Circ_0007142吸附miR-647調控CCR8基因 促進胃癌細胞的上皮-間質轉化和侵襲

張學成，關曉輝

1.吉林市中心醫(yī)院消化科，吉林 吉林 132000；2.北華大學附屬醫(yī)院消化內科，吉林 吉林 132000

胃癌發(fā)病率和死亡率高，是具有高度侵襲性和轉移性的惡性腫瘤之一［1］。手術治療、化療、靶向治療是目前治療胃癌的有效方法［2］。胃癌具有高轉移和侵襲的特征，因此晚期患者的治療效果不佳［3］。所以，加深對胃癌的認識，在分子水平上探討發(fā)病機制，尋找新的治療靶點顯得尤為重要。

環(huán)狀RNA（circRNA）因其不易被核酸外切酶降解的特性而備受關注，能在體內保持穩(wěn)定，具有作為疾病診斷標志物的巨大潛力［4］。近年來，研究［5］發(fā)現circRNA可以作為癌癥的啟動因子，例如circ-UMAD1在甲狀腺癌患者的血清中表達相對較高，具有較高的生物標志物潛能。Circ_0003829在口腔鱗癌中表達降低，受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析circ_0003829在口腔鱗癌中具有較高的敏感性，可以作為口腔鱗癌診斷的生物標志 物［6］。同樣，circRNA也可以作為胃癌的啟動因子，例如circ_0005556、circ-RNF111都可以促進胃癌的發(fā)展［7-8］。Circ_0007142作為最新發(fā)現的circRNA，被鑒定為結直腸癌的致癌基因，能促進結直腸癌的進展［9］，但在胃癌中的作用目前還沒有被揭示。

經研究［10］發(fā)現，circRNA可以作為競爭性內源RNA，海綿化microRNA，進而調節(jié)下游靶基因，參與疾病的發(fā)展。在食管癌中circ_0008717通過調控miR-203/Slug來促進癌細胞的增殖、侵襲和遷移［11］。microRNA是一類短鏈RNA，屬于非編碼RNA的一個亞類，經常被視為抑癌基因并結合上游circRNA來進行研究，Xu等［12］在關于結直腸癌的研究中發(fā)現circRNA DSCAM-AS1通過miR-137/Notch1促進癌癥發(fā)展，miR-137可以逆轉DSCAM-AS1對結直腸癌的促進作用。Ma等［13］認為血清中miR-647的降低與胃癌患者的不良預后相關。但circ_0007142結合miR-647在胃癌中的作用尚未被證實，另外有研究［14］發(fā)現，miR-647的下游存在靶基因CC族趨化因子受體8（CC chemokine receptor 8，CCR8），抗CCR8治療可以有效地抑制小鼠結腸癌腫瘤的生長。此外也有研究［15］表明胃淋巴瘤中CCR8表達上調。

根據以上發(fā)現，本研究探討circ_0007142吸附miR-647調控CCR8在胃癌發(fā)展過程中的生物學作用，旨在為胃癌的靶向治療提供新的依據。

1 材料和方法

1.1 細胞系與材料

GES-1細胞、AGS細胞、SNU-16細胞、GES-1細胞專用培養(yǎng)基、AGS細胞專用培養(yǎng)基均購自寧波明舟生物科技有限公司。TRlzol分離試劑、高容量cDNA反轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）試劑盒、7500 Fast RTFQ-PCR系統(tǒng)、LipofectamineTM3000試劑、PVDF膜均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，FISH）實驗試劑盒購自上海歌凡生物科技有限公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。pmirGLO雙螢光素酶報告基因載體質粒、HEK-293T細胞均購自BioVector中國質粒載體菌株細胞株基因保藏中心。RIP試劑盒購自廣州吉賽生物科技股份有限公司。Matrigel基質膠購自上海前塵生物科技有限公司。Transwell小室購自美國Corning公司。熒光顯微鏡購自徠卡顯微系統(tǒng)（上海）有限公司。0.1%結晶紫染色、0.5%結晶紫染色、RIPA裂解液均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 臨床組織與實驗動物

從北華大學附屬醫(yī)院獲取2018年3月—2020年4月就診的胃癌患者的癌組織與鄰近癌旁正常組織48組（距離原發(fā)灶邊緣4.0～6.5 cm），其中男性患者25例，女性患者23例，TNM分期為：Ⅰ～Ⅱ期患者28例，Ⅲ期患者20例。參與該研究的所有患者承諾之前從未接受過任何放療及化療，并簽署知情同意書。本實驗嚴格遵守北華大學附屬醫(yī)院倫理委員會的要求。獲取的組織存放于液氮中進行保存。20只SPF級BALB/c無菌裸小鼠，5周齡，質量為（19±2）g，購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉染

本研究使用人正常胃黏膜細胞GES-1和人胃癌細胞系AGS、SNU-16進行實驗，GES-1細胞使用RPMI-1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素鏈霉素混合液進行培養(yǎng)，AGS、SNU-16細胞使用F-12培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素及鏈霉素混合液進行培養(yǎng)。所有細胞在37 ℃、CO2體積分數為5%的環(huán)境中培養(yǎng)，1 d后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)進行培養(yǎng)。

當細胞培養(yǎng)到70%左右融合度，按照實驗分組進行轉染，siRNA質粒載體、miRNA抑制劑、miRNA過表達載體均來自上海吉瑪基因有限公司，體外實驗分組為si-NC、si-cicr_0007142、miR-647 NC、miR-647 mimic、si-cicr_0007142+inhibitor NC、si-cicr_0007142+miR-647 inhibitor、miR-647 mimic+vector、miR-647 mimic+OE-CCR8；體內實驗分組為si-NC、si-cicr_0007142。制備細胞懸液，植入96孔板中，使用LiopfectamineTM3000轉染試劑進行轉染，步驟按照試劑盒出廠說明書進行。

1.4 RTFQ-PCR

根據試劑盒要求使用TRIzol試劑提取樣本中的總RNA，并對RNA的濃度、純度進行檢測。根據高容量cDNA反轉錄試劑盒的要求將總RNA合成第一鏈cDNA。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司提供（表1）。最后根據RTFQ-PCR試劑盒要求，在7500 Fast實時熒光定量PCR系統(tǒng)上進行檢測。相對表達量使用2-ΔΔCt計算，U6將miRNA進行標準化，GAPDH將circRNA和CCR8標準化。

表1 RTFQ-PCR引物序列Tab.1 RTFQ-PCR primer sequences

1.5 FISH實驗

樣本在4%多聚甲醛室溫下固定30 min，DEPC水洗并干燥，30%H2O2+純甲醇對樣本進行處理，再滴加0.25%的HCl溶液，15 min后用DEPC水洗。樣本加入蛋白酶K反應20 min，用0.1 mol/L甘氨酸洗液終止反應。PBS水洗后用4%PFA多聚甲醛進行再固定，5×SSC水洗后加入預雜交液65 ℃反應1 h。加入500 ng/mL digoxigenin-labeled probe探針，暗室中65 ℃溫育48 h，用封閉液溫育30 min，加入生物素化鼠抗地高辛抗體，37 ℃溫育1 h，加入FITC 標記抗體，暗室下37 ℃溫育 30 min，DAPI染核，封片，熒光顯微鏡下觀察染色結果。

1.6 雙熒光素酶報告基因實驗

構建circ_0007142與CCR8基因的野生型片段，命名為circ_0007142-WT、CCR8-WT，將野生型基因片段使用內切酶位點SpeⅠ和Hind Ⅲ擴增插入到pmirGLO雙螢光素酶報告基因載體上。在circ_0007142-WT、CCR8-WT的野生型片段上設計種子序列的互補序列突變位點，命名為circ_0007142-MUT、CCR8-MUT，利用限制性內切酶與T4 DNA連接酶將突變型基因片段擴增插入到pmirGLO載體上。將這些報告質粒與miR-647 NC或miR-647 mimic使用LipofectamineTM3000試劑共轉染到HEK-293T細胞中，48 h后收集細胞并進行充分裂解，離心后取上清液加入熒光素酶反應試劑，再加入細胞裂解液，最后測量螢火蟲熒光素酶活性，并以腎素熒光素酶活性為標準化參考。以上詳細步驟均按照試劑盒說明書進行。

1.7 RNA結合蛋白免疫沉淀（RNA-binding protein immunoprecipitation，RIP）實驗

應用RIP試劑盒驗證circ_0007142與miR-647、CCR8與miR-647的靶向關系。將細胞使用PBS水洗以后，裂解，收集裂解液進行實驗，最后使用RTFQ-PCR檢測circ_0007142、miR-647、CCR8的豐度。詳細實驗步驟按照RIP試劑盒出廠說明書進行嚴格操作。

1.8 Transwell實驗

將冷凍的Matrigel基質膠融化，加入無血清培養(yǎng)基進行稀釋，稀釋液添加到transwell小室的上室，以5×104個細胞/孔的密度植入到上室的 24孔板中，并添加無血清培養(yǎng)基，下室則添加含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，37 ℃下溫育24 h，多聚甲醛固定細胞，0.1%結晶紫染色，在顯微鏡下觀察細胞侵襲數量。

1.9 克隆形成實驗

將細胞植入6孔板，每孔5×103個細胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，每3 d更換新培養(yǎng)基。培養(yǎng)結束后經PBS洗滌、乙醇固定后，使用0.5%結晶紫進行染色。最后在顯微鏡下觀察細胞集落形成數量。

1.10 Western blot檢測

RIPA裂解液將細胞分離提取蛋白，加入PMSF調整濃度，使用BCA定量試劑盒按照說明書要求檢測蛋白濃度；蛋白在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，然后將其轉移到PVDF膜上，再加入5%脫脂牛奶進行封閉。加入一抗vimentin（1∶2 000）、E-cadherin（1∶500）、N-cadherin（1∶500）、GAPDH（1∶1 000）與膜4 ℃過夜溫育，使用TBST進行沖洗，加入HRP標記的山羊抗兔二抗IgG（1∶ 1 000），室溫下溫育1 h。加入ECL使蛋白信號可視化，在Image J軟件上進行分析。

1.11 免疫組織化學實驗

石蠟切片并脫蠟至水，加入3%H2O2溫育以滅活內源性過氧化物酶。蒸餾水和PBS沖洗，微波抗原修復，血清封閉后加入一抗CCR8，4 ℃溫育過夜，PBS沖洗后加入生物素標記的二抗，室溫溫育30 min后PBS沖洗，DAB顯色，自來水沖洗、脫水、透明并封片，顯微鏡下拍照。借助Image J軟件對染色結果進行半定量分析，計算陽性表達率。

1.12 裸小鼠移植瘤實驗

BALB/c裸小鼠被安置在無菌環(huán)境中飼養(yǎng)。對癌細胞分別轉染si-NC、si-circ_0007142，之后再將細胞注射到裸小鼠右側皮下，每隔4 d測量1次皮下腫瘤體積。35 d以后，注射異氟醚麻醉裸小鼠，斷頸處死，取出腫瘤后拍照、測量體積并稱重。

“不要再說啦，她的虧，我這一生吃夠了，再不要在我面前提她！”說罷，蔣浩德起身要走，身體搖晃了兩下，紫云一把抱住他。他回過神來，眼睛直直地望著紫云，感受到來自女人的體溫，差點窒息。

1.13 統(tǒng)計學處理

本實驗數據采用SPSS 22.0軟件完成統(tǒng)計學分析，體外實驗重復進行3次，所得結果用表示；兩組間符合正態(tài)分布則采用t檢驗，多組間采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Circ_0007142在胃癌組織和細胞中高表達

通過RTFQ-PCR檢測circ_0007142在胃癌組織和細胞中的表達，結果顯示，與癌旁組織相比，胃癌組織中circ_0007142顯著高表達（P＜0.05，圖1A）。與GES-1細胞相比，胃癌細胞系AGS、SNU-16中circ_0007142的表達都顯著升高（P均＜0.05，圖1B），其中AGS細胞的表達（3.47±0.29）比SNU-16（2.98±0.21）高，因此本研究選擇AGS細胞進行后續(xù)功能實驗。ROC曲線分析顯示，circ_0007142可作為胃癌診斷的一個重要指標（AUC=0.859 8，P<0.000 1，圖1C）。通過分析circ_0007142的表達與臨床病理學特征的相關性可見，circ_0007142高表達與TNM分期和腫瘤浸潤深度相關（P均<0.05，表2）。以上實驗結果表明，circ_0007142高表達可能與胃癌發(fā)展相關。

表2 Circ_0007142的表達與胃癌患者臨床病理特征關系Tab.2 Relationship between expression of circ_0007142 and clinicopathological features in patients with gastric cancer

圖1 RTFQ-PCR檢測circ_0007142的表達Fig.1 RTFQ-PCR was adopted to detect the expression of circ_0007142

2.2 敲減circ_0007142抑制胃癌細胞的克隆形成、侵襲和EMT

通過克隆形成實驗、transwell、Western blot檢測探討circ_0007142表達水平對胃癌細胞生物學行為的影響。結果表明，與si-NC組相比，si-circ_0007142組細胞的集落形成與侵襲均被抑制（P均<0.05，圖2A、B）。與si-NC組相比，si-circ_0007142組細胞中vimentin與N-cadherin的蛋白水平均下調，而E-cadherin的蛋白水平上調（均P<0.05，圖2C）。以上實驗說明，敲減circ_0007142的表達能夠抑制胃癌細胞的集落形成能力與侵襲，并且抑制EMT的形成，進而參與胃癌的進展。

圖2 敲減circ_0007142的表達能夠抑制胃癌細胞惡性生物學行為Fig.2 Knockdown of circ_0007142 expression inhibits the malignant biological behavior of gastric cancer cells

2.3 在胃癌細胞中，circ_0007142可以吸附miR-647

FISH實驗結果顯示，circ_0007142在細胞質和細胞核均有表達，但主要定位于細胞質（圖3A）。Circular RNA Interactome（https://circinteractome.nia.nih.gov/index.html）網站中發(fā)現miR-647與circ_0007142存在結合位點，同時設計了circ_0007142的突變位點（圖3B），之后通過雙熒光素酶報告基因和RIP實驗驗證了miR-647和circ_0007142之間的靶向作用關系，結果顯示，與circ_0007142-WT+miR-647 NC組相比，circ_0007142-WT+miR-647 mimic組細胞的熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），而circ_0007142-MUT+miR-647 NC組與circ_0007142-MUT+miR-647 mimic組的熒光素酶活性無顯著變化（P>0.05）。RIP實驗結果顯示，與miR-647 NC組相比，circ_0007142在miR-647 mimic組的Ago2抗體上富集更多，circ_0007142與miR-647的靶向關系得到證實（圖3C、D）。通過RTFQ-PCR發(fā)現miR-647在胃癌組織中表達較正常組織降低（P＜0.05，圖3E），此外，miR-647在胃癌細胞中的表達較正常細胞同樣降低（P＜0.05，圖3F），胃癌組織中miR-647的表達與circ_0007142呈負相關關系（r=-0.7514，P＜0.000 1，圖3G），且敲減circ_0007142能夠誘導miR-647的表達（P＜0.05，圖3H）。以上實驗結果表明circ_0007142可以作為分子海綿吸附miR-647而發(fā)揮作用。

圖3 Circ_0007142可以作為分子海綿吸附miR-647Fig.3 Circ_0007142 absorbs the expression of miR-647 as a molecular sponge

2.4 miR-647抑制劑可以部分挽救沉默circ_0007142對胃癌細胞的作用

對circ_0007142通過miR-647調控胃癌細胞的生物學行為進行研究，結果表明si-circ_0007142轉染對胃癌細胞的克隆形成、侵襲和EMT有抑制作用，但該作用被miR-647 inhibitor部分挽救（P均＜0.05，圖4A～C）。

圖4 各組細胞克隆形成、侵襲和EMT相關因子表達Fig.4 Clone formation,invasion and expressions of EMT related factors in each group of cells

2.5 CCR8是miR-647的下游靶點且在胃癌組織和細胞中表達增強

在TargetScan（http://www.targetscan.org/vert_71/）數據庫中發(fā)現CCR8與miR-647存在結合位點，同時設計CCR8的突變位點（圖5A）。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，與CCR8-WT+miR-647 NC組相比，CCR8-WT+miR-647 mimic組細胞的熒光素酶活性下調（P<0.05），CCR8-MUT+miR-647 NC組與CCR8-MUT+miR-647 mimic組的熒光素酶活性差異無顯著變化（P＞0.05）。RIP實驗結果顯示，與miR-647 NC組相比，CCR8在miR-647 mimic的Ago2抗體上富集更多（P<0.05）。CCR8與miR-647的互作用關系被證實（圖5B、C）。結合GEPIA（http://gepia）數據庫與UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）數據庫發(fā)現CCR8在胃癌組織中高表達（圖5D、E）。RTFQ-PCR和免疫組織化學檢測結果顯示與網站預測結果一致，CCR8在胃癌組織中的表達高于正常組織（P＜0.05，圖5F、G），在胃癌細胞中也得到同樣的結果（P均＜0.05，圖5H），相關性分析顯示，CCR8的mRNA表達與miR-647表達呈負相關（P＜0.000 1，圖5I）。RTFQ-PCR檢測干預miR-647的表達對CCR8的影響，結果顯示，過表達miR-647能夠顯著抑制CCR8的表達（P<0.05，圖5J）。相對于inhibitor NC組，敲減miR-647的表達能夠誘導CCR8表達增強，但該作用被 si_circ_0007142部分挽救（P均<0.05，圖5K）。以上實驗結果說明，CCR8是miR-647的下游靶點，circ_0007142能夠作為分子海綿吸附miR-647進而調控CCR8的表達。

圖5 CCR8是miR-647的下游靶基因且其表達受circ_0007142的調控Fig.5 CCR8 was a downstream target gene of miR-647 and its expression was regulated by circ_0007142

2.6 過表達CCR8可以部分挽救上調miR-647對胃癌細胞的作用

通過克隆形成實驗、transwell、Western blot實驗分析CCR8是否能影響miR-647調控的胃癌細胞生物學行為。結果發(fā)現，miR-647 mimic能夠抑制胃癌細胞的克隆形成、侵襲和EMT，但該作用被OE-CCR8部分挽救（P均＜0.05，圖6）。

圖6 各組細胞克隆形成、侵襲和EMT相關因子表達Fig.6 Clone formation,invasion and expressions of EMT related factors in each group of cells

2.7 敲減circ_0007142可以抑制裸小鼠體內成瘤能力

本研究通過體內實驗進一步驗證circ_0007142對胃癌的作用。在小鼠體內注射轉染了si-NC、si-circ_0007142的癌細胞，結果發(fā)現si-circ_0007142組腫瘤的體積和重量均比si-NC組低（P＜0.05，圖7A～C）。以上實驗數據說明，敲減circ_0007142可以抑制裸小鼠體內成瘤能力。本研究機制圖見圖7D。

圖7 敲減circ_0007142可以抑制裸小鼠體內成瘤能力Fig.7 Knockdown of circ_0007142 inhibits tumorigenesis in nude mice

3 討 論

胃癌的發(fā)病機制復雜，細胞生物學、分子生物學等都參與其中，在高通量測序技術與生物信息學分析高速發(fā)展的今天，對circRNA在疾病中作用的研究已經成為一大熱點。EMT伴隨上皮細胞標志物E-cadherin表達被抑制、間充質表型標志物vimentin與N-cadherin表達被促進，這個過程使細胞具有轉移和侵襲的能力，對于癌癥原發(fā)灶轉移有重要的意義［16］。

CircRNA在胃癌中關于EMT和侵襲轉移的機制已有研究，Jin等［17］經過研究發(fā)現，沉默circ_0101145的表達通過調節(jié)miR-548c-3p/LAMC2軸抑制肝癌EMT。Circ_0007142作為本次的研究對象，曾被發(fā)現在肺腺癌和結直腸癌中均可促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲［18-19］。本研究發(fā)現，circ_0007142在胃癌組織中呈高表達，并且功能實驗顯示，沉默circ_0007142可以抑制癌細胞的集落形成、侵襲和EMT，并且在體內實驗中沉默circ_0007142能抑制腫瘤的生長與EMT。通過之前研究得知，circRNA可以與miRNA競爭式結合，下調miRNA的表達。借助生物學信息網站尋找circ_0007142的下游靶點，進一步選中miR-647，并使用雙熒光素酶報告基因實驗驗證二者的靶向關系。miR-647之前被報道在胃癌耐藥細胞中低表達，miR-647過表達可以降低胃癌細胞的遷移和侵襲能力［20］。Cao 等［21］通過研究認為miR-647在體內和體外均對胃癌的發(fā)展有抑制作用。本研究發(fā)現，miR-647在胃癌組織中低表達，并與circ_0007142的表達呈負相關，沉默circ_0007142對胃癌細胞的作用也可以被miR-647抑制劑部分逆轉。

分析miR-647的下游靶基因發(fā)現，CCR8與miR-647之間具有相互作用。趨化因子是一類信號蛋白，可以誘導細胞定向趨化，參與血細胞發(fā)育、血管形成、細胞凋亡等過程，在腫瘤的發(fā)展、轉移、炎癥感染等過程中都發(fā)揮著重要作用［22］。在對浸潤性膀胱癌的研究中發(fā)現，CCR8水平高與免疫耐受相關，高水平的CCR8預示著預后差，化療效果差［23］。Li等［24］通過研究得出結論，CCR8可以作為預測胃腸道間質瘤的生物標志物，其高表達與惡性程度、不良預后相關。基于此，本研究在生物學網站中檢索到CCR8在胃癌組織中高表達，借助實驗進一步證實CCR8在胃癌組織中高表達。并且發(fā)現，在胃癌組織中，CCR8與miR-647的表達呈負相關，過表達CCR8可以部分抵制上調miR-647帶來的影響。

基于以上分析，本次研究證明circ_0007142可能會通過miR-647/CCR8軸參與胃癌的發(fā)展，為胃癌的預防與治療探索到新的有潛力的診斷標志物。