短發(fā)夾RNA沉默絲裂原活化蛋白激酶1對胃癌細胞生物學表型的影響及其分子機制

王轉兄，宋耀輝，杜正平，陳熙，顧靜，李海龍

1.甘肅中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院臨床檢驗診斷學教研室，甘肅 蘭州730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院生理教研室，甘肅蘭州730000

胃癌（gastric cancer，GC）是全球第五大常見惡性疾病，也是全球癌癥相關死亡的第三大病因［1］，其發(fā)病率和死亡率在東亞地區(qū)較高［2］。GC的發(fā)生是一個復雜的過程，涉及宿主、環(huán)境和細菌因子之間的相互作用，導致遺傳和表觀遺傳水平的改變。盡管胃鏡檢查和常規(guī)腫瘤生物標志物篩查已得到廣泛應用，但由于早期GC無特定癥狀，大多數患者診斷時已為晚期，失去了手術機會，且晚期GC患者的預后較差，5年生存率為5%~20%，中位總生存期為10個月［3］。預后不良主要是由于癌細胞的侵襲和轉移，也是GC相關復發(fā)和死亡的主要原因［4］。因此，迫切需要有價值和實用的生物標志物來篩選具有高風險的GC患者，有利于早期診斷及為每個患者建立有效的治療策略。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是由絲氨酸-蘇氨酸激酶組成的蛋白激酶。研究表明，MAPK在生物進化過程中高度保守，MAPK能獨立地將細胞外信號轉導至細胞內，以調節(jié)相關基因的表達，并參與細胞有絲分裂、增殖、炎癥、侵襲和轉移等生理過程［5］。MAPK／ERK途徑是接收多種刺激的輸入會聚信號節(jié)點，信號通過MAPK途徑傳遞激活下游底物，啟動相關基因的表達，從而引起細胞增殖、侵襲和轉移等生物學行為的激活或轉化［6］。研究表明，許多MAPK通路酶在女性生殖道癌、乳腺癌、卵巢癌和宮頸癌中均有異常表達［7-8］，MAPK／ERK信號通路在GC細胞中被激活，PD98059通過抑制MAPK／ERK信號通路的活性可影響GC細胞的生物學功能。MAPK1也稱為ERK2，是MAPK通路的亞家族。研究表明，MAPK1的激活與GC細胞的侵襲密切相關，在GC細胞系中敲低MAPK1表達可抑制細胞增殖、遷移及侵襲，誘導凋亡［9］。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可通過調節(jié)MAPK1來影響腫瘤的生物學行為［10］；GC中miR-585下調可致MAPK1增加，從而促進GC的增殖和轉移［11］；miR-197和MAPK1在GC細胞中存在關聯(lián)，且miR-197可通過直接靶向MAPK1誘導人GC細胞的凋亡，并降低其5-FU抗性［12］。MAPK1與GC的發(fā)生、發(fā)展密切相關。因此，本實驗通過短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）沉默SGC-7901及HGC-27細胞中的MAPK1，檢測細胞增殖、遷移、侵襲能力和細胞周期、凋亡及其相關信號因子的表達情況，評價沉默MAPK1對GC細胞生物表型的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及病毒GC細胞SGC-7901和HGC-27、慢病毒LV-sh-Ctrl和LV-sh-MAPK1均購自上海吉凱基因科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 高糖DMEM培養(yǎng)基購自蘭州健順生物科技有限公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；青-鏈霉素、RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑PMSF購自美國Solarbio公司；RNA裂解液RNAiso Plus及逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa Bio公司；兔抗人CDK1、CDK6、CCNB1、P53、BAX、Bcl-2、Caspase 3、C-Caspase 3、Caspase 9、C-Caspase 9多克隆抗體及HRP標記的山羊抗兔IgG購自美國GeneTex公司；兔抗MAPK1及GAPDH多克隆抗體購自上海YEASEN公司；流式細胞儀（型號FACSVerse）購自美國BD公司。

1.3 MAPK1在GC中表達的臨床病理特征分析 應用TCGA數據庫數據挖掘網站-UALCAN（http：／／ualcan.path.Uab.edu／index.html），提取GC患者MAPK1基因表達及與臨床病理特征之間關系的數據，輸入Graphpad軟件，進行繪圖，分析MAPK1在GC中表達的臨床病理特征。

1.4 細胞培養(yǎng) 將SGC-7901和HGC-27細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細胞融合度達80%以上時，用0.25%胰酶消化，連續(xù)傳3代，取第2代對數生長期細胞進行后續(xù)試驗。

1.5 病毒感染 當SGC-7901和HGC-27細胞融合度達20%~30%時，按MOI=20分別感染慢病毒LVsh-MAPK1、LV-sh-Ctrl（分別為兩種細胞的試驗組及陰性對照組），于37℃培養(yǎng)12~16 h；更換為常規(guī)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)約72 h，鏡下觀察熒光細胞數。加入5 μg／mL嘌呤霉素，每隔3~4 d更換含嘌呤霉素的培養(yǎng)基，篩選感染穩(wěn)定的細胞株進行后續(xù)試驗。

1.6 GC細胞中MAPK1基因mRNA轉錄水平的檢測采用RT-qPCR法。在Primer-Blast中登錄http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／網站，設計引物序列，MAPK1上游引物：5′-CGTTGGTACAGGGCTCCAGAA-3′，下游引物：5′-CTGCCAGAATGCAGCCTACAGA-3′，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。采用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，以其為模板進行PCR擴增。PCR擴增條件為：95℃預變性10 s，95℃變性10 s，60℃退火20 s，共40個循環(huán)。擴增后進行熔解曲線分析，內參基因為GAPDH，采用2-ΔΔCt法計算基因相對轉錄水平。

1.7 GC細胞中MAPK1蛋白表達水平的檢測 采用Western blot法。用RIPA提取各組細胞總蛋白，經10%SDS-PAGE分離后，轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入兔抗MAPK1多克隆抗體及兔抗GAPDH多克隆抗體（1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜；用0.5%TBST洗滌3次，加入HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶2 500稀釋），37℃溫育2 h；ECL法顯色。

1.8 沉默MAPK1對GC細胞增殖能力影響的檢測采用MTT法。將各組GC細胞按2×104個／mL加入96孔板，100 μL／孔，兩種GC細胞均設空白對照組（不感染），每組設6個重復，于37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48、72 h；加入5 mg／mL的MTT溶液，20 μL／孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄培養(yǎng)基，加入DMSO溶液，150 μL／孔，避光振蕩10 min，用酶標儀檢測A490，并按下式計算細胞增殖率。試驗重復3次。

細胞增殖率（%）=（試驗組A490-空白對照組A490）／（陰性對照組A490-空白對照組A490）×100%

1.9 沉默MAPK1對GC細胞遷移能力影響的檢測

1.9.1 細胞劃痕愈合試驗 將各組GC細胞按2.5×105個／mL加入6孔板，2 mL／孔，于37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；待細胞融合度達100%時，用200 μL槍頭進行劃痕，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入2 mL無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，于培養(yǎng)0及48 h時拍照。應用Image J軟件檢測劃痕區(qū)面積值，并按下式計算細胞愈合率。試驗重復3次。

愈合率（%）=（0 h細胞劃痕面積-48 h細胞劃痕面積）／0 h細胞劃痕面積×100%

1.9.2 細胞Transwell小室試驗 各組GC細胞經0.25%胰蛋白酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸，濃度調節(jié)為5×105個／mL。將Transwell小室放入24孔板中，上室加入200 μL細胞懸液，下室加入500 μL含10% FBS的培養(yǎng)基，于37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；棄小室內培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入4%多聚甲醛，固定小室下側細胞30 min；用0.1%結晶紫染色20 min，PBS洗滌3次，晾干，鏡下觀察計數。隨機選取中央和四周5個視野，對遷移至Transwell下室的細胞進行計數。試驗重復3次。

1.10 沉默MAPK1對GC細胞侵襲能力影響的檢測采用細胞Transwell小室試驗。將Transwell小室放入24孔板中，置于冰上，按50 μL／cm2加入4℃預冷的Matrigel基質，37℃放置30 min；將各組GC細胞用0.25%胰酶消化，用含無血清培養(yǎng)基重懸，濃度調節(jié)為5×105個／mL，加入Transwell小室內，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；固定染色，鏡下觀察計數。隨機選取中央和四周5個視野，對遷移至Transwell下室的細胞進行計數。試驗重復3次。

1.11 沉默MAPK1對GC細胞周期影響的檢測 采用流式細胞術。將各組GC細胞用0.25%胰酶消化，收集細胞，預冷PBS洗滌2次，棄上清，加置1 mL預冷的70%乙醇，吹打混勻，4℃固定12 h；7 104×g離心5 min，預冷的PBS洗滌2次，加入PI和RnaseA，37℃避光溫浴30 min，用流式細胞儀檢測。試驗重復3次。

1.12 沉默MAPK1對GC細胞凋亡能力影響的檢測采用流式細胞術。將各組CG細胞用25%胰酶消化，收集細胞至離心管中，PBS洗滌2次，棄上清，用1×Binding Buffer重懸，每管加入5 μL AnnexinV-APC和10 μL 7-AAD，混勻，室溫避光孵育15 min；每管加入380 μL預冷的1×Binding Buffer，用流式細胞儀檢測。試驗重復3次。

1.13 沉默MAPK1對GC細胞周期和凋亡相關分子表達影響的檢測 采用Western blot法。用RIPA提取細胞總蛋白，經10% SDS-PAGE分離蛋白后，轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入兔抗人P53、CCNB1、CDK6、CDK1、Bax、Bcl-2、Caspase 3、Caspase 9、C-Caspase 3、C-Caspase 9、GAPDH多克隆抗體（1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜；用0.5%TBST洗滌3次，加入HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶2 500稀釋），37℃溫浴2 h；ECL法顯色。

1.14 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均值±標準差（±s）表示，組間兩獨立樣本比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MAPK1在GC中表達的臨床病理特征分析與正常組織比較，MAPK1在原發(fā)性腫瘤中的表達明顯升高（P＜0.01）；MAPK1在GC中的表達具有種族差異性，與正常組織比較，高加索人GC患者的表達量較高（P＜0.01），而非裔美國人和亞洲人中GC患者的MAPK1表達量無明顯差異（P＞0.05）；在腫瘤病理分級和分期中，與正常組織比較，MAPK1表達量在2級（P＜0.01）、3級（P＜0.01）及2期（P＜0.05）、3期（P＜0.01）、4期（P＜0.01）明顯升高。見圖1。

圖1 MAPK1在GC中表達的臨床病理分析Fig.1 Clinical pathological analysis of MAPK1 expression in GC

2.2 慢病毒感染GC細胞的效果 各組GC細胞感染慢病毒后，熒光細胞數均占總細胞數的80%以上，見圖2。SGC-7901-sh-MAPK1、SGC-7901-sh-Ctrl、HGC-27-sh-MAPK1及HGC-27-sh-Ctrl組細胞中MAPK1基因mRNA轉錄水平分別為0.25、0.98、0.20和0.95，MAPK1表達水平分別為0.37、1.00、0.18和0.99。SGC-7901-sh-MAPK1及HGC-27-sh-MAPK1組細胞中MAPK1基因mRNA轉錄及MAPK1表達水平均顯著低于相應陰性對照組（t=-2.73～2.71，P＜0.01）。見圖3。

圖2 各組GC細胞的鏡下觀察（×100）Fig.2 Microscopy of gastric cancer cells in various groups（×100）

圖3 Western blot法檢測各組CG細胞中MAPK1的表達Fig.3 Western blotting of MAPK1 expression in gastric cancer cells in various groups

2.3沉默MAPK1對GC細胞增殖能力的影響 各組CG細胞的增殖率隨培養(yǎng)時間的延長逐漸升高，感染72 h后，SGC-7901-sh-MAPK1及HGC-27-sh-MAPK1組的細胞增殖率明顯低于相應陰性對照組（t分別為2.63和2.69，P＜0.01）。見圖4。表明MAPK1下調可顯著抑制SGC-7901及HGC-27細胞的增殖能力。

圖4 各組CG細胞的細胞增殖率Fig.4 Proliferation rates of gastric cancer cells in various groups

2.4 沉默MAPK1對CG細胞遷移能力的影響

2.4.1 細胞劃痕愈合試驗SGC-7901-sh-MAPK1、SGC-7901-sh-Ctrl、HGC-27-sh-MAPK1及HGC-27-sh-Ctrl組細胞劃痕愈合率分別為15%、66%、49%和77%。SGC-7901-sh-MAPK1及HGC-27-sh-MAPK1組顯著低于相應陰性對照組（t分別為3.40和2.63，P＜0.01）。見圖5。表明MAPK1下調可抑制SGC-7901及HGC-27細胞的遷移能力。

圖5 細胞劃痕愈合試驗檢測沉默MAPK1對GC細胞遷移能力的影響（×100）Fig.5 Cell healing test for migration ability of gastric cancer cells after silencing MAPK1（×100）

2.4.2 細胞Transwell小室試驗SGC-7901-sh-MAPK1、SGC-7901-sh-Ctrl、HGC-27-sh-MAPK1及HGC-27-sh-Ctrl組遷移細胞數分別為76、200、75和206。SGC-7901-sh-MAPK1及HGC-27-sh-MAPK1組細胞遷移數顯著少于相應陰性對照組（t分別為2.67和2.80，P＜0.01）。見圖6。表明沉默MAPK1可降低SGC-7901及HGC-27細胞的縱向遷移能力。

圖6 Transwell小室試驗檢測沉默MAPK1對CG細胞遷移能力的影響（×100）Fig.6 Transwell assay on migration ability of gastric cancer cells after silencing MAPK1（×100）

2.5 沉默MAPK1對CG細胞侵襲能力的影響SGC-7901-sh-MAPK1、SGC-7901-sh-Ctrl、HGC-27-sh-MAPK1及HGC-27-sh-Ctrl組侵襲細胞數分別為60、115、40和88。SGC-7901-sh-MAPK1及HGC-27-sh-MAPK1組侵襲細胞數顯著少于相應陰性對照組（t分別為3.59和3.27，P＜0.01）。見圖7。表明沉默MAPK1可降低SGC-7901及HGC-27細胞的侵襲能力。

圖7 Transwell小室試驗檢測沉默MAPK1對CG細胞侵襲能力的影響（×100）Fig.7 Transwell assay on invasion ability of gastric cancer cells after silencing MAPK1（×100）

2.6 沉默MAPK1對CG細胞周期的影響SGC-7901-sh-MAPK1及HGC-27-sh-MAPK1組處于G1期的細胞比例顯著高于相應陰性對照組（t分別為3.56和4.80，P＜0.01）；處于S期、G2期的細胞比例顯著低于相應陰性對照組（t=-3.82~2.73，P＜0.01）。見圖8和表1。表明MAPK1基因下調可使細胞滯于G1期，從而阻止細胞從G1期向S期發(fā)展，進而影響腫瘤細胞的增殖。

表1 各組CG細胞所處細胞周期的細胞數占比（%，±s，n=3）Tab.1 Proportions of gastric cancer cells at various cell phases in various groups（%，±s，n=3）

表1 各組CG細胞所處細胞周期的細胞數占比（%，±s，n=3）Tab.1 Proportions of gastric cancer cells at various cell phases in various groups（%，±s，n=3）

注：aa表示與相應陰性對照組比較，P＜0.01。

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2.7 沉默MAPK1對CG細胞凋亡能力的影響SGC-7901-sh-MAPK1、SGC-7901-sh-Ctrl、HGC-27-sh-MAPK1及HGC-27-sh-Ctrl組早期凋亡率分別為（3.17±0.003）%、（1.22±0.001）%、（12.04±0.007）%、（3.15±0.002）%，晚期凋亡率分別為（17.41±0.008）%、（0.20±0.000）%、（13.39±0.002）%、（1.05±0.001）%。SGC-7901-sh-MAPK1及HGC-27-sh-MAPK1組細胞早期及晚期凋亡率顯著高于相應陰性對照組（t=0.000～12.340，P＜0.01）。見圖9。表明MAPK1可顯著提高SGC-7901及HGC-27細胞的凋亡能力，促進其凋亡。

圖9 流式細胞術檢測各組CG細胞的凋亡細胞數Fig.9 Flow cytometry of number of apoptotic gastric cancer cells in various groups

2.8 沉默MAPK1對CG細胞周期和凋亡相關分子表達的影響SGC-7901-sh-MAPK1及HGC-27-sh-MAPK1組細胞CDK6、P53、Bax、Caspase 3、C-Caspase 3、Caspase 9、C-Caspase 9表達明顯高于相應陰性對照組（t=3.17～6.35，P＜0.01），CDK1、CCNB1及Bcl-2表達則明顯低于相應陰性對照組（t=2.85～4.03，P＜0.01）。見圖10和表2。表明MAPK1下調可使細胞滯于G1期，阻止細胞從G1期向S期發(fā)展，促進細胞凋亡。

圖10 Western blot法檢測各組CG細胞周期和凋亡相關分子的表達Fig.10 Western blotting of expression and cell cycle-and apoptosis-associated factors in gastric cancer cells in various groups

表2 CG細胞周期和凋亡相關分子的表達水平（±s，n=3）Tab.2 Expression levels of cell cycle-and apoptosis-associated factors in gastric cancer cells in various groups（±s，n=3）

表2 CG細胞周期和凋亡相關分子的表達水平（±s，n=3）Tab.2 Expression levels of cell cycle-and apoptosis-associated factors in gastric cancer cells in various groups（±s，n=3）

注：aa表示與相應陰性對照組比較，P＜0.01。

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圖8流式細胞術檢測各組CG細胞的細胞周期分布Fig.8 Flow cytometry of cell cycle distribution of gastric cancer cells in various groups

3 討論

GC是一種死亡率較高的疾病，隨著醫(yī)療技術的發(fā)展，癌癥發(fā)病率穩(wěn)步下降，但臨床管理面臨巨大挑戰(zhàn)［13］。盡管人們對遺傳和表觀遺傳癌癥有了越來越多的了解，但缺乏用于早期診斷GC的非侵入性方法［14］。本研究應用TCGA數據庫數據挖掘網站-UALCAN，提取GC患者基因表達及臨床病理特征數據，統(tǒng)計結果表明，MAPK1在原發(fā)性腫瘤中的表達明顯升高（P＜0.01），且在GC中的表達具有顯著種族差異性（P＜0.01），非裔美國人和亞洲人中CG患者的MAPK1表達量相對較低，而高加索人GC患者的表達量較高；在腫瘤病理分級和分期中，MAPK1表達量在2、3級和2、3、4期明顯升高（P＜0.05）。表明MAPK1是一個在GC中高表達，并具有臨床相關性的癌基因。許多研究表明，miRNA可通過靶向調控MAPK1影響腫瘤的生長進展，如miR-585、miR-378、miR-454通過直接靶向MAPK1抑制CG細胞增殖、侵襲、轉移等惡性生物學行為［9，15-16］；在對黑色素瘤的研究中，miR-524-5p靶向調控BRAF和ERK2抑制致癌性BRAF黑色素瘤的生長［17］；miR-217-5p可通過直接靶向PRKCI、BAG3、ITGAV和MAPK1誘導結直腸癌細胞凋亡［18］。

上述研究表明，MAPK1在GC的發(fā)生、發(fā)展中起著關鍵性作用，為探討沉默MAPK1對CG細胞生物學行為的影響，本研究用慢病毒LV-sh-MAPK1感染SGC-7901及HGC-27細胞，使MAPK1在細胞中沉默表達。沉默MAPK1后能夠顯著抑制SGC-7901、HGC-27的增殖、遷移及侵襲能力（P＜0.01）；可明顯誘導CG細胞的凋亡（P＜0.01），且細胞被阻滯于G1期；調控細胞G1期的CDK6的表達量明顯上調（P＜0.01），而調控細胞G2、G2／M期的CDK1、CCNB1的表達量顯著下調（P＜0.01）；促進細胞凋亡的Bax、Caspase 3、C-Caspase3、Caspase 9、C-Caspase 9基因的表達明顯升高（P＜0.01），而抑制細胞凋亡的Bcl-2基因的表達則明顯降低（P＜0.01）。

綜上所述，沉默MAPK1可抑制人CG細胞增殖、侵襲遷移能力，促進細胞凋亡并將其阻滯在G1期。因此，MAPK1可能被作為一種有價值的基因治療靶點用于GC的治療。