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    上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)研究

    2021-09-19 01:52:00權(quán)明明陳珍珍王毅超
    浙江醫(yī)學(xué) 2021年15期
    關(guān)鍵詞:結(jié)節(jié)性乳頭狀免疫組化

    權(quán)明明 陳珍珍 王毅超

    甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,它常見的病理類型有4種,分別為乳頭狀癌、濾泡狀癌、髓樣癌、未分化癌,其中甲狀腺乳頭狀癌是最常見的病理類型[1]。雖然甲狀腺乳頭狀癌是預(yù)后良好的惡性腫瘤,但臨床上仍有部分甲狀腺乳頭狀癌患者預(yù)后欠佳[2]。上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2(epithelial cell transforming 2,ECT2)基因是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列基因的一種,已經(jīng)證實(shí)其是一種原癌基因,在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)[3-4]。臨床上對于ECT2基因在甲狀腺癌中的表達(dá)研究報道不多?;诖?,本研究分析ECT2在甲狀腺乳頭狀癌的表達(dá)情況,以期為甲狀腺乳頭狀癌早期診斷提供分子生物學(xué)依據(jù),現(xiàn)報道如下。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 組織樣本 甲狀腺乳頭狀癌組織及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織均取自2020年5至12月于臺州市中心醫(yī)院手術(shù)切除的標(biāo)本,且所有標(biāo)本獲取均經(jīng)患者知情同意,患者術(shù)前均未行化療、放療、內(nèi)分泌治療,病理結(jié)果均經(jīng)2位病理科醫(yī)生判讀。甲狀腺乳頭狀癌組織標(biāo)本35例,患者男 5 例,女 30 例,年齡 32~57(44.5±1.92)歲;結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織標(biāo)本32例,患者男7例,女25例,年齡31~67(48.7±1.37)歲。兩種組織標(biāo)本患者性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。術(shù)后所有標(biāo)本一半立即存入-80℃冰箱,一半立即置于甲醛溶液中固定,取材體積均約5 mm×5 mm×5 mm。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批件號:2021L02-16)。

    1.1.2 主要試劑和儀器 ECT2基因引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成,Trizol RNA提取試劑購自美國Invitrogen 公司(批號:15596026);Real Maste rMix(SYBR Green)試劑盒購自日本 TakaRa公司(批號:RR066A);ECT2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司(批號:1627591),DAB顯色試劑盒購自美國BD公司(批號:550880),PCR 儀為美國 ABI公司產(chǎn)品(型號:Stepone),垂直電泳槽及轉(zhuǎn)膜槽為北京六一儀器廠產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 ECT2 mRNA表達(dá)水平檢測 采用RT-PCR法。設(shè)計ECT2基因引物,取存于-80℃冰箱中的甲狀腺乳頭狀癌組織及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織,剪碎,每例標(biāo)本重約 80 mg,采用 Trizol提取細(xì)胞中總RNA,用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度,要求A260/A280=1.8~2.0,并在1%瓊脂糖凝膠電泳中顯示出清晰的28 S和18 S兩條rRNA帶,證明提取的RNA完整。cDNA合成反應(yīng)體系:取 2 g RNA ,加 2 μl×RT mix(終濃度為 1×),2 μl dNTP混合液(終濃度為 0.25 mmol/L/dNTP),2 μl Oligo-dT15(終濃度為 1 μmol/L),1 μl逆轉(zhuǎn)錄酶,加 RNase Free ddH2O 至終體積20 μl,于 37℃孵育 60 min。采用SYBR Green熒光染料,參照試劑盒說明完成RT-PCR,反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃ 1.5 min,95℃ 15 s、65℃30 s、68 ℃ 30 s 40個循環(huán);最后 95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95℃15 s收集熒光信號,進(jìn)行熔解曲線分析,以結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織為參照,反應(yīng)結(jié)束由系統(tǒng)自動計算相對定量結(jié)果。

    1.2.2 ECT2蛋白表達(dá)定性檢測 采用免疫組化法。分別取甲醛溶液浸泡的甲狀腺乳頭狀癌組織及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織,置于恒溫烤箱中60℃烘烤20 min,將組織玻片依次放入二甲苯溶液浸泡15 min脫蠟,再經(jīng)不同梯度乙醇(100%乙醇,95%乙醇,80%乙醇,70%乙醇)和ddH2O各5 min水化。將合適的抗原修復(fù)緩沖液(枸櫞酸鈉緩沖液pH 6.0)加入高壓鍋內(nèi)煮沸,將組織切片置于抗原修復(fù)沸水緩沖液中進(jìn)行高壓修復(fù)抗原,電爐加熱10 min后去除熱源,打開高壓鍋鍋蓋,利用涼水冷卻10 min,冷卻完成后PBS洗滌2遍,各5 min。因組織切片中可能含有大量的具有活性的過氧化物酶,本研究選擇滴加3%的雙氧水室溫靜置10 min以去除內(nèi)源性過氧化物酶,以防對組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生不良影響,反應(yīng)結(jié)束后PBS洗滌2次各5 min。取出并擦干組織切片,滴加10%的山羊血清封閉液在玻片上,室溫封閉0.5~1 h,以減少非特異性結(jié)合造成的染色。結(jié)束后PBS洗滌2遍,各5 min。一抗孵育:取出玻片并擦去多余液體,滴加實(shí)驗(yàn)所需的ECT2抗體(1∶200),置于濕盒中4℃冰箱孵育過夜。第2天取用前需先甩干,并用PBS充分洗滌3次,每次5 min。二抗孵育:洗凈后每片滴加50 μl辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體,在室溫孵育30~60 min,PBS洗滌,每次5 min,重復(fù)共3次。DAB顯色:滴加現(xiàn)配的DAB顯色劑,于顯微鏡下掌握染色程度,可用自來水沖洗終止反應(yīng)。復(fù)染:蘇木精復(fù)染1~2 min,并用PBS洗凈。脫水透明:依次放入不同梯度乙醇各5 min脫水,最后放置于二甲苯溶液各5 min進(jìn)行透明處理。封片:用滴管吸取中性樹膠進(jìn)行封片操作,待玻片樹膠凝固后,顯微鏡觀察結(jié)果并拍照分析目的蛋白表達(dá)情況。免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):以陽性細(xì)胞所占視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的百分比和細(xì)胞著色強(qiáng)度進(jìn)行計分,根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比按<5%、5%~<25%、25%~<50%、50%~<75%和≥75%依次計分為 0、1、2、3和 4分,所記得分≤1分為陰性表達(dá),≥2分為陽性表達(dá)。

    1.2.3 ECT2蛋白表達(dá)定量檢測 采用Western blot法。分別取-80℃冰箱中的甲狀腺乳頭狀癌組織及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織,每例約80 mg,加入組織蛋白提取液,冰上研磨,蛋白提取按試劑說明書進(jìn)行,吸取上清液。每例標(biāo)本取20 μl用BCA法測蛋白濃度,根據(jù)蛋白質(zhì)曲線計算電泳所需蛋白,配置10%濃縮膠和5%的分離膠,上樣量每孔為 50 μg,標(biāo)準(zhǔn)蛋白 Marker為 5 μl,80~120 V電泳,恒壓10 V 1 h轉(zhuǎn)膜至硝基纖維膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h,加入一抗2 ml(ECT2抗體濃度1∶1 000)4℃冰箱過夜,加入二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體,濃度為1∶5 000)室溫靜置 1.5 h,ECL發(fā)光液滴加。暗室曝光顯影定影,計算機(jī)軟件分析蛋白表達(dá)水平。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件,每個實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。計量資料以表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 甲狀腺乳頭狀癌組織與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織ECT2 mRNA表達(dá)水平比較 相對于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織,ECT2 mRNA在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)水平為2.4327±0.0127,兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。即甲狀腺乳頭狀癌組織ECT2 mRNA表達(dá)上調(diào)。

    2.2 甲狀腺乳頭狀癌組織與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織ECT2蛋白表達(dá)陽性率比較 甲狀腺乳頭狀癌組織與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織ECT2蛋白表達(dá)情況見圖1(插頁)。甲狀腺乳頭狀癌組織與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織ECT2蛋白表達(dá)陽性率分別為 57.1%(20/35)、6.3%(2/32),甲狀腺乳頭狀癌組織表達(dá)陽性率明顯高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    圖1 甲狀腺乳頭狀癌組織與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2(ECT2)蛋白表達(dá)定性觀察(免疫組化染色,×40)

    2.3 甲狀腺乳頭狀癌組織與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織ECT2蛋白表達(dá)水平比較 甲狀腺乳頭狀癌組織與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織ECT2蛋白表達(dá)水平分別為1.6542±0.0159、0.4826±0.0513,兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。即相對于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織,甲狀腺乳頭狀癌組織ECT2蛋白表達(dá)水平上調(diào),見圖2。

    圖2 甲狀腺乳頭狀癌組織與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2(ECT2)蛋白表達(dá)電泳圖比較(1、2:甲狀腺乳頭狀癌組織;3、5:結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織;4:內(nèi)參蛋白)

    3 討論

    近年來,甲狀腺癌發(fā)病率逐年提高,尤其是甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病率日益增高,甲狀腺癌發(fā)病率約占惡性腫瘤發(fā)病率的1%,發(fā)達(dá)國家高于發(fā)展中國家[5-7]。甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病機(jī)制尚不明確,可能與癌基因突變、碘劑量、電離輻射、遺傳等因素有關(guān),并且甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病與多個基因相關(guān)。

    ECT2基因是一種鳥苷酸交換因子,研究證實(shí)其與多種惡性腫瘤發(fā)病相關(guān),在人類染色體定位于3q26,進(jìn)化上高度保守,已經(jīng)被確定為原癌基因。ECT基因N端有兩個同源結(jié)構(gòu)域XCCR1和Clb6,在細(xì)胞周期調(diào)控及免疫應(yīng)答上發(fā)揮作用,通過對細(xì)胞周期的調(diào)控,可以動態(tài)控制腫瘤的生長[8-11]。ECT2基因在惡性腫瘤發(fā)展中起重要作用,在一項對肺癌的研究中,高表達(dá)的ECT2與肺癌轉(zhuǎn)移的晚期和更深的腫瘤侵襲相關(guān)[10]。此外,ECT2高表達(dá)的肺癌患者總生存期明顯短于ECT2低表達(dá)的肺癌患者,Cox回歸分析顯示,ECT2表達(dá)是總生存期的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)[12]。在胃癌中也有類似的發(fā)現(xiàn),ECT2在胃癌中表達(dá)量明顯高于對照組,高表達(dá)ECT2的胃癌,其增殖能力及侵襲能力也逐步增強(qiáng),并且這種上調(diào)與腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)[9]。在胰腺癌組織中,與對照組相比ECT2蛋白同樣高表達(dá),ECT2的表達(dá)量與胰腺癌的惡性程度、病例分期密切相關(guān),數(shù)據(jù)分析表明ECT2基因是胰腺癌的獨(dú)立預(yù)后因子[13]。在一項關(guān)于乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)采用免疫組化、細(xì)胞遷移、異種移植方法檢測ECT2在乳腺癌中的表達(dá)情況,ECT2在物理上與泛素特異性蛋白酶USP7相互作用,并在功能上促進(jìn)USP7分子間自結(jié)合,支持將ECT2/USP7作為乳腺癌干預(yù)的潛在靶點(diǎn)[14]。而在另外一項研究中,采用構(gòu)建慢病毒ECT2過表達(dá)和干擾質(zhì)粒用于體外檢測。采用CCK-8等方法評價ECT2表達(dá)對三陰性乳腺癌細(xì)胞系的影響,ECT2是乳腺癌細(xì)胞生長的主要驅(qū)動因子,在調(diào)節(jié)三陰性乳腺癌生長中起著重要作用。PTX治療在沉默ECT2后顯著改善療效。這一發(fā)現(xiàn)提示,抑制ECT2的表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌治療的新方案,并為開發(fā)新的靶向藥物替代紫杉醇治療乳腺癌提供理論依據(jù)[15]。同樣一項關(guān)于乳腺癌的研究中證實(shí)ECT2是乳腺癌不良預(yù)后的因子[16-17]。關(guān)于一項肝細(xì)胞癌的研究中,ECT2高表達(dá)被發(fā)現(xiàn)是肝細(xì)胞肝癌的獨(dú)立預(yù)后危險因素,發(fā)現(xiàn)ECT2過表達(dá)增加了肝癌細(xì)胞的遷移和增殖,ECT2可能通過增強(qiáng)有氧糖酵解和抑制免疫細(xì)胞功能來促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞的極化。ECT2可作為肝細(xì)胞肝癌的候選診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物[18]。

    本研究結(jié)果表明ECT2在甲狀腺乳頭狀癌組織及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織均表達(dá),結(jié)果采用相對定量方法計算,ECT2基因在甲狀腺乳頭狀癌組織相對于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織的表達(dá)量為2.4327±0.0127,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫組化法檢測結(jié)果顯示,在甲狀腺乳頭狀癌組織表達(dá)陽性率明顯高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織。這結(jié)果提示,ECT2在甲狀腺乳頭狀癌高表達(dá),其在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展中起癌基因作用。關(guān)于ECT2基因研究,已經(jīng)證實(shí)在多種惡性腫瘤中高表達(dá),其具體高表達(dá)的機(jī)制尚無法解釋。有研究表明ECT2基因在腦膠質(zhì)瘤中是通過泛素化發(fā)揮作用[19],而ECT2基因作為癌基因在甲狀腺乳頭狀癌中如何發(fā)揮作用,是否與泛素化有關(guān),值得進(jìn)一步研究。也有研究證實(shí)ECT2基因在雌激素受體陽性乳腺癌及非小細(xì)胞肺癌中均是預(yù)后不良的獨(dú)立因子[20-21]。筆者團(tuán)隊擬下一步在細(xì)胞水平、動物水平進(jìn)一步使用siRNA進(jìn)行調(diào)控,以期進(jìn)一步研究ECT2基因發(fā)揮癌基因的機(jī)制,為甲狀腺乳頭狀癌的早期診斷、早期干預(yù)抑或腫瘤標(biāo)志物提供客觀的分子生物學(xué)依據(jù)。

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