超聲輔助提取玉木耳黃酮工藝優(yōu)化研究

張思覃

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

玉木耳是毛木耳白色變異菌種，遺傳穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)，是藥食兩用真菌［1-2］。黃酮是玉木耳中主要活性成分，具有抗菌抗癌、降壓降脂及延緩衰老等功效，在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景［3-4］。

超聲波輔助提取作為一種新型提取技術(shù)，與傳統(tǒng)提取技術(shù)相比具有操作方便、溶劑用量少、選擇性強、產(chǎn)物易于純化等優(yōu)點[5-6］。響應(yīng)面分析法是應(yīng)用合理的實驗設(shè)計，采用多元二次回歸方程擬合各個因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，利用回歸方程分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，在各種工藝優(yōu)化設(shè)計中得到廣泛 應(yīng) 用［7-9］。

本試驗采用微波輔助法對玉木耳中的總黃酮進(jìn)行提取，在單因素實驗基礎(chǔ)上，研究響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取玉木耳中總黃酮的最佳工藝條件、優(yōu)化玉木耳總黃酮的提取工藝、提高玉木耳的使用價值，促進(jìn)玉木耳資源的有效開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉木耳干品購自安徽碭山，烘干粉碎，過篩備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司)，其他相關(guān)試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉木耳的預(yù)處理。將玉木耳洗凈，晾干，于烘箱中55℃干燥至恒重，粉碎，先后過3號和5號藥典篩、裝瓶備用［10］。

1.2.2 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。參考郭亞健方法[11]：精密稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，置50 mL容量瓶，75%的乙醇定容，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，取不同體積標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于100mL容量瓶中，進(jìn)行反應(yīng)，510 nm處測定吸光度A。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]，得到標(biāo)準(zhǔn)曲如圖1所示。

圖1 盧丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3 玉木耳黃酮類化合物的提取和測定。準(zhǔn)確稱取經(jīng)處理的玉木耳粉1.00 g，置于250 mL磨口燒瓶中，加入一定濃度的乙醇溶液，在一定的微波功率下加熱一定時間后過濾，吸取2.00 mL濾液于50 mL容量瓶中，進(jìn)行稀釋定容至50 mL，作為待測液備用[13]。

按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法處理，將吸光度（A）代入蘆丁回歸方程公式中，得到黃酮濃度（C），計算樣品的總黃酮提取率，公式如下。

總黃酮提取率（%）=C×V×N×100/M；C：粗提取樣液中總黃酮的濃度（mg/mL）；V：提取液體積（mL）；N：稀釋倍數(shù)；M：植物粉末樣品質(zhì)量（g）[14]。

1.2.4 單因素試驗設(shè)計。采用控制變量法，選取液料比、超聲時間、超聲溫度、超聲功率、乙醇濃度等進(jìn)行單因素試驗，研究不同因素對玉木耳總黃酮提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。綜合單因素試驗得出的結(jié)果，選取超聲時間、超聲溫度、超聲功率、乙醇濃度4個因素，利用Design Expert軟件進(jìn)行CCD響應(yīng)面設(shè)計玉木耳總黃酮的提取工藝［15-16］。試驗方案如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對玉木耳總黃酮提取率的影響。由圖2可以看出，玉木耳總黃酮的提取率隨著料液比呈遞增趨勢，當(dāng)料液比達(dá)到1:16（mL/g）時,玉木耳總黃酮提取率達(dá)到最大值后，隨著液料比的增大玉木耳總黃酮提取率下降。因此，選擇最佳料液比條件為1:16（mL/g）。

圖2 料液比對玉木耳黃銅提取率的影響

2.1.2 超聲時間對玉木耳總黃酮提取率的影響。由圖3可知，在設(shè)定時間范圍內(nèi)，玉木耳總黃酮提取率隨著提取時間延長而增加，當(dāng)超聲提取時間超過70 min，總黃酮提取率呈下降趨勢。根據(jù)分析，這可能是因為隨著超聲時間的增加，溶液溫度不斷升高，樣品內(nèi)分子的運動速度加快，使得玉木耳中總黃酮更易提取。時間過長超聲處理造成黃酮結(jié)構(gòu)的破壞，造成提取率下降。綜合考慮，確定較適合的提取時間為70 min左右。

圖3 超聲時間對玉木耳黃銅提取率的影響

2.1.3 超聲溫度對玉木耳總黃酮提取率的影響。由圖4可知，在選擇的溫度范圍內(nèi)，小于70℃范圍提取率隨溫度增加而增加，70℃時提取率最大，提取溫度高于70℃提取率出現(xiàn)下降的趨勢，這可能是由于提取溫度過高時，黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)受到破壞，因此選擇70℃為提取玉木耳黃酮的最佳溫度。

圖4 超聲溫度對玉木耳黃銅提取率的影響

2.1.4 超聲功率對玉木耳中總黃酮提取率的影響。由圖5可知，超聲功率低于80 W時，玉木耳總黃酮提取率隨著功率的增加而遞增，80 W時，玉木耳總黃酮的提取率達(dá)到最大值。超聲功率大于80時，玉木耳總黃酮提取率下降。根據(jù)分析，這可能是因為在較大功率下部分黃酮被分解。因此，選擇最佳微波功率為80 W。

圖5 超聲功率對玉木耳黃銅提取率的影響

2.1.5 乙醇濃度對玉木耳總黃酮提取率的影響。由如圖6可知，乙醇濃度為70%時，玉木耳總黃酮提取率達(dá)到最大值。乙醇濃度大于70%，隨著乙醇濃度的增加，玉木耳總黃酮提取率呈下降趨勢。根據(jù)分析，這可能是因為一些極性物質(zhì)的溶出，從而影響玉木耳總黃酮溶出，因此選擇最佳提取乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖6 乙醇濃度對玉木耳黃銅提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化玉木耳總黃酮提取工藝參數(shù)

2.2.1 回歸方程的建立與分析。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化玉木耳總黃酮的提取工藝。選取超聲時間（A）、超聲溫度（B）、超聲功率（C）、乙醇濃度（D）4個因素，以玉木耳總黃酮提取率為響應(yīng)值(Y)，采用Design-Expert 7.1.3進(jìn)行選用CCD進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計和分析，試驗結(jié)果見表2，模型方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計表

通過對試驗結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，經(jīng)過二次回歸擬合后，得出擬合方程式:y=0.75-0.0016A-0.027B-0.037C-0.012D-0.0075AB-0.045AC+0.0025AD-0.0075BC-0.01BD-0.012CD-0.022A2-0.062B2-0.1 C2-0.032D2。

從表3可以看出該模型回歸顯著（F=20.62，P＜0.0001），即建立的回歸模型有意義；失擬項P=0.0631，沒有顯著差異；確定系數(shù)R2=0.9538，調(diào)整系數(shù)RAdj2=0.9075，說明該模型能夠較好的擬合實際實驗?；貧w模型中由一次項的P值（A：0.7771，B：0.0004，C：＜0.0001，D：0.0629）可以說明選定的超聲水浴溫度和超聲功率可顯著影響玉木耳總黃酮提取率，超聲時間和乙醇濃度對玉木耳黃酮提取率的影響并不顯著；各因素二次項均為模型極顯著因素；交互項AC為模型顯著因素，其他各因素交互模型不顯著因素，不能明顯影響玉木耳黃酮提取率。另外，從各項的F值（A∶0.083，B∶21.33，C∶40.33，D∶4.08）可以看出，各因素在所選的水平范圍內(nèi)，黃酮提取率的影響由大到小依次為：超聲功率、超聲溫度、乙醇濃度、料液比。

表3 方差分析表

2.2.2 響應(yīng)面分析。模型響應(yīng)面圖結(jié)果見圖7~12，各圖顯示超聲時間、超聲溫度、超聲功率、乙醇濃度中任意兩個變量取零水平時，其余兩個變量對玉木耳總黃酮提率的影響。從3D響應(yīng)面圖中能夠比較明顯的分析出多個自變量對響應(yīng)值的影響，并且可以通過圖形分析響應(yīng)面對不同自變量變化之間的影響程度，在保持其中一個自變量不變的前提情況，其他兩個自變量對響應(yīng)面值的影響。

圖7 超聲時間與超聲溫度及其交互作用對玉木耳總黃酮得率影響的響應(yīng)面

如果響應(yīng)曲面坡度越陡，說明響應(yīng)值對于操作條件的改變越敏感，反之如果響應(yīng)曲面的坡度越平緩表明操作條件的改變對響應(yīng)值的影響也就越不顯著[17-19]。通過對圖8~圖13的分析可知，圖9中響應(yīng)曲面坡度陡，等高線呈橢圓形，AC的交互作用對玉木耳總黃酮提取影響顯著。當(dāng)提取時間一定時，黃酮提取率隨提取功率增加呈先增加后減少的趨勢。當(dāng)超聲功率一定時，總黃酮提取率隨著提取超聲時間的增加呈先增加后減少的趨勢。

圖8 超聲時間與超聲功率及其交互作用對玉木耳總黃酮得率影響的響應(yīng)面

圖9 超聲時間與乙醇濃度及其交互作用對玉木耳總黃酮得率影響的響應(yīng)面

圖10 超聲溫度與超聲功率及其交互作用對玉木耳總黃酮得率影響的響應(yīng)面

圖11 超聲溫度與乙醇濃度及其交互作用對玉木耳總黃酮得率影響的響應(yīng)面

圖12 超聲溫度與超聲功率及其交互作用對玉木耳總黃酮得率影響的響應(yīng)面

其他因素間的交互作用，在選擇的因素的范圍內(nèi)，交互作用效果不顯著。

2.2.3 最佳工藝條件的預(yù)測和驗證。經(jīng)響應(yīng)面分析優(yōu)化，通過Design-Expert軟件對回歸方程進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，獲得微波輔助提取莪術(shù)總黃酮的最佳工藝條件為：超聲時間為67.9 min、超聲溫度為67.9、微波功率為77.9 W、乙醇濃度為69%，在這種條件下模型預(yù)測玉木耳總黃酮提取率為0.757（%）。

在考慮到實際操作條件中局限性和便捷性，對提取玉木耳總黃酮最佳的工藝條件修正為超聲時間為68 min、超聲溫度為68、微波功率為78 W、乙醇濃度為69%。按照優(yōu)化后的工藝條件進(jìn)行了5次平行驗證實驗，實際得到的玉木耳總黃酮平均提取率為0.753（%）。玉木耳總黃酮的提取率與所建立模型預(yù)測的玉木耳總黃酮提取率相差不大，表明實驗結(jié)果與模型擬合良好，說明優(yōu)化工藝條件準(zhǔn)確可靠，具有較好的可行性。

3 結(jié)論

以干燥粉碎玉木耳粉為原料，加入乙醇溶液，利用超聲輔助提取，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化了提取工藝條件。可得超聲輔助提取玉木耳總黃酮的最佳工藝條件為：超聲時間為68min、超聲溫度為68、微波功率為78W、乙醇濃度為69%，在此條件下實際測定出玉木耳總黃酮平均提取率為0.753（%）。