半夏-陳皮“異病同治”咳嗽和冠心病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作用機制研究*

萬陽 楊奕 劉慧瑩 蔡恒斌 李金根 毛祥坤#

（1江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌330004；2江中藥業(yè)股份有限公司 江西南昌330077；3江西省南昌市強制隔離戒毒所 南昌330029）

咳嗽是一種呼吸道常見疾病，占呼吸科門診的30%左右，病因復(fù)雜，部分患者經(jīng)抗感染治療后仍無法緩解，長此以往，若得不到有效治療，將對呼吸系統(tǒng)造成損傷[1]。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱冠心病，是冠狀動脈血管發(fā)生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而致，臨床常見冠心病患者易患咳嗽，西醫(yī)認為與患者心肺功能不全有關(guān)[2]。從中醫(yī)角度而言，咳嗽病位在肺，因肺失宣肅、肺氣上逆、沖擊氣道而致，臨床可表現(xiàn)為咳嗽、咳痰，分外感與內(nèi)傷兩種，其中外感咳嗽若不能及時使邪外出，易演變?yōu)閮?nèi)傷咳嗽，內(nèi)傷咳嗽其病理因素多與“痰”相關(guān)。冠心病屬中醫(yī)的“胸痹、胸痛”等范疇，病位在心，病理因素與“痰、瘀血”相關(guān)?！靶臑榫髦?、肺為相傅之官”，肺能協(xié)助“君主之官”調(diào)節(jié)氣血，兩者發(fā)病亦與“痰”相關(guān)，故咳嗽、冠心病在病因病機上常互為關(guān)聯(lián)。半夏、陳皮為臨床常用祛痰藥，兩者常相須為用，作為治療呼吸、心血管疾病的中藥復(fù)方核心藥在臨床上應(yīng)用廣泛[3]。中醫(yī)治病的法則，不著眼于疾病的異同，關(guān)鍵在于其病機的異同，“異病同治”則是該法則的主要體現(xiàn)。在不同疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，只要出現(xiàn)相同的病機，就可以采用同一方法治療該病?？人浴⒐谛牟≡诎l(fā)病過程中，常出現(xiàn)“痰濁阻滯”，用半夏-陳皮藥對治療符合“異病同治”之說。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是很多學(xué)者近年提出的一種采用系統(tǒng)生物學(xué)方法來進行藥理學(xué)研究的新型技術(shù)方法，是基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用的網(wǎng)絡(luò)，能系統(tǒng)綜合地觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，這與中藥的多成分、多途徑、多靶點協(xié)同作用的原理相似[4]?；诖耍狙芯窟\用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從中醫(yī)“異病同治”的角度，探究半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病的具體分子機制?，F(xiàn)報道如下：

1 研究方法

1.1 藥物成分及靶點的查詢及篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以口服生物利用度（Oral Bioavailability,OB）≥30%或類藥性指數(shù)（Drug Like Index,DL）≥0.18為標(biāo)準對中藥藥對半夏-陳皮的化合物進行篩選[5]。將符合條件的化合物輸入Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找其國際化學(xué)標(biāo)識符（International Chemical Identifier,InChI）及CID，并將其輸入BATMAN-TCM數(shù) 據(jù) 庫（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）中，以得分（Score）≥20與調(diào)整P值（Adjusted P-value）＜0.05為臨界值進行藥物靶標(biāo)的篩選[6]。

1.2 疾病基因的檢索 分別在基因疾病關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫DisGeNET（http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu）、人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫OMIM（https://www.omim.org/）、藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫Drug Bank（https://www.drugbank.ca/）以咳嗽（Cough）、冠心?。–oronary Heart Disease）為詞條進行相關(guān)疾病基因檢索。將所得的咳嗽、冠心病疾病基因進行整合，并應(yīng)用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）對基因進行標(biāo)準化。

1.3 構(gòu)建半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫PPI網(wǎng)絡(luò)圖 將半夏和陳皮中篩選所得的藥物靶標(biāo)分別與咳嗽、冠心病的疾病基因進行映射，分別得出該藥對治療咳嗽、冠心病的靶標(biāo)。將兩個數(shù)據(jù)集進行整合得到該藥對治療咳嗽和冠心病的共同作用靶基因，合并抽取交集靶基因，得出該藥對疾病共同作用的靶標(biāo)蛋白數(shù)據(jù)庫。將靶標(biāo)蛋白輸入STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org），構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，用Cytoscape軟件（3.8.2）進行可視化分析。根據(jù)Cytoscape軟件中的Network Analysis plugin插件對圖中節(jié)點自由度（Degree）進行分析。自由度越大，該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的生物功能則越多。根據(jù)節(jié)點自由度大小進行顏色渲染，顏色由黃色漸變成紅色。其中黃色節(jié)點表明其Degree較?。ㄉ锕δ茌^少），紅色節(jié)點代表其自由度較大（生物功能較多）。

1.4 基 因 本 體（Gene Ontology,GO）、KEGG PATHWAY通路富集 分別將半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病及其交集靶基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫分別進行GO、KEGG分析，以P值＜0.05為標(biāo)準進行篩選。

1.5 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病“活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)可視化構(gòu)建 分別將半夏-陳皮作用咳嗽、冠心病的有效作用成分、潛在靶標(biāo)輸入Cytoscape3.8.2 軟件，構(gòu)建“活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病靶標(biāo) 基于DisGeNET、OMIM及Drug Bank數(shù)據(jù)庫查詢所得，有230個基因與咳嗽相關(guān)，1 658個基因與冠心病相關(guān)。經(jīng)過分析后發(fā)現(xiàn)藥對半夏-陳皮治療咳嗽的基因有49個、有效成分69個，治療冠心病的基因有342個，有效成分87個。

2.2 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫PPI網(wǎng)絡(luò)圖 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶標(biāo)共有24個，將其輸入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)除TBPL1之外，其余23個靶標(biāo)蛋白之間均可相互作用。將23個靶蛋白輸入Cytoscape軟件進行可視化，PPI網(wǎng)絡(luò)圖顯示共有23個節(jié)點，聚類系數(shù)為0.597，網(wǎng)絡(luò)密度為0.372，其中生物功能最多的前3個靶標(biāo)蛋白人白介素1B（IL1B）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素8（CXCL8）。見圖1、圖2。

圖1 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶基因韋恩圖

圖2 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶基因GO分析 用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫分別對半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病及其交集靶標(biāo)進行GO在線富集，經(jīng)過篩選后發(fā)現(xiàn)：藥對治療咳嗽的生物過程（Biological Process,BP）主要集中在炎癥反應(yīng)、對基因表達的正向調(diào)控、蛋白質(zhì)四聚體等方面，細胞組成（Cellular Component,CC）主要集中在胞外部分、細胞表面、細胞質(zhì)膜的整體組成等，分子功能（Molecular Function,MF）主要表現(xiàn)細胞因子活性、離子通道的活性、鈣離子通道活性等方面。中藥藥對治療冠心病BP主要集中在對藥物反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)等部分，CC主要集中在細胞外部分、細胞質(zhì)及細胞表面等，MF主要集中在酶結(jié)合、細胞因子活性、受體結(jié)合等方面。半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶標(biāo)BP主要集中在炎癥反應(yīng)、對基因表達的調(diào)控、對鈣二醇1-單加氧酶活性的正向調(diào)控等方面，CC主要集中在細胞外部分、細胞表面、細胞膜等，MF主要表現(xiàn)在細胞因子活性、蛋白質(zhì)同源二聚體活性、酶結(jié)合等方面。見表1~3。

表1 半夏-陳皮治療咳嗽靶基因GO分析

表2 半夏-陳皮治療冠心病靶基因GO分析

表3 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶基因GO分析

續(xù)表

2.4 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶基因KEGG分析KEGG PATHWAY通路富集分析發(fā)現(xiàn)，中藥對治療咳嗽的主要通路涉及TNF通路、T細胞受體信號通路、Toll樣受體通路等25個通路。藥對治療冠心病的主要通路涉及HIF-1通路、TNF通路、AMPK通路等127個通路。半夏-陳皮“異病同治”的主要信號通路涉及NOD樣受體信號通路、TNF通路、NF-κB通路、TGF-β通路等炎癥相關(guān)信號通路。見圖3、圖4、圖5。

圖3 半夏-陳皮治療咳嗽靶基因KEGG PATHWAY富集圖

圖4 半夏-陳皮治療冠心病靶基因KEGG PATHWAY富集圖

圖5 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶基因KEGG PATHWAY富集圖

2.5 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病“活性成分-靶標(biāo)”圖 分別將半夏-陳皮藥對治療咳嗽、冠心病的有效活性成分、潛在作用靶標(biāo)及其通路輸入Cytoscape 3.8.2軟件，設(shè)置節(jié)點Degree≥10為標(biāo)準進行篩選，構(gòu)建“重要活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖，圖中棱形節(jié)點代表小分子化合物，圓形節(jié)點代表潛在靶點。見圖6、圖7。

圖6 半夏-陳皮治療咳嗽“重要活性成分-靶標(biāo)”圖

圖7 半夏-陳皮治療冠心病“重要活性成分-靶標(biāo)”圖

3 討論

半夏為天南星科植物半夏的干燥塊莖，味辛、性溫，歸脾、胃、肺經(jīng)，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)的功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有止咳平喘、抗消化性潰瘍、降壓、抗動脈粥樣硬化等功效，臨床常用于治療呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、腫瘤等疾病[7]。陳皮為蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮，味苦、辛，性溫，歸肺、脾經(jīng)，具有燥濕化痰、理氣健脾之功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其主要有效成分為黃酮類化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗過敏等作用，廣泛運用于呼吸、心血管、消化等系統(tǒng)疾病[8]?？人詾楹粑到y(tǒng)常見疾病，冠心病為心血管常見疾病，中醫(yī)理論認為兩者發(fā)病均與“痰”相關(guān)，半夏、陳皮兩味中藥均為燥濕化痰常用藥，均歸屬于脾、肺兩經(jīng)，“脾為生痰之源、肺為儲痰之器”，兩者常相須為用，是中醫(yī)臨床燥濕化痰之經(jīng)典藥對，其中化痰名方“二陳湯”是其充分體現(xiàn)，臨床運用該藥對治療兩種疾病均取得較好療效，亦是“異病同治”之法的體現(xiàn)。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這種新型的技術(shù)手段，對半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶基因進行GO分析發(fā)現(xiàn)，其BP主要集中在炎癥反應(yīng)、對基因表達的調(diào)控、對鈣二醇1-單加氧酶活性的正向調(diào)控等方面，CC主要集中在細胞外部分、細胞表面、細胞膜等，MF主要表現(xiàn)在細胞因子活性、蛋白質(zhì)同源二聚體活性、酶結(jié)合等方面。KEGG PATHWAY通路富集分析發(fā)現(xiàn)，半夏-陳皮藥對治療冠心病的分子機制主要涉及HIF-1、TNF、AMPK通路等127個通路，治療咳嗽的分子機制則主要涉及NOD樣受體、T細胞受體、Toll樣受體通路等25個通路。藥對“異病同治”的主要信號通路涉及NF-κB通路、NOD樣受體信號通路、TNF通路、TGF-β等30個信號通路。核 轉(zhuǎn) 錄 因 子-κB（Nuclear Factor-kappa B,NF-κB）通路是參與炎癥反應(yīng)的“明星通路”，其存在于多種組織中，具有廣泛的生物活性。一般情況下，其以同源或異源二聚體的形式存在于細胞質(zhì)中，此時其表現(xiàn)為無活性，當(dāng)其受到一些炎癥介質(zhì)、病毒、自由基等因素刺激時，無活性的NF-κB進入細胞核中并與其相關(guān)的靶基因結(jié)合，誘導(dǎo)一些炎癥介質(zhì)的表達以發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)其與動脈粥樣硬化、冠心病、慢性阻塞性肺疾病、哮喘等呼吸、心血管系統(tǒng)疾病相關(guān)[9~10]。NOD樣受體（NOD-like Receptors,NLRs）屬天然免疫系統(tǒng)，是哺乳動物先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其參與細胞內(nèi)細菌病原體相關(guān)分子模式的識別并可引起下游NF-κB信號通路的激活，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)其與機體內(nèi)炎癥反應(yīng)及代謝障礙相關(guān)[11]。腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）是一種涉及系統(tǒng)性炎癥的細胞因子，可誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)的釋放，是氣道炎癥的重要介質(zhì)，其常在咳嗽患者體內(nèi)表達升高[12]。此外，研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者體內(nèi)TNF-α亦過度表達，其作用于冠心病的機制與其促使血管內(nèi)皮增厚、增加血管內(nèi)皮平滑肌細胞數(shù)量、促使動脈粥樣硬化相關(guān)[13]。轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming Growth Factor-β,TGF-β）廣泛存在于人體各系統(tǒng)中，TGF-β通路參與細胞生長、分化、凋亡、動態(tài)平衡等多種細胞生命活動[14]。其通過促進膠原纖維分泌及沉積、抑制炎癥反應(yīng)、雙向調(diào)節(jié)血管平滑肌等多途徑參與冠心病的發(fā)生發(fā)展，是冠心病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵信號通路之一[15]。以上這些信號通路均與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，符合半夏-陳皮的藥理學(xué)，亦與目前咳嗽、冠心病的機制相符。同時，進一步表明半夏-陳皮“異病同治”咳嗽、冠心病是通過多途徑、多靶點進行治療。