E+凋落物中纖維素殘留率顯著低于E－（P＜0.05，圖4c）?？傮w而言，內(nèi)生真菌顯著影響紫花針茅凋落物氮和纖維素殘留率，分解時(shí)間對于氮、木質(zhì)素和纖維素殘留率均產(chǎn)生了顯著影響（P＜0.05），但是內(nèi)生真菌與分解時(shí)間對于三者均未產(chǎn)生明顯的交互作用（P＞0.05，表3）。

表3 內(nèi)生真菌在不同的時(shí)間對紫花針茅凋落物木質(zhì)素∶氮和纖維素∶氮比值以及全氮、木質(zhì)素和纖維素殘留率的重復(fù)度量方差分析Table 3 Repeated measures ANOVA for the effects of endophyte at different times on lignin∶N ratio，cellulose∶N ratio，and total N，lignin and cellulose residual rates of S.purpurea litters

圖4 E+和E-紫花針茅凋落物中全氮、木質(zhì)素和纖維素殘留率隨時(shí)間的變化Fig.4 The change of total N，lignin and cellulose residual rates in E+and E-S.purpurea litters over time

3 討論

內(nèi)生真菌在植物凋落物被分解之初，通過植物組織的自然衰亡而獲得優(yōu)先于其他腐生真菌的定殖優(yōu)勢［25］，它們可能直接降解凋落物，也可能通過拮抗、資源競爭等方式與后定殖的腐生菌相互作用，從而間接影響凋落物分解速率［26－28］。本研究中，帶內(nèi)生真菌的紫花針茅凋落物具有更快的分解速率，進(jìn)而，E+紫花針茅相比E－具有更短的凋落物分解周期（圖1和表1），這可能與以上因素有關(guān)。凋落物分解速率對養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的速度產(chǎn)生直接影響，因此，內(nèi)生真菌的存在加快了紫花針茅凋落物的分解，這有利于短期內(nèi)對草原生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分的補(bǔ)充［29－30］。內(nèi)生真菌對一些禾草凋落物分解的影響已經(jīng)被證實(shí)。Bell-Dereske等［31］發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌的侵染提高了美國沙茅草（Ammaophila breviligulata）的凋落物分解速率，本研究結(jié)果與之一致。然而，早期一些研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌具有降低禾草分解速率的可能，Omacini等［14］通過研究多花黑麥草（Lolium multiflorum）中的內(nèi)生真菌對凋落物分解的影響，發(fā)現(xiàn)凋落物分解速率減少了17%；Lemons等［32］的研究也表明，與對照相比，E+處理的凋落物分解速率降低了8%。這可能主要與宿主植物的種類和共生體的生存環(huán)境等有關(guān)。Siegrist等［33］發(fā)現(xiàn)，盡管帶菌高羊茅（Schedonorus arundinaceus）的凋落物中具有較高的生物堿含量，也未能造成帶菌與不帶菌高羊茅凋落物的干物質(zhì)損失之間的較大差異，其可能原因是高羊茅的枯黃組織中生物堿的濃度非常低，以至于不能影響到微生物分解者。Gundel等［34］的研究也表明，在初始階段凋落物體內(nèi)生物堿含量越高，則其分解速率越大，但是長期觀察的結(jié)果顯示凋落物分解速率與生物堿含量之間沒有相關(guān)性。因此，生物堿可能沒有直接影響凋落物分解，但是可能參與到了初始微生物侵染凋落物的過程當(dāng)中，進(jìn)而影響凋落物分解速率。在與其宿主植物共生的過程當(dāng)中，內(nèi)生真菌也可能通過產(chǎn)生一些罕見的化合物而比生物堿更加直接地調(diào)控這種反應(yīng)［33－34］。

凋落物質(zhì)量與其分解速率密切相關(guān)，是影響其分解的內(nèi)在因素，凋落物質(zhì)量通常以凋落物養(yǎng)分含量的高低來衡量，并以各種含碳化合物（木質(zhì)素、纖維素、單寧等）與養(yǎng)分元素（氮、磷、鉀等）的含量比值來表示，或者直接以養(yǎng)分含量表示［35－36］。在凋落物分解過程中，水溶性物質(zhì)和容易分解的碳水化合物可快速降解，初期呈現(xiàn)較快的分解速率，而木質(zhì)素等難分解物質(zhì)不斷累積，結(jié)合成更加不易分解的高分子化合物，使得凋落物分解速率明顯降低［37］，許多研究發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素在凋落物分解后期呈現(xiàn)凈積累的現(xiàn)象［38－39］。本研究中，紫花針茅凋落物木質(zhì)素含量隨著分解時(shí)間的延長而逐漸降低，并且木質(zhì)素∶N以及木質(zhì)素殘留率也持續(xù)降低（圖2b，圖3a和圖4b），一方面可能是因?yàn)橄鄬δ颈局参锒裕荼镜蚵湮锬举|(zhì)素含量較低［40］，另一方面，本研究中凋落物分解時(shí)間僅持續(xù)一年，尚未進(jìn)行到后期階段。凋落物質(zhì)量損失率小于80%時(shí)認(rèn)為分解處于前期階段，而大于80%處于后期階段［41－42］，本研究中E+和E－紫花針茅凋落物的質(zhì)量損失率分別為51.8%和43.8%，并沒有到達(dá)木質(zhì)素調(diào)控分解速率的后期階段，這可能是木質(zhì)素含量持續(xù)降低的原因之一。在分解初始階段，E+紫花針茅凋落物的木質(zhì)素含量顯著高于E－，而隨著分解時(shí)間的延長，二者之間差距逐漸減小，直至沒有顯著差異（圖2b），并且E+與E－紫花針茅凋落物的木質(zhì)素殘留率沒有顯著差異（圖4b），表明E+紫花針茅凋落物中的木質(zhì)素相比E－而言其降解速率更快，內(nèi)生真菌的調(diào)節(jié)作用在凋落物分解中可能發(fā)揮了顯著作用。隨著分解過程的延長，E+和E－紫花針茅凋落物的纖維素含量均逐漸降低，同時(shí)纖維素∶N以及纖維素殘留率也持續(xù)降低（圖2c，圖3b和圖4c），可見，在紫花針茅凋落物分解過程中，纖維素也隨之逐漸被降解，這與之前的研究結(jié)果一致［39，43］。凋落物C質(zhì)量被認(rèn)為是決定分解的首要因子，纖維素、半纖維素作為凋落物C主要的承載者，一般認(rèn)為在分解過程中，其含量也逐漸降低［39，44］。另一方面，凋落物纖維素主要是由真菌與細(xì)菌分解的，微生物分解者的數(shù)量及活性直接影響著它們的分解速率［45］，因此，內(nèi)生真菌可能通過影響微生物群落進(jìn)而改變紫花針茅凋落物中纖維素的降解速率［14－15］。本研究中，在分解初期，E+與E－紫花針茅纖維素含量沒有顯著差異，隨著分解時(shí)間的延長，E+紫花針茅的纖維素含量、纖維素∶N以及纖維素殘留率顯著低于E－。這也可能與纖維素酶的活性有關(guān)。許多研究表明，較高的N含量能增加纖維素酶的活性從而促進(jìn)纖維素降解［46－47］，本研究發(fā)現(xiàn)E+紫花針茅至分解后期有更高的全N含量（圖2a），這可能部分解釋了后期E+紫花針茅凋落物纖維素的降解速率顯著高于E－的原因。

凋落物分解過程中，由于養(yǎng)分釋放速度慢于凋落物質(zhì)量損失速率，N、P等養(yǎng)分元素相對含量一般會逐漸升高［48］。本研究中，紫花針茅凋落物全氮含量隨著時(shí)間的延長有上升的趨勢（圖2a），與前人的研究一致［36］。凋落物在分解過程中養(yǎng)分元素的遷移模式主要有：淋溶－富集－釋放、富集－釋放和直接釋放3種模式［49－50］。元素的殘留率與釋放率密切相關(guān)，所以利用化學(xué)元素殘留率的趨勢圖可分析元素在分解過程中的釋放情況，即殘留率下降表示元素在釋放，殘留率上升表示元素在富集［36，49－50］。E+和E－紫花針茅凋落物分解過程中N元素的殘留率基本呈下降－升高－下降的趨勢，表明紫花針茅的凋落物分解N元素的遷移可能呈淋溶－富集－釋放模式。其中E+紫花針茅凋落物中的N殘留率相比E－而言變化更快，且在后期，E+凋落物的N殘留率顯著低于E－（圖4a），這可能是由于E+紫花針茅分解過程中微生物活動更加強(qiáng)烈，對N的需求更高，這也部分解釋了E+紫花針茅凋落物相比E－具有更快的分解速度的原因。凋落物分解主要是微生物作用的過程，它們在分解過程中對N、P等元素濃度有很高的要求，因此，當(dāng)?shù)蚵湮锖@些養(yǎng)分濃度較高時(shí)，微生物群落生長繁殖加速，活動加劇，分解速度加快［36，51］。這也可能是E+紫花針茅凋落物在分解過程中具有更低的纖維素殘留率的原因之一（圖4c），有研究表明，內(nèi)生真菌在強(qiáng)化還田秸稈中有較廣泛的應(yīng)用［52］，即植物內(nèi)生真菌有降解纖維素的能力［53］，由此可以推測，在本研究中，內(nèi)生真菌也可能通過促進(jìn)紫花針茅凋落物中纖維素的降解提高凋落物分解速率。然而隨著分解時(shí)間的延長，這種優(yōu)勢有減弱的趨勢，這可能主要是由于此時(shí)E+與E－紫花針茅凋落物中纖維素的殘留率均到了較低的水平，因此內(nèi)生真菌的作用逐漸不明顯。

4 結(jié)論

內(nèi)生真菌可以增強(qiáng)宿主植物紫花針茅的凋落物分解速率，縮短其分解周期，同時(shí)，隨著分解時(shí)間的延長，內(nèi)生真菌不同程度地促進(jìn)了紫花針茅凋落物中N元素、木質(zhì)素和纖維素的降解。因此，內(nèi)生真菌對于加快紫花針茅向草地生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分輸入起到積極作用。然而，本研究只觀測了短期內(nèi)凋落物分解的過程，更長期的凋落物分解變化以及分解環(huán)境條件、微生物活動和內(nèi)生真菌次生代謝物等因素的影響仍需要進(jìn)一步研究。