基于網絡藥理學探討秦七風濕方治療類風濕性關節(jié)炎的作用機制

姚卓汝 劉紅波 唐志書 宋忠興 阮凱華 徐思寧 于金高 劉世軍

摘要 目的：基于網絡藥理學探討秦七風濕方（QQFSF）治療類風濕性關節(jié)炎（RA）的物質基礎及其作用機制。方法：通過中醫(yī)百科全書數據庫（ETCM）檢索QQFSF中珠子參、秦艽、山茱萸3味中藥的成分和靶點;從NCBI、Geencards數據庫中檢索RA的相關靶點，將QQFSF治療RA的靶點通過蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡分析及DAVID進行功能通路富集分析，預測其作用機制。運用Cyoscape 3.7.2軟件構建“中藥-成分-靶點-通路”網絡，經拓撲學分析得到核心成分和靶點。結果：從QQFSF篩選出成分122個，其中有靶點的成分84個，共篩選到靶點420個。檢索得到RA的靶點1 225個。經映射分析，獲得成分與疾病的共同靶點72個。通過對網絡進行拓撲分析，得到熊果酸、齊墩果酸等核心成分及ABCB1、ABCC1、PIK3CG等核心靶點。經DAVID（P<0.05）富集分析，得到62條信號通路。最后通過分子對接技術對核心成分及靶點進行驗證。結論：QQFSF治療RA的主要成分是熊果酸、齊墩果酸、棕櫚酸，靶點主要涉及ABCG2、ABCB1、PIK3CG等，并通過甲狀腺激素信號通路、胰島素抵抗、核因子κB信號通路等達到治療RA的作用。

關鍵詞 秦七風濕方;類風濕性關節(jié)炎;網絡藥理學;分子對接;作用機制

Mechanism of Qinqi Fengshi Formula for the Treatment of Rheumatoid Arthritis by Network Pharmacology

YAO Zhuoru1，2，LIU Hongbo1，2，TANG Zhishu1，2，SONG Zhongxing1，2，RUAN Kaihua1，2，XU Sining1，2，YU Jingao1，2，LIU Shijun1，2

（1 Shaanxi University of Chinese Medicine/Shaanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization，Xianyang 712083，China; 2 State Key Laboratory of Research and Development of Characteristic Resources of Qin Medicine（Cultivation）/Shaanxi Provincial Innovative Medicine Research Center，Xianyang 712083，China）

Abstract Objective：To explore the material basis and mechanism of Qinqi Fengshi Formula（QQFSF） in the treatment of rheumatoid arthritis（RA） based on network pharmacology.Methods：ETCM databases was used to search the components and targets of 3 Chinese medicinals，namely，Panacis Majoris rhizome，Gentianae Macrophyllae Radix，and Corni Fructus in QQFSF.The related targets of RA were retrieved from NCBI and Geencards databases.The target of QQFSF in the treatment of RA was analyzed by PPI network analysis and DAVID for functional pathway enrichment analysis to predict its mechanism of action.The “Chinese medicine-component-target-pathway” network was constructed by Cytoscape 3.7.2 software.Through the topology analysis，the core components and targets were obtained.Results：A total of 122 components in QQFSF were screened，among which 84 components with targets were selected，and 420 targets were screened.A total of 1 225 targets of RA were retrieved.Through mapping analysis，72 common targets of components and diseases were obtained.A total of 1 225 RA targets were retrieved.After mapping analysis，72 common targets of ingredients and diseases were obtained.Through topological analysis of the network，core components such as ursolic acid and oleanolic acid and core components and ABCB1，ABCC1 and PIK3CG and other targets were obtained（P<0.05）.After DAVID（P<0.05） enrichment analysis，62 signal pathways were obtained.Finally，the core components and targets were verified by molecular docking technology.Conclusion：The main therapeutic components of QQFSF for RA are ursolic acid，olenolic acid and palmitic acid.The targets mainly involve ABCG2，ABCB1，PIK3CG，etc.，and its therapeutic effect is achieved through thyroid hormone signaling pathway，insulin resistance and NF-κB signaling pathway etc.for the treatment of RA.

Keywords Qinqi Fengshi Formula; Rheumatoid arthritis; Network pharmacology; Molecular docking; Action mechanism

中圖分類號：R285.5;R289.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.16.005

類風濕性關節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種以關節(jié)滑膜炎為特征的慢性自身免疫性疾病[1]。目前臨床治療RA以化學藥物為主，常用藥物有非甾體抗炎藥（NSAIDs）、水楊酸類藥物、糖皮質激素及免疫制劑等[2-4]?；瘜W藥物治療RA的短期療效較為顯著，但其作用靶點單一，對疾病的整體調控有限;同時長期使用往往會產生胃腸道、肝臟、腎等組織的諸多不良反應[5-6]。近年來，中藥治療RA的研究較多[7-9]。相比于化學藥物，中藥多成分、多靶點、多通路的整體治療特點使其在RA治療方法具有獨特的優(yōu)勢。

組方來源于陜西太白“七”藥的秦七風濕方（QQFSF）由珠子參、秦艽、山茱萸3味中藥組成，是治療RA的臨床經驗方，具有散寒除濕、益氣養(yǎng)陰、祛風止痛等功效。方中珠子參益氣養(yǎng)陰、通痹止痛，為君藥;秦艽舒筋活絡，為臣藥;山茱萸協同君臣之味，逐濕痹痛、補益肝腎，為佐使藥。本課題組前期已對QQFSF的物質成分、藥理藥效等進行了相關研究，結果表明QQFSF具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛等功效[10-13]。目前QQFSF治療RA的物質基礎及其作用機制尚不甚明確，影響了其臨床應用及相關新藥的研發(fā)。

基于系統(tǒng)生物學理論的網絡藥理學，其系統(tǒng)性、多方位的分析特點與中醫(yī)藥的整體觀相吻合，為揭示中藥復雜的作用機制提供了一種強有力的工具[14]。我們采用網絡藥理學方法，從分子水平預測分析QQFSF治療RA的作用機制，以期為QQFSF的臨床應用及其新藥研發(fā)提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 QQFSF成分及靶點收集 通過中醫(yī)百科全書數據庫（ETCM）[15]（http：//www.nrc.ac.cn：9090/ETCM/）收集QQFSF中珠子參、秦艽、山茱萸3味中藥所含有的成分及其靶點，ETCM中靶點的可靠性分值≥0.8，將靶點統(tǒng)一在Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org）進行規(guī)范。

1.2 RA靶點收集 以“Rheumatoid arthritis”為檢索詞在人類疾病相關數據庫Geencards[16]（https：//www.genecards.org/）、NCBI[17]（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中收集與RA相關的靶點。

1.3 QQFSF治療RA的成分及靶點 將收集的QQFSF成分靶點與RA靶點進行映射，得到共同靶點以及共同靶點對應的成分，即為QQFSF治療RA的成分及靶點。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建與分析 通過STRING version 11.0（https：//string-db.org/）數據庫[18]對QQFSF治療RA的靶點構建蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）網絡模型，將生物種類設定為“Homo sapiens”，最小相互作用閾值設定為“medium confidence”≥0.400，其余參數為默認值，將結果以“TSV”格式導出。通過Cytoscape 3.7.2[19]中的MCODE插件對PPI網絡進行聚類分析，進一步篩選核心網絡并對其參與的生物過程進行注釋。

1.5 功能富集分析 將QQFSF治療RA的靶點導入Cytoscape插件ClueGO及DAVID 6.8[20]（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）數據庫，設定閾值<0.05，進行基因本體（Gene Ontology，GO）生物學過程富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路富集分析，通過2個數據比較富集結果的可靠性。

1.6 QQFSF治療RA的“中藥-成分-靶點-通路”網絡構建 通過Cytoscape 3.7.2軟件構建QQFSF治療RA的“中藥-成分-靶點-通路”網絡，利用Cytoscape內置的Network Analyzer工具對網絡進行拓撲學分析，并通過連接度（Degree）等參數判斷QQFSF治療RA的核心成分及核心靶點。

1.7 分子對接驗證 為了驗證預測的可靠性，通過Pubchem數據庫下載核心成分的結構，并通過PyMOL軟件保存為“.pdb”格式，通過PDB數據庫下載排名前5的核心靶點結構，通過PyMOL軟件去掉水及其自身配體。將成分及靶點結構通過AutoDock軟件進行加氫，計算電荷處理后保存為“.pdbqt”格式，設置Grid Box坐標及盒子大小，使用AutoDock軟件進行分子對接，結合能<0且能量最低的結構為最優(yōu)結構，保存結果。通過Open Babel GUI軟件將對接結果的“.pdbqt”格式轉化為“.pdb”格式，最后使用PyMOL軟件對圖像進行處理分析。

2 結果

2.1 QQFSF成分收集 通過ETCM數據庫，共收集到122個成分，其中歸屬于珠子參含有的成分53個，秦艽含有的成分14個，山茱萸含有的成分56個。見表1。

2.2 QQFSF靶點收集 通過ETCM數據庫查詢到含有可靠性分值≥0.8靶點的成分共84個，其中歸屬于珠子參含有的成分52個，秦艽含有的成分6個，山茱萸含有的成分26個，共收集到420個靶點。

2.3 RA靶點收集 通過NCBI、Geencards（Score>20.00）數據庫收集到RA的靶點分別為1 192、242個，刪除重復值，共得到靶點1 225個。

2.4 QQFSF治療RA的成分及靶點 通過將QQFSF的靶點與RA的靶點進行映射，得到共同靶點72個，對應的成分76個。見表2。共同靶點韋恩圖見圖1。

2.5 PPI網絡及分析 將72個共同靶點通過STRING數據庫進行分析，得到PPI網絡。見圖2。PPI網絡中存在一些密度較高的區(qū)域，通常也被認為是具有生物學意義的集合[21]。為了進一步分析QQFSF治療RA的作用機制，通過Cytoscape 3.7.2中的MCODE插件對PPI網絡進行聚類分析，得到核心功能模塊。見圖3。對3個模塊分別進行GO功能分析，保留最佳評分的生物功能及注釋。見表3。

2.6 富集分析 通過DAVID 6.8數據庫對72個共同靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路分析，共得到GO條目198個（P<0.05），其中生物過程（BP）條目124個，細胞成分（CC）條目27個，分子功能（MF）條目47個;3個功能前10個條目見圖4。KEGG通路富集分析得到62條信號通路（含疾?。?。GO富集主要集中在生物過程上，參與凋亡過程的負調控、炎癥反應、固有免疫應答、一氧化氮生物合成過程的正調控、藥物反應、外源代謝過程等;細胞靶點主要位于蛋白質復合物、胞外體、細胞外間隙、內質網膜等處，具有酶、類固醇、轉錄因子、ATP及染色質結合、ATP酶活性與物質跨膜運動等分子功能。富集的KEGG通路（含疾病）主要涉及甲狀腺激素信號通路、胰島素抵抗、癌癥通路、核因子κB信號通路、催乳激素信號通路、前列腺癌等。為了驗證DAVID富集結果的可靠性，將72個共同靶點導入Cytoscape中ClueGO插件進行分析，結果顯示，2個數據庫通路富集結果基本一致，且富集到類風濕性關節(jié)炎疾病的靶點均為ITGAL、TNFSF13B、TLR4、ITGB2，按P值排序，前10條通路分別見圖5（a）、5（b），圖左側代表通路名稱，氣泡顏色由紅到綠代表P值從小到大，橫坐標代表該通路涉及的靶點占總靶點的比率。

2.7 構建QQFSF治療RA的“中藥-成分-靶點-通路”綜合網絡 結合以上分析，將QQFSF治療RA的中藥、成分、靶點、通路導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建“中藥-成分-靶點-通路”網絡，對網絡拓撲分析結果見圖6。圖中菱形代表中藥，正八邊形形代表成分，“V”形代表靶點，墨綠色“V”形代表珠子參和山茱萸共有靶點，紅色“V”形代表3味中藥的共有靶點。方形代表通路，各節(jié)點大小及顏色深淺代表度值大小。排名前10的成分是Dammar-20（22）Z，24-Di-Ene-3Β，6Α，12Β-Triol、Dammar-20（22）E，24-Di-Ene-3Β，6Α，12Β-Triol、Ursolic Acid（熊果酸）、Gypnoside V_qt、Oleanic acid（齊墩果酸）、Palmitic Acid（棕櫚酸）、Pseudoginsenoside Rt1（假人參皂苷RT1）、Oleanic Acid-28-O-Β-D-Glucopyranoside、6-Hydroxystigmast-4-En-3-One、4，6-Cholestadien-3-One，對應的度值分別為20、20、17、17、17、16、13、13、11、11;排名前10的靶點是ABCG2、ABCB1、PIK3CG、ABCC1、AKT1、ATP1A1、VDR、PPP1CC、SLCO1C1、NFKB1，對應的度值分別為60、56、45、44、44、42、41、38、37、35。它們在QQFSF治療RA的過程中發(fā)揮著重要的作用，可推測這些成分及靶點為核心成分及核心靶點。且該網絡充分體現出QQFSF通過多成分、多靶點、多通路治療RA。

2.8 分子對接結果 將QQFSF治療RA連接度大于中位數（Degree>8）的成分（沒有結構的除外）與前5個核心靶點進行分子對接，配體和受體結合能越低，結合的越穩(wěn)定，分子對接部分模式見圖7。分子對接結果顯示，核心靶點ABCB1、ABCC1、ABCG2、AKT1、PIK3CG與成分有較好的結合力，對接資料見表4。

3 討論

通過采用網絡藥理學對QQFSF治療RA的作用機制進行了相關分析，結果發(fā)現：QQFSF中含有的竹節(jié)參皂苷Iva、齊墩果酸、龍膽苦苷、秦艽堿甲、莫諾苷、馬錢苷、熊果酸等成分通過作用于NFKB1、ABCB1、AR等核心靶點，經介導調節(jié)甲狀腺激素、核因子κB、胰島素抵抗、mTOR、花生四烯酸代謝、TNF等相關信號通路而發(fā)揮治療RA作用。分析結果初步揭示了QQFSF治療RA的作用機制，同時亦印證了中藥多成分、多靶點、多通路治療疾病的特色與優(yōu)勢。

基于中藥方劑的配伍原則，珠子參為QQFSF中的君藥，在處方中發(fā)揮主要治療作用。通過網絡藥理學分析發(fā)現，在QQFSF治療RA的“中藥-成分-靶點-通路”網絡中，珠子參涉及最多的核心成分、靶點與通路，其核心成分多為皂苷類成分。此分析結果不僅印證了珠子參君藥的作用，而且與文獻中報道的珠子參皂苷類成分抗炎、抗腫瘤、增強機體免疫力等功效相吻合[22-24]。

珠子參中含有的竹節(jié)參皂苷Iva可通過升高IκB-α和p65總蛋白的表達抑制磷酸化蛋白p-p38、p-JNK、p-ERK以及p-STAT1的表達，進而抑制核因子κB、MAPK、STAT1等信號通路而發(fā)揮抗炎作用[25];人參皂苷Ro可通過抑制核因子κB通路而產生抗RA作用[26];齊墩果酸具有確切的促進淋巴細胞增殖作用，從而調節(jié)機體的免疫系統(tǒng)，且可抑制花生四烯酸的轉化，從而抑制炎癥的形成[27]。秦艽中含有的龍膽苦苷可通過抑制核因子κB通路中p65的核轉位而發(fā)揮抗RA作用[28]。山茱萸中含有的環(huán)烯醚萜苷如馬錢苷、莫諾苷等，可通過調節(jié)TLR4/核因子κB和JAK/STAT3信號通路抑制炎癥[29-30]。

核因子κB信號通路在細胞炎癥反應及免疫應答等過程中起關鍵性作用，機體受到外界刺激時，核因子κB/IκBa復合物中IκBa被激活磷酸化后降解，核因子κB被釋放活化后進入細胞核，通過p50亞單位與靶基因的eB反應元件結合，激活靶基因的表達，從而產生免疫、炎癥等細胞反應[31]。QQFSF可能通過抑制IκBa磷酸化、阻斷核因子κB核定位及與DNA的結合或抑制靶基因表達來治療RA。PTGS1、PTGS2等靶點參與花生四烯酸的代謝，花生四烯酸經環(huán)氧合酶途徑代謝，首先通過環(huán)合形成不穩(wěn)定的環(huán)內過氧化物PGG2和PGH2，在巨噬細胞、嗜中性粒細胞及淋巴細胞中，PGH2經谷胱甘肽-S-轉移酶作用生成PGE2，PGE2在炎癥組織中水平較高時，會擴張血管，使神經末梢對緩激肽和組胺的敏感性增加，從而導致炎癥性疼痛[32]。非甾體抗炎藥可通過抑制前列腺素合成酶從而產生消炎作用，QQFSF亦可通過此途徑而降低RA的炎癥反應。除此之外，通路與通路之間也存在協調關系，甲狀腺激素信號通路同PI3K-AKT與HIF-1信號通路相互協調，核因子κB信號通路與Toll樣受體信號通路、B細胞受體信號通路和破骨細胞分化之間相互協調。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學解析了QQFSF治療RA的成分、靶點與通路，從分子水平闡述了QQFSF對RA疾病及機體的整體調控，為其臨床應用及新藥開發(fā)提供了科學參考;同時本研究的預測結果亦需通過后續(xù)的實驗進行驗證。

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（2020-05-12收稿 責任編輯：蒼寧）