菊黃東方鲀卵黃蛋白原肽段vWD的真核重組表達及功能研究

蔣彩云 ，喬 琨，許 旻，陳 貝，劉智禹,3，黃文樹,3

( 1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；3.福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361021)

0 引言

大多數(shù)的河鲀都含有河豚毒素(tetraodotoxin,TTX)，TTX是一類毒性極強的非蛋白類神經(jīng)毒素[1]，它可以選擇性地與肌肉和神經(jīng)組織中的電壓門控Na+通道結(jié)合，從而封閉神經(jīng)軸突傳導(dǎo)能力，導(dǎo)致進行性癱瘓，甚至使生物因呼吸和心力衰竭而死亡[2]。TTX對小鼠的半數(shù)致死量(LD50)約為8 μg/kg(按小鼠體重計)，對人的最小致死劑量只有0.5～1.0 mg[3]，其毒性是氰化鈉的1 250倍[4]，但目前還沒有對TTX中毒治療的特效藥。由于河鲀?nèi)馕鄂r美、營養(yǎng)豐富，日本、澳大利亞、孟加拉國、中國素有食用河鲀的習(xí)慣；然而，TTX的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，一般烹調(diào)手段難以破壞[5]；因此，人們因食用河鲀而導(dǎo)致TTX中毒的事件，屢有發(fā)生，嚴(yán)重威脅人們的生命安全[6-8]。

四齒鲀科的許多河鲀都可以貯積TTX。野生河鲀可通過食物鏈的毒素富集作用，大量貯積TTX于特定組織，如肝臟、卵巢和皮膚等[9]。養(yǎng)殖的無毒的紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)和星點東方鲀(Takifuguniphobles)，若飼喂含TTX的餌料后，其肝臟、卵巢和皮膚中也可累積TTX[10-11]。對野生斑點東方鲀(Takifugupoecilonotus)進行研究發(fā)現(xiàn)，在性成熟期(12月至3月)，隨著性腺指數(shù)(gonadosomatic index,GSI)的升高，卵巢中的TTX毒性含量增加，與此同時，肝臟中的TTX含量顯著降低[12]，提示河鲀體內(nèi)的TTX可通過組織間轉(zhuǎn)運從肝臟轉(zhuǎn)移到卵巢。為了探究TTX組織間轉(zhuǎn)運機制，Yin等[13]提取和純化了豹紋東方鲀(Takifugupardalis)卵巢中的高分子量物質(zhì)，獲得分子質(zhì)量為10 ku左右的毒素結(jié)合蛋白(TPOBP-10)，通過Edman法為其氨基酸測序，并進行cDNA克隆，結(jié)果顯示該蛋白與紅鰭東方鲀的卵黃蛋白原vWD結(jié)構(gòu)域(vitellogenin subdomain,vWF type D)高度同源，提示卵黃蛋白原肽段vWD可能具有結(jié)合TTX的功能，進而參與TTX在河鲀卵巢中的富集作用[13]。然而，卵黃蛋白原肽段vWD是否可結(jié)合TTX，是否可中和TTX的毒性，目前仍缺少相關(guān)的證據(jù)。

為此，本研究采用真核表達系統(tǒng)體外重組表達菊黃東方鲀(Takifuguflavidus)中卵黃蛋白原vWD結(jié)構(gòu)域肽段，并采用Biacore-表面等離子體共振(SPR)檢測重組蛋白結(jié)合TTX的能力，并進一步研究重組蛋白對TTX毒性的中和作用，為闡明TTX從肝臟轉(zhuǎn)移到卵巢的機制積累重要基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

菌株：E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞為本實驗室保存，畢赤酵母菌株GS115購自Invitrogen公司;質(zhì)粒：pMD19-T-TF_vWD克隆質(zhì)粒為本實驗室保存，表達載體pPIC9K購自Invitrogen公司；實驗動物：19.0～21.0 g的無特定病原體級(SPF)ICR品系雄性健康小鼠，由廈門大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗試劑

胰蛋白胨(tryptone)、酵母粉(yeast extract)購自O(shè)XOID公司；生物素購自上海生工生物公司；無氨基酵母氮源(YNB)購自Difco公司；DL2000 DNA Maker(3427A)、Ex Taq酶試劑盒、EcoR I和Not I限制性內(nèi)切酶、核酸共沉劑試劑盒、T4 DNA ligase均購自TaKaRa公司；預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker(DM131-01)購自北京全式金生物公司；DL10 000 DNA Marker(SM0331)購自賽默飛世爾科技有限公司；His-Tag抗體(6×His,His-Tag Antibody)、羊抗鼠二抗(Goat Anti-Mouse IgG (H+L))購自Proteintech公司；河豚毒素粗品(C11H17N3O8，純度≥98%)購自泰州康特生物工程有限公司；HisTrapTMFF Crude 5mL親和層析柱、氨基偶聯(lián)試劑盒(氫氧化鈉、乙醇胺、醋酸鈉緩沖液(pH=4.0，4.5，5.0，5.5)、NHS(N-羥基馬來酰亞胺)、EDC-HCl(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)等)、甘氨酸-鹽酸(pH=2.0)，以及傳感生物芯片CM5均購自美國GE Healthcare Life Sciences公司；PBS緩沖液(pH=7.4)由本實驗室制備。

1.2 方法

1.2.1 pPIC9K-TF_vWD載體的構(gòu)建

根據(jù)菊黃東方鲀TF_vWD蛋白質(zhì)編碼基因(GenBank登錄號：MT160192)，采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計上下游引物。上游引物為TF_vWD-F：5′-GGGGAATTCACCACCTTCAACGACATCA-3′；下游引物為TF_vWD-R：5′-ATGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGATGCCCGTTGGGCATAC GGA-3′。下劃線部分為限制性內(nèi)切酶 EcoR I和Not I的酶切位點，終止密碼子前為6×His標(biāo)簽(如加粗部分)。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

以菊黃東方鲀pMD19-T-TF_vWD陽性質(zhì)粒(本實驗室保存)為模板，分別以TF_vWD-F和TF_vWD-R為上、下游引物，采用Ex Taq?酶擴增目的基因片段，獲得含有酶切位點的TF_vWD目的基因片段。使用EcoR I和Not I限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，同時對pPIC9K載體質(zhì)粒進行EcoR I和Not I雙酶切，用核酸共沉劑試劑盒按照說明書回收酶切后的目的基因片段及載體。采用T4 DNA ligase于16 ℃下將具有EcoR I和Not I黏性末端的pPIC9K載體與具有相同黏性末端的TF_vWD基因片段連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上進行抗性篩選，用PCR法鑒定陽性克隆菌，交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序。根據(jù)測序結(jié)果，將已構(gòu)建成功的陽性菌株-80 ℃保存于終體積分?jǐn)?shù)為20%的甘油中備用。

真核表達載體的構(gòu)建過程如圖1所示，分泌型表達載體pPIC9K的N端含有AOX 1啟動子，利用酵母信號肽α-factor因子引導(dǎo)TF_vWD分泌表達，其C端加入6×His標(biāo)簽，可以通過Ni+親和層析純化目的蛋白。

1.2.2 pPIC9K-TF_vWD載體的轉(zhuǎn)化

將測序正確的pPIC9K-TF_vWD菌株進行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，通過Sac I限制性內(nèi)切酶對其線性化。用核酸共沉劑對酶切產(chǎn)物進行純化，通過電擊法將線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，并立即將轉(zhuǎn)化液涂布于MD平板上，放入培養(yǎng)箱(28 ℃)中培養(yǎng)2～3 d，隨機挑取MD平板上的單克隆菌落接種于YPD平板培養(yǎng)。

1.2.3 TF_vWD重組蛋白的表達與純化

挑取YPD平板上GS115單菌落接種于20 mL BMGY培養(yǎng)基中，然后放入培養(yǎng)箱(28 ℃)。以230 r/min搖菌至600 nm波長下OD值為4～6時，2000g離心10 min收集細(xì)胞，再加入20 mL BMMY培養(yǎng)基。比較在pH=7.0、誘導(dǎo)甲醇體積分?jǐn)?shù)為0.5%、不同誘導(dǎo)時間(0，12，24，48，72，96 h)下重組蛋白的表達量(每隔24 h，補加0.5%的甲醇)。利用SDS-PAGE對TF_vWD重組蛋白(rTF_vWD)的表達量進行分析，其余表達菌液的上清，經(jīng)PBS透析緩沖液透析3次，每次24 h，經(jīng)0.45 μmol/L 膜抽濾收集上清液并用Ni+親和層析柱純化。

按照GE公司的HisTrapTMFF crude親和層析柱操作說明書進行純化：用5～10倍體積超純水清洗層析柱，用5～10倍柱體積的平衡緩沖液平衡HisTrap層析柱；將過濾后的蛋白液上柱，用3～5倍柱體積的平衡緩沖液平衡過柱，洗去未結(jié)合的雜蛋白；用洗脫緩沖液過柱，5～10倍柱體積，洗脫目標(biāo)蛋白；收集洗脫峰，取少量洗脫液進行SDS-PAGE電泳鑒定rTF_vWD的純度，并以Mouse Anti-6His Tag為一抗，進行Western Blot鑒定。

1.2.4 rTF_vWD與TTX的親和力檢測

1)pH篩選 使用Biacore T200系統(tǒng)中的控制軟件(Biacore T200 Control Software)進行表面等離子體共振(SPR)分析TTX與rTF_vWD的相互作用。在將rTF_vWD固定在傳感器芯片CM5上之前，篩選合適的結(jié)合緩沖液的pH值，以PBS緩沖液為工作緩沖液，用10 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH值分別為5.0、4.5和4.0)稀釋rTF_vWD至終質(zhì)量濃度為30 μg/mL。進樣完成后選取偶聯(lián)量最大的pH值進行后續(xù)實驗，每次進樣后用50 mmol/L NaOH再生表面。

2)rTF_vWD在CM5傳感片表面的偶聯(lián) 系統(tǒng)設(shè)置將EDC和NHS以1∶1比例進行混合，活化傳感器芯片CM5表面，再進樣30 μg/mL rTF_vWD重組蛋白溶液(用pH=4.0的醋酸鈉緩沖液配制，pH條件根據(jù)上述實驗篩選所得)，最后以1 mol/L乙醇胺鹽酸封閉液封閉活化的芯片表面。

3)rTF_vWD與TTX的動力學(xué)分析 用PBS緩沖液分別稀釋TTX粗品濃度至0,31.25，62.5，125，250，500，1000，2000，4000 μmol/L，依次通入到傳感芯片上進行測量，在每次測量后以pH=2.0 的甘氨酸進行洗脫。本實驗在25 ℃下進行，利用Biacore Evaluation Software評估軟件從結(jié)合和解離曲線計算出rTF_vWD與TTX的平衡解離常數(shù)(KD)。

1.2.5 利用腹腔注射驗證rTF_vWD對TTX的中和作用

選取19.0～21.0 g的無特定病原體級(SPF)ICR系雄性健康小鼠50只，稱量并記錄體重。實驗操作方法參照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)“水產(chǎn)品中河豚毒素的測定”[14]。

1)對照組：準(zhǔn)備10只小鼠，每只小鼠腹腔注射0.15 μg TTX，等待小鼠死亡，記錄在2 h內(nèi)的生存時間及死亡數(shù)量。

2)實驗組：提前將TTX與rTF_vWD按摩爾比為1∶1和1∶50分別混勻，在15 ℃條件下分別孵育15 h。準(zhǔn)備20只小鼠，隨機分為2組，每組小鼠分別腹腔注射0.15 μg TTX與對應(yīng)摩爾比的rTF_vWD混合液，等待死亡，記錄在2 h內(nèi)的生存時間及死亡數(shù)量。

2 實驗結(jié)果

2.1 pPIC9K-TF_vWD真核載體的構(gòu)建與鑒定

經(jīng)PCR擴增獲得TF_vWD ORF框的編碼序列，大小為435 bp，編碼145個氨基酸，分子質(zhì)量為16.49 ku，pI值為5.58。分別使用EcoR I和Not I對目的基因及pPIC9K載體進行酶切，將酶切后的載體與目的基因連接，獲得475 bp+9.2 Kbp的pPIC9K-TF_vWD重組質(zhì)粒(見圖2a)，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中。挑取若干單克隆，進行PCR鑒定，得到陽性重組子克隆片段約500 bp，與預(yù)期片段大小相符(見圖2b)。分別取陽性菌液測序，結(jié)果證明連接正確，核苷酸的開放閱讀框編碼連續(xù)，最終獲得正確構(gòu)建的pPIC9K-TF_vWD融合表達載體。

2.2 TF_vWD在畢赤酵母中表達及純化

實驗在培養(yǎng)基pH為7.0，誘導(dǎo)表達的甲醇體積分?jǐn)?shù)為0.5%的條件下，比較了不同時間點(0，12，24，48，72，96 h)rTF_vWD的表達量。結(jié)果表明：在各誘導(dǎo)表達條件下，在約16 ku位置均出現(xiàn)目的條帶，且72 h后，表達量最高(見圖3a)。

重組畢赤酵母誘導(dǎo)表達后，離心后收集上清，經(jīng)透析和過濾后，利用鎳離子螯合親和層析柱純化rTF_vWD真核表達產(chǎn)物。用低濃度咪唑(20 mmol/L)洗脫雜蛋白，高濃度咪唑(500 mmol/L)洗脫螯合的融合蛋白，280 nm檢測紫外吸收曲線，可見到明顯的洗脫蛋白峰。收集洗脫組分進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)Quanlity One軟件分析，得到了純度為90%的rTF_vWD。對純化后的rTF_vWD進行Western Blot鑒定，結(jié)果在分子質(zhì)量約為16 ku的位置發(fā)現(xiàn)單一目的條帶(見圖3b)。

2.3 rTF_vWD蛋白與TTX的動力學(xué)分析

用pH值分別為5.0、4.5和4.0的醋酸鈉緩沖液稀釋rTF_vWD，進樣完成后選取偶聯(lián)量最大的pH值進行后續(xù)實驗。實驗結(jié)果表明，最佳偶聯(lián)pH值為4.0(見圖4)，rTF_vWD在CM5芯片表面最終偶聯(lián)量為4946 RU(見圖5)。以0，31.25，62.5，125，250，500，1000，2000，4000 μmol/L的TTX粗品流過固定有rTF_vWD的芯片，測定并分析配體與受體的相互作用。結(jié)果顯示，rTF_vWD與TTX結(jié)合的響應(yīng)值(Rmax)為100 RU，通過穩(wěn)態(tài)擬合(Affinity)計算出rTF_vWD與TTX的平衡解離常數(shù)KD為3.15 mmol/L(見圖6)。結(jié)果表明rTF_vWD能夠與TTX結(jié)合，且親和力較弱。

2.4 rTF_vWD蛋白對TTX的中和作用

對照組中，對小鼠按每千克體重腹腔注射7.5 μg TTX(或按0.15 μg/鼠的量注射TTX)，2 h內(nèi)10只小鼠死亡7只，致死速度較快，因此選擇在10 min后進行肌肉注射rTF_vWD。實驗組中，腹腔注射TTX與rTF_vWD孵育后的混合液，小鼠存活率顯著上升(P<0.05)(見圖7)，這表明TTX與蛋白體外孵育后，TTX毒性顯著降低了，即rTF_vWD對TTX的毒性有中和作用。

3 討論

卵黃蛋白原是卵黃蛋白(vitellin，Vn)的前體，主要是在肝臟中合成的，通過體循環(huán)將其分布至全身，并攜帶到卵巢。卵黃蛋白原被儲存在早期卵母細(xì)胞體內(nèi)，然后裂解為卵黃脂磷蛋白(I和II)、卵黃高磷蛋白和vWD結(jié)構(gòu)域[15]。除了作為卵黃蛋白前體的作用外，卵黃蛋白原還能作為金屬、無機磷酸鹽、脂類和碳水化合物的載體蛋白[16]，其中vWD結(jié)構(gòu)域具有與病毒或細(xì)菌互作的性質(zhì)，對微生物進行識別并介導(dǎo)微生物的清除[17]。最近有研究發(fā)現(xiàn)從豹紋東方鲀卵巢中分離純化的卵黃蛋白原肽段vWD可能參與TTX的結(jié)合[13]。為了驗證卵黃蛋白原肽段vWD與TTX的結(jié)合能力，本研究利用畢赤酵母表達系統(tǒng)，經(jīng)誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化，在0.5%(體積分?jǐn)?shù))甲醇、pH=7.0的條件下，誘導(dǎo)表達72 h時，rTF_vWD蛋白表達量最高，通過Ni+親和層析柱純化得到rTF_vWD蛋白純度為90%。

Biacore-表面等離子體共振(SPR)是一種高度敏感的技術(shù)，常用來驗證包括蛋白質(zhì)和核酸在內(nèi)的生物系統(tǒng)的相互作用[18]。SPR的主要優(yōu)勢是它能夠?qū)崟r測量親和力和動力學(xué)，并且是一種無標(biāo)簽，使用材料相對少的技術(shù)[19]。近年來，應(yīng)用SPR分析不同蛋白質(zhì)和小分子相互作用的研究進展表明，SPR在分析生物大分子和潛在候選藥物的親和力方面具有廣泛的應(yīng)用價值[20-22]。本文利用 Biacore T200生物分子相互作用分析系統(tǒng)，將rTF_vWD作為受體，以TTX作為配體進行相互作用的親和力和動力學(xué)分析。結(jié)果表明rTF_vWD能夠與TTX結(jié)合，平衡解離常數(shù)為3.15 mmol/L，且親和力較弱。本研究提供了rTF_vWD可結(jié)合TTX的直接證據(jù)，為卵黃蛋白原肽段vWD可作為不同組織器官間TTX的傳遞[23-24]介質(zhì)提供重要的證據(jù)。本研究還提供了rTF_vWD可中和TTX毒性的重要佐證：預(yù)先將TTX與rTF_vWD孵育后，再腹腔注射小鼠，則小鼠死亡率顯著下降，結(jié)果表明rTF_vWD可中和TTX毒性作用。本研究為河鲀對TTX耐受和TTX在河鲀體內(nèi)轉(zhuǎn)移和富集等機理的研究提供重要資料。