尖孢鐮刀菌對(duì)人參皂苷的動(dòng)態(tài)響應(yīng)機(jī)制

吉世禹， 孫 茹， 馮 琳， 孫天霞， 閆茹月， 趙 雨， 連文慧

(長春中醫(yī)藥大學(xué) 人參科學(xué)研究院， 長春 130117)

0 引 言

人參(PanaxginsengC.A.Meyer)是五加科人參屬植物的干燥根， 是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材， 人參皂苷(Ginsenoside)是人參的主要活性成分， 具有抗腫瘤、 抗炎、 安神益智、 增強(qiáng)免疫力等藥理活性[1-3]. 人參皂苷大多數(shù)屬于達(dá)瑪烷型皂苷， 根據(jù)C6位上是否有羥基， 可將人參皂苷分為原人參二醇型皂苷(如Rb1，Rb2和Rd)和原人參三醇型皂苷(如Rg1和Re)兩種類型， 由于兩類皂苷結(jié)構(gòu)存在差異， 因此其具有不同的生物活性[4]. 如原人參三醇型皂苷Rg1可刺激促炎細(xì)胞因子釋放， 但原人參二醇型皂苷Rb1對(duì)相同促炎介質(zhì)有顯著的抑制作用[5-6].

圖1 3種人參皂苷的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of three ginsenosides

人參的生長周期長， 易受病菌感染[7]. 人參根腐病是最常見且危害最嚴(yán)重的一種土傳性真菌病害， 其主要病原菌是腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)[8]. 尖孢鐮刀菌是一種世界性分布的病原真菌， 寄主范圍廣泛， 致病能力強(qiáng)， 已成為第三大土傳性病原真菌. 病原菌的致病機(jī)制復(fù)雜， 可產(chǎn)生對(duì)寄主正常生理活動(dòng)有害的代謝產(chǎn)物， 如酶、 毒素、 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等， 誘發(fā)寄主產(chǎn)生病變[9]. 高等植物可產(chǎn)生具有抑菌作用的次生代謝產(chǎn)物， 能夠抑制真菌的孢子萌發(fā)和生長發(fā)育[10]. 皂苷是一類植物次生代謝物， 研究表明， 皂苷具有殺菌活性， 是植物抵御病原真菌侵襲的防御物質(zhì)[11-12]， 能夠?yàn)檠帑満头训种普婢腥咎峁┗瘜W(xué)防御[13].人參皂苷是人參根部的主要次生代謝產(chǎn)物， Nicol等[14]研究表明， 人參皂苷具有抗真菌活性， 莖葉總皂苷可通過改變菌體細(xì)胞膜通透性、 誘導(dǎo)菌體 內(nèi)的蛋白質(zhì)和內(nèi)含物流出， 從而起到抑制腐皮鐮刀菌活性的作用[15]. 目前， 關(guān)于人參皂苷對(duì)尖孢鐮刀菌響應(yīng)變化的研究報(bào)道較少. 為確定人參皂苷的質(zhì)量比是否受尖孢鐮刀菌侵入的影響及人參抗性系統(tǒng)中化學(xué)響應(yīng)的作用， 本文研究人參皂苷Rb1，Re，Rg1(圖1)感染尖孢鐮刀菌后的質(zhì)量比變化， 通過測(cè)定人參皂苷對(duì)尖孢鐮刀菌分生孢子萌發(fā)的影響， 確認(rèn)人參皂苷Rb1可對(duì)尖孢鐮刀菌病原體的攻擊做出化學(xué)響應(yīng).

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

4年生人參(Panaxg.)購于吉林省撫松縣參王植保有限責(zé)任公司; 供試菌種由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)楊利民教授分離并鑒定為尖孢鐮刀菌(Fusariumo.); 乙腈、 甲醇為色譜純?cè)噭?正丁醇等其他試劑為分析純?cè)噭?水為超純水; 人參皂苷Rb1，Rg1，Re標(biāo)準(zhǔn)品均購于上海源葉生物科技有限公司.

LC-2030型高效液相色譜儀(日本島津公司)； EVOS FL Auto型熒光倒置顯微鏡(美國 Life公司)； KQ-700DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)； M28563細(xì)胞計(jì)數(shù)板(日本W(wǎng)atson公司).

1.2 方 法

1.2.1 孢子懸浮液的制備

固體培養(yǎng)基： 稱取37 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基， 加入1 000 mL蒸餾水中， 加熱煮沸溶解， 分裝， 于121 ℃高壓滅菌15 min， 備用.

液體培養(yǎng)基： 稱取35 g馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)培養(yǎng)基， 加入1 000 mL蒸餾水中， 加熱煮沸溶解， 分裝， 于121 ℃高壓滅菌20 min， 備用.

實(shí)驗(yàn)前將菌株轉(zhuǎn)接于PDA平板上活化7 d， 取直徑為5 mm 的菌餅接種在PDB培養(yǎng)基中， 在搖床上28 ℃震蕩培養(yǎng)3～4 d， 用8層紗布過濾， 制成9×106cfu/mL的孢子懸浮液(cfu為菌落數(shù))， 備用.

1.2.2 人參根部的接種

將4年生健康鮮人參根洗凈， 去除支根、 須根和蘆頭， 制成約8 cm長的細(xì)根， 用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡5 min， 無菌水沖洗1次， 將每個(gè)人參根切成3個(gè)連續(xù)的部分： 上部(Part Ⅰ)未經(jīng)處理， 作為空白組； 中部(Part Ⅱ)和下部(Part Ⅲ)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的次氯酸鈉浸泡10 min， 無菌水沖洗3次， 無菌針扎傷， 將中部(Part Ⅱ)浸泡在無菌水中3 min作為對(duì)照組； 下部(Part Ⅲ) 浸泡在病原菌分生孢子懸浮液(9×106cfu/mL)中3 min作為實(shí)驗(yàn)組. 將處理后的人參根段置于培養(yǎng)皿上， 培養(yǎng)皿底部放有濕潤的無菌濾紙(已滿足人參正常發(fā)病程度)， 最后置于25 ℃無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 每部分重復(fù)4次.

為檢測(cè)3種人參皂苷在侵染一段時(shí)間后的質(zhì)量比， 分別在接種72,96,120 h對(duì)不同處理的根部進(jìn)行取樣和拍照， 并將這些根段切成1 cm×1 cm×0.5 cm的小塊， 在45 ℃約干燥3 d， 直至獲得恒定的干質(zhì)量.

1.2.3 人參皂苷的提取

將3組不同處理方法的人參根部研磨成粉末， 過60目篩， 精密稱取0.500 0 g人參粉， 用50 mL水飽和正丁醇提取， 超聲40 min， 過濾， 取25 mL濾液至蒸發(fā)皿中揮發(fā)干燥， 加入體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇水溶液溶解， 定容至5 mL， 過0.22 μm有機(jī)濾膜后， 4 ℃保存， 備用.

1.2.4 高效液相色譜條件

色譜柱Agilent Eclipse Plus C18型(4.6 mm×150 mm， 5 μm)， 流動(dòng)相乙腈(A)和φ(H3PO4)=0.05%(B)， 梯度洗脫： 0～18 min，φ(A)=21.5%； 18～26 min，φ(A)=21.5%～28%； 26～40 min，φ(A)=28%～34%； 40～42 min，φ(A)=34%～21.5%； 42～45 min，φ(A)=21.5%； 流速1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長為203 nm； 進(jìn)樣量10 μL.

1.2.5 尖孢鐮刀菌分生孢子的萌發(fā)

用不同質(zhì)量濃度的人參皂苷Rb1，Rg1，Re溶液處理分生孢子， 測(cè)定不同人參皂苷對(duì)尖孢鐮刀菌分生孢子萌發(fā)的影響. 將3種人參皂苷溶于無菌蒸餾水中， 分別制成質(zhì)量濃度分別為5,20 mg/mL的溶液， 將尖孢鐮刀菌分生孢子懸浮液加入不同質(zhì)量濃度的人參皂苷溶液中， 對(duì)照組用無菌水處理， 25 ℃孵育24 h， 在顯微鏡下計(jì)數(shù)分生孢子的數(shù)量.

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析， 并通過單因素方差分析對(duì)相關(guān)性指標(biāo)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)， 當(dāng)p<0.05時(shí)， 具有顯著性意義， 采用Graphpad Prism 6軟件繪圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 尖孢鐮刀菌的形態(tài)

病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長7 d， 可觀察到白色稀疏的菌絲體， 在顯微鏡下可觀察到許多分生孢子， 分生孢子相對(duì)較寬， 大型分生孢子呈鐮刀形， 孢子兩端稍尖， 長度約5～15 μm， 小型分生孢子呈卵形或腎形， 菌絲細(xì)長， 有隔膜， 如圖2所示.

圖2 尖孢鐮刀菌菌落形態(tài)(A)及其在顯微鏡下的形態(tài)(B)Fig.2 Colony morphology (A) of Fusarium oxysporum and its morphology under microscope (B)

2.2 人參根部感染尖孢鐮刀菌的表觀分析

設(shè)置Part Ⅰ為空白組， Part Ⅱ?yàn)閷?duì)照組， 這兩組處理不同時(shí)間的人參根部表觀狀態(tài)無明顯差別. Part Ⅲ為實(shí)驗(yàn)組， 與空白組和對(duì)照組比較， Part Ⅲ在侵染72 h后人參根表面已有白色菌絲附著， 在侵染96 h后， 人參根部表面有大面積的白色菌絲， 并伴有輕微腐爛， 在侵染120 h后， 人參根部表面全部被白色菌絲包圍， 并伴有嚴(yán)重腐爛現(xiàn)象， 如圖3所示.

2.3 人參皂苷質(zhì)量比的變化

利用HPLC測(cè)定健康人參根中3個(gè)不同部分皂苷的質(zhì)量比， 其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程列于表1. 健康人參的皂苷質(zhì)量比如圖4所示. 由圖4可見， 人參皂苷Rb1，Rg1，Re在3個(gè)連續(xù)的根段中質(zhì)量比基本相同.

圖3 人參根部感染尖孢鐮刀菌的表觀形態(tài)Fig.3 Apparent morphology of ginseng root infected with Fusarium oxysporum

表1 HPLC分析3種人參皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、 回歸系數(shù)和線性范圍

圖4 健康人參根部中3種人參皂苷的質(zhì)量比Fig.4 Mass ratio of three ginsenosides in healthy ginseng roots

人參接種尖孢鐮刀菌后， 其根部不同部分中3種人參皂苷質(zhì)量比隨時(shí)間的變化如圖5所示. 由圖5可見： 接種72 h時(shí)， 尖孢鐮刀菌組的Rg1質(zhì)量比低于空白組但高于對(duì)照組; 接種96 h時(shí)， 尖孢鐮刀菌組的Rg1質(zhì)量比顯著低于空白組和對(duì)照組; 接種120 h時(shí)， 3組間差異不顯著； 接種72 h時(shí)， 尖孢鐮刀菌組的Re質(zhì)量比高于空白組和對(duì)照組; 接種96 h時(shí)， 尖孢鐮刀菌組的Re質(zhì)量比低于空白組和對(duì)照組; 接種120 h時(shí)， 尖孢鐮刀菌組的Re質(zhì)量比顯著高于空白組和對(duì)照組， 尖孢鐮刀菌組處于持續(xù)下降的趨勢(shì)； 接種72，96，120 h時(shí)， 尖孢鐮刀菌的Rb1質(zhì)量比均高于空白組和對(duì)照組， 而接種尖孢鐮刀菌后， 人參根部的Rb1質(zhì)量比顯著增加, 其中接種96～120 h時(shí)， 人參皂苷Rb1的質(zhì)量比持續(xù)增加. 在72,96,120 h這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)， 接種尖孢鐮刀菌組和空白組相比， 人參皂苷Rb1的質(zhì)量比分別增加了6%，5%，24%， 接種尖孢鐮刀菌組和對(duì)照組相比， 人參皂苷Rb1的質(zhì)量比分別增加了19%，11%，33%. 結(jié)果表明， 尖孢鐮刀菌介導(dǎo)的感染對(duì)人參根部Rg1，Re，Rb1質(zhì)量比的影響不同. 接種尖孢鐮刀菌后， 人參皂苷Rg1的質(zhì)量比基本保持不變， Re的質(zhì)量比不斷降低， 而Rb1的質(zhì)量比顯著增加.

圖5 人參根部接種尖孢鐮刀菌后人參皂苷質(zhì)量比的變化Fig.5 Changes of mass ratio of ginsenoside in ginseng roots inoculated with Fusarium oxysporum

2.4 人參皂苷對(duì)孢子萌發(fā)的影響

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 接種尖孢鐮刀菌后， 人參皂苷Rb1的質(zhì)量比顯著增加， 推測(cè)Rb1在調(diào)節(jié)人參防御反應(yīng)中起重要作用. 為驗(yàn)證Rb1的作用， 研究了3種人參皂苷對(duì)尖孢鐮刀菌分生孢子萌發(fā)的影響， 結(jié)果如圖6所示. 由圖6可見： 3種人參皂苷中， 僅Rb1對(duì)尖孢鐮刀菌分生孢子有抑制作用， 其抑制率在低質(zhì)量濃度時(shí)為81%、 高質(zhì)量濃度時(shí)為46%， 可見Rb1質(zhì)量濃度越大， 分生孢子的萌發(fā)率越低， 抑制率越高， 而不同質(zhì)量濃度的Rg1和Re對(duì)尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)幾乎無抑制作用. 因此， Rb1可能是人參根產(chǎn)生的主要抗真菌病原體感染的人參皂苷.

圖6 3種人參皂苷對(duì)尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)率的影響Fig.6 Effect of 3 ginsenosides on conidia germination rate of Fusarium oxysporum

綜上可見， 根腐病菌不僅影響植物根部的生長， 而且對(duì)植物體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)水平也有一定影響[16]. 研究表明， 人參根部接種尖孢鐮刀菌后， 對(duì)人參根部3種人參皂苷Rb1，Rg1，Re的質(zhì)量比具有不同影響： Rb1的質(zhì)量比顯著增加； Rg1的質(zhì)量比基本保持不變； Re的質(zhì)量比不斷降低. Rb1是原人參二醇型皂苷， Rg1和Re是原人參三醇型皂苷， 因此推測(cè)可能是不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其對(duì)病原菌侵染產(chǎn)生了不同響應(yīng). 人參皂苷Rb1的上調(diào)發(fā)生在尖孢鐮刀菌侵染人參根的早期階段， 僅Rb1對(duì)尖孢鐮刀菌分生孢子有明顯抑制作用， 表明Rb1可能是人參根中產(chǎn)生對(duì)尖孢鐮刀菌具有響應(yīng)的抗病化合物.

下面分析人參皂苷結(jié)構(gòu)對(duì)其抑菌活性的影響. 所選擇的3種人參皂苷具有相同的苷元和不同的糖殘基, 人參皂苷Rb1在C3和C20位上均含有糖鏈(圖1)， Rb1顯著抑制了尖孢鐮刀菌分生孢子的萌發(fā). 而Rg1和Re在C3位不含糖鏈， 僅在C20位上含有糖鏈， Rg1和Re對(duì)尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響較小， 可見人參皂苷對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制活性與C3位上是否有糖鏈相關(guān). Rb1在人參根中具有最強(qiáng)的防御功能， Rg1和Re不具有化學(xué)抗性. 本文對(duì)人參的質(zhì)量控制具有積極意義， 為更好地了解寄主與病原菌的相互作用及其對(duì)人參藥用價(jià)值的影響提供了理論依據(jù).