HER2陽性乳腺癌細(xì)胞來源的可溶性PD-L1對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用探討*

袁惠玲，吳麗華，陳桂林，黃珂銘

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞人民醫(yī)院乳腺科，廣東東莞 523000)

人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)陽性乳腺癌(以下簡稱HER2+乳腺癌)是一類由HER2/neu引發(fā)的低免疫力型惡性乳腺腫瘤，占原發(fā)性浸潤性乳腺癌的15%～30%[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，HER2/neu是一種具有酪氨酸激酶活性的免疫原性蛋白，可在HER2+腫瘤患者中引起體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)[3]。無論是通過“免疫編輯”還是其他免疫逃逸機(jī)制，在HER2+乳腺癌腫瘤微環(huán)境中對HER2/neu的細(xì)胞免疫反應(yīng)減弱都與較差的預(yù)后相關(guān)[4]。相反，針對HER2/neu的細(xì)胞和體液反應(yīng)增加與腫瘤發(fā)生減少和預(yù)后改善有關(guān)[5]。HER2/neu過表達(dá)的癌癥患者通常表現(xiàn)出針對該蛋白的現(xiàn)有免疫力降低[5]。因此，HER2/neu在刺激致瘤性免疫微環(huán)境中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，然而HER2/neu是否參與乳腺癌免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)尚未明確。

巨噬細(xì)胞是一群具有調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)作用的固有免疫細(xì)胞亞群，根據(jù)其表型分為M1或M2樣狀態(tài)[6]。M1型巨噬細(xì)胞與促炎反應(yīng)有關(guān)，而M2型巨噬細(xì)胞與血管新生和炎癥抑制相關(guān)[6]。乳腺癌中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage，TAM)主要是M2型巨噬細(xì)胞亞群，其促進(jìn)乳腺腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)進(jìn)程，包括腫瘤細(xì)胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[7]；其次，TAM還可以在乳腺癌模型中誘導(dǎo)對多種治療的耐藥性[8]。重要的是，HER2蛋白過表達(dá)或基因擴(kuò)增發(fā)生在20%～30%的新診斷的晚期乳腺癌患者中，且晚期乳腺癌表現(xiàn)出高度極化的M2型TAM[8]。然而，HER2+乳腺癌細(xì)胞是否影響巨噬細(xì)胞極化仍不清楚。因此，在本研究中：(1)論證HER2+乳腺癌患者外周血和癌組織中可溶性程序性死亡配體1(soluble programmed death-ligand 1，sPD-L1)和癌組織局部巨噬細(xì)胞極化的關(guān)系；(2)體外探究HER2-腺癌細(xì)胞系和HER2+腺癌細(xì)胞系培養(yǎng)上清sPD-L1水平的差異；(3)探究HER2-腺癌細(xì)胞系和HER2+腺癌細(xì)胞系培養(yǎng)上清對巨噬細(xì)胞極化和功能的影響，以揭示HER2+和HER2-乳腺癌細(xì)胞對巨噬細(xì)胞極化的影響，并為HER2+和HER2-乳腺癌的抗PD-L1治療提供新的理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

征集2018年4月至2020年6月HER2-和HER2+乳腺癌患者各20例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)后經(jīng)病理檢查診斷為浸潤性乳腺癌；(2)術(shù)前未進(jìn)行放化療和免疫治療；(4)符合HER2+乳腺癌或HER2-乳腺癌判定標(biāo)準(zhǔn)，即免疫組織化學(xué)染色雌激素受體陰性(ER-)孕激素受體陰性(PR-)和HER2+細(xì)胞80%以上判為HER2+乳腺癌，ER-PR-和HER2-細(xì)胞80%以上判為HER2-乳腺癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移者；(2)其他腫瘤轉(zhuǎn)移到乳腺者;(3)合并嚴(yán)重心、肝、腎衰竭者；(4)合并嚴(yán)重心血管疾病者;(5)合并其他系統(tǒng)嚴(yán)重原發(fā)病者,如消化道疾病、泌尿系統(tǒng)疾病等。收集患者一般臨床資料，兩組年齡、體重指數(shù)(BMI)、腫瘤尺寸，以及淋巴結(jié)陽性、3級腫瘤、HER1+、ER+、PR+患者百分比比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組Ki-67+患者百分比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。本文研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者、志愿者均對本研究知情并簽署知情同意書。

表1 HER2-和HER2+乳腺癌患者臨床特征比較(n=20)

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù)

乳腺癌細(xì)胞系BT-474、SK-BR-3、MDA-MB 453和MDA-MB 468購自武漢普諾賽生命科技有限公司。所有細(xì)胞系在含有100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素(美國Thermo Fisher Scientific公司)和10%胎牛血清(四季青，浙江天杭生物科技股份有限公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher Scientific公司)中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱。5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h貼壁后，收集0、12、24和48 h的培養(yǎng)上清液，1 000×g離心10 min。棄去沉淀后保留上清液，即為乳腺癌細(xì)胞條件性培養(yǎng)基(breast cell conditional medium，BCM)。

1.2.2ELISA

根據(jù)人PD-L1 ELISA說明書(武漢華美生物工程有限公司)檢測HER2-和HER2+乳腺癌患者外周血漿和組織勻漿液中sPD-L1表達(dá)。稱取約100 mg組織，用1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗組織。然后加入含苯甲基磺酰氟(PMSF，武漢塞維爾生物科技有限公司)的RIPA裂解液勻漿破碎后14 000×g 4 ℃離心20 min，收集上清液。將50 μL血漿和組織勻漿液加入微孔中，然后在室溫下于黑暗處孵育60 min。將液體從孔中倒出，并用吸收紙輕拍以確保液體完全通過孔排出。然后將偶聯(lián)酶(50 μL)加入孔中，在室溫下于黑暗處孵育60 min。洗滌過程重復(fù)3次。這些過程之后，將底物(50 μL)添加到每個(gè)孔中，并在室溫下在黑暗處孵育30 min。每孔加入終止試劑，并測定450 nm處的吸光度值(A450值)。每個(gè)樣品重復(fù)測量3次。

1.2.3人外周血單個(gè)核細(xì)胞分離和原代巨噬細(xì)胞培養(yǎng)

HER2-和HER2+乳腺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)收集至乙二胺四乙酸(EDTA)處理抗凝采血管中，混勻后加入至等體積的單個(gè)核細(xì)胞淋巴分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)上層，800×g離心30 min后吸取單個(gè)核細(xì)胞層。加入PBS漂洗3次。加入含有100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素(美國Thermo Fisher Scientific公司)和10%胎牛血清(美國Thermo Fisher Scientific公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher Scientific公司)中重懸并計(jì)數(shù)。1×105個(gè)細(xì)胞接種于12孔板，每孔加入50 ng/mL重組人巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinant human macrophage colony-stimulating factor，rhM-CSF，美國PeproTech公司)，培養(yǎng)7 d貼壁后加入BCM培養(yǎng)24 h。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)

巨噬細(xì)胞的表型檢測采用異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)的抗人CD68(61D3)、PE-Cyanine7偶聯(lián)的抗人CD86(IT2.2)和PE-Cyanine7偶聯(lián)的抗人CD206(19.2)，均購自美國eBioscience公司。采用1% TritonX-100破膜10 min后，加入PBS漂洗重懸，加入上述抗體2.5 mL。室溫孵育30 min 后加入PBS漂洗重懸。通過NovoCyte流式細(xì)胞儀分析巨噬細(xì)胞的表型，使用Treestar FlowJo 10.0.7版軟件(美國TreeStar公司)分析數(shù)據(jù)。

1.2.5總RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

采用Trizol法提取巨噬細(xì)胞總RNA。使用Nanodrop分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher Scientific公司)分析RNA濃度和純度。1 000 ng RNA采用第一島鏈cDNA合成試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)合成cDNA。以10 ng為模板，采用SYBR Green Ⅰ染料(日本TaKaRa公司)在qRT-PCR儀(型號：Applied Biosystems 7900)檢測mRNA基因表達(dá)水平。反應(yīng)條件：98 ℃ 3 min，98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，采用2-ΔΔCt計(jì)算擴(kuò)增倍數(shù)。引物見表2。

表2 qPCR引物序列

1.2.6Western blot

乳腺癌細(xì)胞系總蛋白采用RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)提取。5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h貼壁后培養(yǎng)48 h。棄去上清液后PBS漂洗1次，加入300 μL含1 mmol/L的PMSF(武漢塞維爾生物科技有限公司)孵育10 min。收集至1.5 mL EP管中，超聲5 s。14 000×g 4 ℃離心20 min。上清液采用Broadford檢測蛋白濃度并變性。以50 μg蛋白上樣量在10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠電泳分離，300 mA恒流濕轉(zhuǎn)2 h至聚偏二氟乙烯膜上，含5%牛血清清蛋白(BSA)的TBST溶液室溫封閉1 h，加入HER2一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)后4 ℃搖床孵育12 h，第2天TBST室溫漂洗3次，每次5 min。室溫孵育二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)1 h，TBST溶液以1∶5 000稀釋，TBST室溫漂洗3次，每次5 min。電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)發(fā)光顯示。蛋白表達(dá)采用ImageJ軟件分析灰度值，標(biāo)準(zhǔn)化至β-actin(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 HER2-和HER2+患者外周血漿和組織勻漿液中sPD-L1表達(dá)水平

HER2+患者外周血漿和組織勻漿液中sPD-L1表達(dá)水平明顯高于HER2-患者，見圖1。

A：HER2-和HER2+患者的外周血漿中sPD-L1表達(dá)水平；B：HER2-和HER2+患者的組織勻漿液中sPD-L1表達(dá)水平；a：P<0.001。

2.2 HER2-和HER2+患者組織局部M1和M2巨噬細(xì)胞的比例

HER2+患者組織中M1型巨噬細(xì)胞比例(CD86+CD206-CD68+/CD68+)明顯低于HER2-患者(圖2A、B)，M2型巨噬細(xì)胞比例(CD86-CD206+CD68+/CD68+)明顯高于HER2-患者(圖2A、C)。

2.3 HER2-和HER2+腺癌細(xì)胞HER2表達(dá)和sPD-L1水平

相比于HER2-腺癌細(xì)胞系(BT-474和SK-BR-3)，HER2+腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-453和MDA-MB-468)高表達(dá)HER2，見圖3A、B。HER2-腺癌細(xì)胞系(SK-BR-3)和HER2+腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-453)BCM中的sPD-L1水平隨培養(yǎng)時(shí)間增加而上升，見圖3C、D。

A：HER2-和HER2+患者組織M1(CD86+CD206-CD68+/ CD68+)和M2型(CD86-CD206+CD68+/ CD68+)巨噬細(xì)胞極化流式細(xì)胞圖；B：HER2-和HER2+患者組織M1型巨噬細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)圖；C：HER2-和HER2+患者組織M2型巨噬細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)圖；a：P<0.05，b：P<0.001。

2.4 HER2-和HER2+腺癌細(xì)胞系培養(yǎng)上清液對PBMC源巨噬細(xì)胞表型極化的影響

相比于HER2-腺癌細(xì)胞系(BT-474和SK-BR-3)，HER2+腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-453和MDA-MB-468)BCM中的sPD-L1明顯上升，見圖4A。HER2+腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-453)BCM處理的M1型(CD86+CD206-CD68+/CD68+)和M2型(CD86-CD206+CD68+/CD68+)巨噬細(xì)胞比例明顯高于HER2-腺癌細(xì)胞系(SK-BR-3)，見圖4B、C、D。HER2+腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-453)培養(yǎng)上清液處理組M1/M2比值明顯高于HER2-腺癌細(xì)胞系(SK-BR-3)處理組，見圖4E。

2.5 HER2-和HER2+腺癌細(xì)胞系BCM對PBMC源巨噬細(xì)胞功能極化的影響

為了進(jìn)一步明確HER2-和HER2+腺癌細(xì)胞系對PBMC源巨噬細(xì)胞的功能極化，檢測M1型和M2型巨噬細(xì)胞功能相關(guān)基因mRNA水平。M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因IFN-γ、IL-1β和INOS mRNA水平明顯降低，M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因IL-10、TGF-β和ARG1 mRNA水平明顯上升，見圖5。

A：HER2-腺癌細(xì)胞系(BT-474和SK-BR-3)和HER2+腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-453和MDA-MB-468)HER2表達(dá)Western blot圖；B：腺癌細(xì)胞系HER2相對表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)圖；C：HER2-腺癌細(xì)胞系(SK-BR-3)BCM中sPD-L1水平統(tǒng)計(jì)圖；D：HER2+腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-453)BCM中sPD-L1水平統(tǒng)計(jì)圖；a：P<0.05，b：P<0.01。

A：HER2-腺癌細(xì)胞系(BT-474和SK-BR-3)和HER2+腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-453和MDA-MB-468)培養(yǎng)上清液sPD-L1水平檢測；B：M1型(CD86+CD206-CD68+/CD68+)和M2型(CD86-CD206+CD68+/CD68+)巨噬細(xì)胞極化流式細(xì)胞圖；C：M1型(CD86+CD206-CD68+/CD68+)巨噬細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)圖；D：M2(CD86-CD206+CD68+/CD68+)巨噬細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)圖；E：M1/M2型巨噬細(xì)胞比值統(tǒng)計(jì)圖；a：P<0.05，b：P<0.001。

a：P<0.05，b：P<0.001。

3 討 論

巨噬細(xì)胞是關(guān)鍵的免疫細(xì)胞和炎癥過程的重要調(diào)節(jié)劑[6]。駐留的巨噬細(xì)胞可以充當(dāng)組織損傷的傳感器，并且可以維持組織穩(wěn)態(tài)[6]。盡管已經(jīng)使用分子標(biāo)記(如HER2)對乳腺癌疾病進(jìn)行分類，以預(yù)測預(yù)后并確定治療方式[3]。但目前的診斷和治療方式仍存在不足，許多患者因疾病復(fù)發(fā)而死亡。因而，進(jìn)一步發(fā)掘和明確HER2乳腺癌的特征有助于其診斷和治療。本研究對HER2表達(dá)在乳腺癌免疫微環(huán)境巨噬細(xì)胞極化中的作用進(jìn)行探討，結(jié)果顯示：(1)HER2+乳腺癌患者外周血和癌組織中sPD-L1水平明顯升高，并伴隨癌組織局部M2型巨噬細(xì)胞極化，提示HER2+患者免疫力降低可能與外周血漿和組織微環(huán)境中升高的sPD-L1有關(guān)。(2)HER2-腺癌細(xì)胞系(BT-474和SK-BR-3)和HER2+腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-453和MDA-MB-468)均可分泌sPD-L1，且HER2+腺癌細(xì)胞系分泌更多的sPD-L1，提示HER2+患者組織微環(huán)境中升高的sPD-L1可能來自HER2+腺癌細(xì)胞，并可能參與組織M1和M2巨噬細(xì)胞極化。(3)HER2+腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-453)促進(jìn)M1型和M2型巨噬細(xì)胞比例增加，同時(shí)促進(jìn)M1/M2平衡向M2型巨噬細(xì)胞功能極化偏移，提示HER2+腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-453)來源的sPD-L1可能促進(jìn)M1和M2型巨噬細(xì)胞極化平衡向M1。

HER2在大多數(shù)原位乳腺癌中表達(dá)，但僅在20%～30%的浸潤性乳腺癌中得到維持[9]。在乳腺癌的發(fā)生過程中，觀察到HER2表達(dá)從良性到導(dǎo)管癌逐漸減少，在浸潤性乳腺癌中HER2幾乎不表達(dá)[10]。然而，HER2在乳腺癌中的作用尚未完全明確。本研究結(jié)果表明，在HER2+乳腺癌患者中，高表達(dá)sPD-L1可能促進(jìn)癌組織局部M2型巨噬細(xì)胞激活。因而，可能促進(jìn)腫瘤生長和侵襲，導(dǎo)致免疫力降低和腫瘤血管新生[11-12]。

研究表明，肝細(xì)胞肝癌和滋養(yǎng)細(xì)胞來源的sPD-L1具有調(diào)控巨噬細(xì)胞極化介導(dǎo)免疫耐受的作用[13-14]。且血清高水平sPD-L1與轉(zhuǎn)移性晚期胃癌患者一線化療的總體生存期較差有關(guān)[12]。巨噬細(xì)胞極化是癌組織免疫微環(huán)境紊亂和腫瘤免疫治療低效的重要因素[15-16]。本研究體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HER2+腺癌細(xì)胞來源的sPD-L1具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的作用。這可能促進(jìn)乳腺癌組織血管新生、腫瘤生長及組織炎性反應(yīng)，導(dǎo)致抗腫瘤免疫炎癥治療低效[11]。

綜上所述，sPD-L1高表達(dá)于HER2+乳腺癌患者癌組織和外周血中，且HER2+乳腺癌患者癌組織局部巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)M2極化偏移。HER2+腺癌細(xì)胞來源的sPD-L1促進(jìn)M1型和M2型巨噬細(xì)胞極化，且M1/M2平衡偏向M1型并伴隨M2型功能增強(qiáng)。但是，尚需進(jìn)一步的直接證據(jù)說明sPD-L1如何調(diào)控巨噬細(xì)胞及其分子機(jī)制。同時(shí)，下調(diào)sPD-L1是否在體影響HER2+乳腺癌患者癌組織巨噬細(xì)胞功能極化和抑制腫瘤生長尚需進(jìn)一步闡明。因此，sPD-L1作為HER2+乳腺癌的治療靶點(diǎn)仍有待研究。