電壓門控鈣離子通道阻斷劑硝苯地平體外殺傷日本血吸蟲成蟲作用研究

王小莉，楊浩宇，邱 禹，崔 潔，阮立慧，李 亮*

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室 安徽省感染與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蚌埠 233030；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院 顯微形態(tài)實(shí)驗(yàn)中心，安徽 蚌埠 233030；3.蚌埠學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，安徽 蚌埠 233030)

血吸蟲病(schistosomiasis)是一種嚴(yán)重危害健康的人獸共患寄生蟲病，感染人數(shù)達(dá)3.95-5.97億，超過(guò)7億人(多數(shù)為兒童)的健康受到該病威脅[1-2]。我國(guó)流行的是日本血吸蟲病，經(jīng)過(guò)70多年的努力，截至2019年底，全國(guó)晚期血吸蟲病人30 170例[3]。目前藥物化療仍是我國(guó)防控血吸蟲病的主要手段[4]，因出色的療效、廣譜的適用性、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，吡喹酮(praziquantel，PZQ)被WHO推薦為抗血吸蟲病的首選藥物[5]。雖然PZQ對(duì)各種類型血吸蟲成蟲階段均有良好的殺傷效果，但對(duì)童蟲階段作用弱[6-7]。此外，隨著長(zhǎng)期大范圍的使用，PZQ治療不敏感以及在實(shí)驗(yàn)室通過(guò)亞致死劑量誘導(dǎo)出耐藥性蟲體屢見(jiàn)報(bào)道[8-10]，因此尋找替代或候選藥物治療血吸蟲病亟待解決。

血吸蟲細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡由多種組分共同調(diào)控，如電壓門控鈣離子通道(voltage-gated calcium channels，VGCC)、配體門控鈣通道、第二信使門控鈣通道、鈣釋放通道等[11-13]。而一些鈣離子通道拮抗劑被證實(shí)具有抗血吸蟲活性[14-15]。根據(jù)PZQ作用后血吸蟲有痙攣性麻痹、皮層損傷等現(xiàn)象，多項(xiàng)研究認(rèn)為PZQ殺傷作用與干擾蟲體內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)相關(guān)[16]，借助RNA干擾技術(shù)，進(jìn)一步揭示VGCC可能是PZQ的作用靶點(diǎn)[17]。既往報(bào)道顯示VGCC阻斷劑硝苯地平對(duì)曼氏血吸蟲[18]、艾美耳球蟲[19]具有抑制作用，但對(duì)于日本血吸蟲具有何種作用尚不清楚。因此，本研究擬利用VGCC阻斷劑硝苯地平，觀察其體外對(duì)日本血吸蟲殺傷作用；通過(guò)硝苯地平和PZQ聯(lián)合，觀察硝苯地平對(duì)PZQ殺傷日本血吸蟲作用的影響，同時(shí)利用掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)觀察蟲體超微變化，進(jìn)一步探討硝苯地平殺傷日本血吸蟲的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和蟲株

BALB/c小鼠，雌性，18-25 g，購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(京)2016-0010]，(22±2)℃常溫環(huán)境飼養(yǎng)。陽(yáng)性釘螺來(lái)自中國(guó)CDC寄生蟲病預(yù)防控制所，蟲株為中國(guó)大陸株。

1.1.2主要試劑與儀器

PZQ片劑(沈陽(yáng)紅旗制藥有限公司)。

硝苯地平(Sigma公司)；青霉素-鏈霉素溶液(碧云天生物有限公司)；DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)；二甲基亞砜(Fluka公司)；叔丁醇、戊二醛、氯化鈉、二水合檸檬酸三鈉(麥克林生化科技有限公司)；

掃描電鏡S4700(Hitachi公司)；倒置顯微鏡(MZ 12.5，Leica公司)。

PZQ片劑、硝苯地平均溶于DMSO中配制成工作液。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物模型

按常規(guī)釘螺逸尾蚴方法獲得日本血吸蟲尾蚴。挑取尾蚴滴于蓋玻片，貼于小鼠濕潤(rùn)的腹部皮膚，尾蚴可經(jīng)皮侵入小鼠體內(nèi)。每只小鼠感染60條尾蚴。

1.2.2成蟲收集

感染28 d后，采用肝門靜脈灌注法，檸檬酸鈉生理鹽水液體(0.85%氯化鈉-1.5%二水合檸檬酸三鈉)灌注，蟲體隨液體沖至80孔/25.4 mm不銹鋼篩網(wǎng)，DMEM培養(yǎng)基沖洗濾網(wǎng)，收集液體。根據(jù)活力評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[19-20]，于倒置顯微鏡下挑取活力正常的雄蟲，每5條/孔蟲體培養(yǎng)于6孔板，加入3 mL 完全DMEM(含10%胎牛血清-1%青霉素/鏈霉素溶液)共培養(yǎng)。

1.2.3硝苯地平對(duì)日本血吸蟲雄蟲的殺傷作用

加入硝苯地平，使其終濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.50 μg/mL和1.0 μg/mL，設(shè)陰性對(duì)照組(加0.1% DMSO)，每組5個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M(不加任何藥物)作為整個(gè)實(shí)驗(yàn)監(jiān)控。加藥后置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，換液，加入完全DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至96 h，于倒置顯微鏡下觀察蟲體活力情況。參照文獻(xiàn)[21]，依據(jù)蟲體運(yùn)動(dòng)度、透明度、顏色等，活力評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0-3分，3分：蟲體呈透明狀、運(yùn)動(dòng)活波、體態(tài)柔和；2分：蟲體呈半透明狀、活動(dòng)差、體態(tài)稍僵硬；1分：蟲體部分呈不透明，僅頭部或尾部輕微活動(dòng)、體態(tài)僵硬；0分：整個(gè)蟲體收縮呈白色，連續(xù)觀察30 s沒(méi)有運(yùn)動(dòng)，定義為“死亡”。統(tǒng)計(jì)每組蟲體活力總分值，計(jì)算每組蟲體活力平均值為Σ(每組蟲體活力總分值) /每組蟲體數(shù)。

1.2.4硝苯地平與PZQ聯(lián)合對(duì)雄蟲的殺傷作用

設(shè)4組，分別為A組(加0.1%DMSO)、B組(14 μmol/L PZQ)、C組(1.0 μg/mL硝苯地平)、D組(1.0 μg/mL硝苯地平+14 μmol/L PZQ)，每組5個(gè)復(fù)孔。D組先加入硝苯地平，孵育2 h后再加入PZQ。置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，換液，加入完全DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至96 h，鏡檢蟲體活力情況。

蟲體活力判斷標(biāo)準(zhǔn)及統(tǒng)計(jì)同上。觀察結(jié)束，各實(shí)驗(yàn)組蟲體拍照，記錄大體形態(tài)。

1.2.5掃描電鏡觀察

培養(yǎng)結(jié)束后收集蟲體，5%戊二醛固定12 h；經(jīng)0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌3次，1%餓酸固定液染色1 h，30%-100%叔丁醇梯度脫水。將蟲體真空干燥，置于掃描電鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 硝苯地平體外對(duì)日本血吸蟲雄蟲的殺傷作用

不同濃度硝苯地平作用下日本血吸蟲雄蟲活力值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=76.06，P<0.05)。與對(duì)照組蟲體活力值(2.96±0.09)比較，0.05、0.10 μg/mL 硝苯地平組蟲體活力值降低，為(2.88±0.18)、(2.84±0.17)，差異(均P>0.05)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)硝苯地平終濃度為0.20、0.50、1.00 μg/mL時(shí)，雄蟲活力值分別為(2.24±0.17)、(1.68±0.18)和(1.56±0.17)，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)(見(jiàn)圖1)。相關(guān)性分析表明，在0.05 - 1.00 μg/mL濃度區(qū)間，蟲體活力值與硝苯地平濃度(r=-0.880，P<0.01)之間呈負(fù)相關(guān)，即體外培養(yǎng)的日本血吸蟲雄蟲活力值隨著硝苯地平濃度升高而降低。與對(duì)照組(加0.1%DMSO)比較，***P<0.001。

圖1 硝苯地平體外對(duì)日本血吸蟲雄蟲的殺傷作用

2.2 硝苯地平與PZQ聯(lián)合對(duì)日本血吸蟲雄蟲的殺傷作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，硝苯地平、PZQ作用下日本血吸蟲雄蟲活力值(F=378.16，P<0.01)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B、C、D組血吸蟲雄蟲活力值分別為：(0.20±0.14)、(1.56±0.17)、(1.32±0.11)，與A組(2.96±0.09)比較，差異(均P<0.01)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C、D組蟲體活力值明顯高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；D組與C組比較，蟲體活力值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖2)。

圖2 硝苯地平和PZQ聯(lián)合體外對(duì)日本血吸蟲雄蟲的殺傷效應(yīng)

圖2中：與對(duì)照組比較，**P<0.01。A對(duì)照組(加0.1%DMSO)；B組(14 μmol/L PZQ)；C組(1.0 μg/mL硝苯地平)；D組(1.0 μg/mL硝苯地平+14 μmol/L PZQ)。

2.3 日本血吸蟲雄蟲的形態(tài)觀察

2.3.1大體形態(tài)變化

在鏡下可見(jiàn)A組雄蟲體態(tài)柔和，伸縮自如，彎曲自然，呈透明狀，借助吸盤吸附在皿底。B組蟲體腫脹，吸盤失去吸附能力，呈白色不透明、無(wú)伸縮運(yùn)動(dòng)，整個(gè)蟲體彎曲或蜷縮呈逗點(diǎn)狀。C組蟲體腫脹，吸盤吸附力下降，運(yùn)動(dòng)緩慢；呈白色半透明狀，尾部向腹部卷曲。D組螺旋狀蟲體的頭部輕微運(yùn)動(dòng)，逐漸恢復(fù)運(yùn)動(dòng)，伸展體部，呈白色半透明狀(見(jiàn)圖3)。

圖3 硝苯地平和PZQ作用后日本血吸蟲雄蟲形態(tài)

圖3中：A組(對(duì)照組，0.1% DMSO)；B組(14 μmol/L PZQ)；C組(1.0 μg/mL硝苯地平)；D組(1.0 μg/mL硝苯地平+14 μmol/L PZQ)。標(biāo)尺為1000 μm。

2.3.2蟲體體表超微結(jié)構(gòu)變化

掃描電鏡觀察可見(jiàn)正常蟲體(A組)體表均勻分布海綿狀結(jié)構(gòu)，由細(xì)胞質(zhì)突出形成的褶嵴和深陷的凹窩構(gòu)成，其上分布有隆起圓凸形感受器；B、C、D組蟲體體表?yè)p傷明顯，體表海綿狀結(jié)構(gòu)的褶嵴和凹窩排列紊亂、融合、變窄或消失，感受器乳突變形、陷沒(méi)或破潰，未見(jiàn)皮層剝落及皮下肌層暴露(見(jiàn)圖4)。此外，B組蟲體皮層褶嵴皺縮而呈裂縫狀，因滲出出現(xiàn)水泡或大面積融合呈腐蝕狀。C組可見(jiàn)褶嵴與相鄰凹窩大面積融合，間插坑狀缺損。D組蟲體皮層因褶嵴皺縮和水腫交錯(cuò)呈裂縫狀，伴有孔狀缺損。

圖4 硝苯地平和PZQ作用后日本血吸蟲雄蟲超微結(jié)構(gòu)

圖4中：A組(對(duì)照組，0.1% DMSO)；B組(14 μmol/L PZQ)；C組(1.0 μg/mL硝苯地平)；D組(1.0 μg/mL硝苯地平+14 μmol/L PZQ)。

3 結(jié)論

在血吸蟲的多項(xiàng)生理活動(dòng)中，VGCC是必不可少的參與者，如細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡、肌肉收縮、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、基因表達(dá)等[22]。VGCC是由多個(gè)亞基構(gòu)成的異源多聚體跨膜蛋白復(fù)合物，包括形成孔狀結(jié)構(gòu)的主要亞基α1和輔助亞基α2、β、δ、γ。在曼氏血吸蟲cDNA序列中，其中1個(gè)α1亞基(SmCav1)與脊椎動(dòng)物的高壓激活鈣離子通道(high voltage-activated，HVA)L-型的α1亞基相似達(dá)50%-55%[23]。硝苯地平是一種高效的L型VGCC拮抗劑，可通過(guò)變構(gòu)結(jié)合在α1孔區(qū)結(jié)構(gòu)域的不同位置來(lái)調(diào)節(jié)通道[24]?；谙醣降仄交钚浴⒀x與脊椎動(dòng)物VGCC的相似性，因此本研究以硝苯地平作為VGCC拮抗劑。結(jié)果顯示隨著硝苯地平濃度升高(≥0.20 μg/mL)，雄蟲活力值明顯低于對(duì)照組，以1.0 μg/mL硝苯地平作用下蟲體活力值最低，表明一定濃度的硝苯地平體外對(duì)日本血吸蟲雄蟲具有殺傷作用。這與Silva-Moraes等采用硝苯地平可殺傷曼氏血吸蟲童蟲和成蟲的研究結(jié)果[18]可以相互印證。結(jié)合鏡下觀察1.0 μg/mL硝苯地平組蟲體痙攣、卷曲現(xiàn)象，考慮因硝苯地平阻斷了蟲體VGCC，消除了細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子存儲(chǔ)釋放被耗盡而致蟲體活動(dòng)能力下降或死亡。

日本血吸蟲體最外層結(jié)構(gòu)為體壁，體壁皮層具有重要的保護(hù)作用，皮層結(jié)構(gòu)的不完整可使蟲體因滲透壓力、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換等失衡而死亡，因而皮層變化也往往被用來(lái)評(píng)估藥物的抗血吸蟲活性[25-26]。研究證實(shí)PZQ的敏感位點(diǎn)是在血吸蟲的皮層和肌纖維膜，在本研究的超微變化中PZQ作用后蟲體皮層損傷明顯，與既往報(bào)道相一致[17]。硝苯地平作用后蟲體可見(jiàn)皮層的海綿狀結(jié)構(gòu)紊亂、融合、缺損，這些變化表明蟲體細(xì)胞膜對(duì)硝苯地平敏感，皮層的損傷會(huì)破壞蟲體的防御系統(tǒng)，表面暴露的抗原使其容易被宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別而被殺傷[27]。經(jīng)過(guò)硝苯地平預(yù)孵育后PZQ作用下蟲體活力值雖有所恢復(fù)，但蟲體皮層結(jié)構(gòu)仍可見(jiàn)損傷變化，提示了硝苯地平和PZQ 致皮層的損傷效應(yīng)并非藥物直接作用，可能是誘導(dǎo)蟲體細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致蟲體痙攣性收縮的繼發(fā)效應(yīng)，而VGCC參與了這種繼發(fā)效應(yīng)，因而PZQ殺傷血吸蟲作用可被VGCC阻斷劑硝苯地平所拮抗。

世界范圍內(nèi)PZQ 頻繁使用誘導(dǎo)血吸蟲產(chǎn)生抗藥性的問(wèn)題已引起了廣泛關(guān)注，而PZQ殺傷作用機(jī)制的不明確限制了PZQ衍生物類新藥的研發(fā)。研究顯示多種基于藥效基團(tuán)設(shè)計(jì)新藥或針對(duì)高通量篩選出的靶點(diǎn)藥物尚無(wú)法比擬PZQ殺傷效果[28-30]，因此，尋找抗血吸蟲候選藥物或新靶點(diǎn)仍道路漫長(zhǎng)。本研究表明硝苯地平在體外對(duì)日本血吸蟲成蟲具有一定殺傷作用，其與PZQ聯(lián)合用藥可降低PZQ殺傷日本血吸蟲效果，證實(shí)了VGCC參與了PZQ抗血吸蟲作用，支持了發(fā)展VGCC作為抗血吸蟲藥物靶點(diǎn)的潛在前景[31]。如何通過(guò)調(diào)整體內(nèi)用藥劑量、時(shí)間、病程階段等給藥方案，在利用硝苯地平提高殺蟲效果的同時(shí)，降低其對(duì)PZQ的抑制影響，將是應(yīng)用鈣離子通道阻斷劑治療血吸蟲病研究的一個(gè)重要問(wèn)題，有待于進(jìn)一步探索。