缺氧誘導(dǎo)因子1α 在乳頭狀腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

芮文斌，徐 達(dá)，祝 宇，吳瑜璇，王浩飛，汪成合，袁 菲

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院a.泌尿外科；b.病理科，上海 200025）

乳頭狀腎細(xì)胞癌（papillary renal cell carcino- ma,PRCC）是起源于腎小管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，Mancilla-Jimenez 在1976年因其乳頭狀結(jié)構(gòu)提出了PRCC 的命名，才將其獨(dú)立出來。PRCC 占腎細(xì)胞癌的7%～15%,根據(jù)其腫瘤細(xì)胞特點(diǎn)主要可分為嗜堿型（Ⅰ型）和嗜酸型（Ⅱ型）2 個(gè)亞型。大多數(shù)實(shí)體腫瘤存在缺氧或處于缺氧環(huán)境，這與腫瘤惡變、侵襲、轉(zhuǎn)移以及化療耐藥有關(guān)[1-3]。缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）由HIF-1α 和HIF-1β 組成，在腫瘤低氧適應(yīng)性反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[4]。HIF-1ɑ 是腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)，HIF-1ɑ 表達(dá)陽性預(yù)示其生存率低。本研究收集我院收治的83 例PRCC 患者的臨床資料，觀察其腫瘤組織中HIF-1ɑ 的表達(dá)情況和微血管密度（microvessel density，MVD），并分析患者的預(yù)后及相關(guān)影響因素。

資料與方法

一、資料

1.臨床資料：回顧分析我院1996年10 月至2015年2 月收治的83 例PRCC 患者的臨床資料?；颊吣挲g為33～76 歲，平均年齡為55.13 歲；男性58 例，女性25 例，發(fā)病時(shí)間1～13 個(gè)月；腫瘤位于左側(cè)腎者有47 例，位于右側(cè)腎者有36 例。83 例患者均接受手術(shù)治療，術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療，術(shù)后3 例患者接受腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞免疫治療；21 例患者接受干擾素或白細(xì)胞介素2 免疫治療，共6～9 個(gè)月；3 例發(fā)生腫瘤遠(yuǎn)處（肺、腦、骨）轉(zhuǎn)移或淋巴轉(zhuǎn)移的患者切除原發(fā)腫瘤后，加行靶向治療（舒尼替尼）至疾病進(jìn)展或死亡；其余病例術(shù)后接受隨訪觀察。

2.標(biāo)本：取83 例患者經(jīng)術(shù)后病理檢查[蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色]確診為PRCC 的腫瘤組織，并取15 例癌旁非腫瘤腎組織（手術(shù)切緣，病理證實(shí)無癌細(xì)胞殘留）作為對照。所有組織標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛溶液固定后，用石蠟包埋，行4 μm 厚連續(xù)切片，貼于涂有0.05%多聚賴氨酸的載玻片上待檢。

3.試劑：所用試劑包括兔抗人HIF-1ɑ 多克隆抗體（Santa Cruz 公司，美國）、鼠抗人CD34 單克隆抗體（NCL-L-END，Novocastra，美國）、EnVision TM 抗兔IgG 試劑盒（K4003，DAKO 公司，荷蘭）、EnVision TM 抗鼠IgG 試劑盒（K4001，DAKO 公司，荷蘭）、蘇木精（Biogenex Laboratories，San Ramon，美國）。

二、方法

1.檢測方法：采用免疫組織化學(xué)（免疫組化）SP法檢測HIF-1ɑ 表達(dá)情況和CD34 標(biāo)記的MVD（見圖1）。用已知HIF-1ɑ、CD34 陽性的結(jié)腸癌組織切片染色結(jié)果作為陽性對照,由PBS 代替一抗作為陰性對照。另制備常規(guī)HE 染色切片一張,以明確腫瘤類型，并根據(jù)腫瘤細(xì)胞核大小、形狀和核仁是否明顯進(jìn)行Furhrman 核分級。

圖1 PRCC 的HIF-1ɑ 陽性表達(dá)及MVD

2.結(jié)果判定：參照文獻(xiàn)[5]的方法判定HIF-1ɑ表達(dá)結(jié)果，以細(xì)胞核或以細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為陽性，高倍鏡下（400 倍）對每張切片隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞，共計(jì)1 000 個(gè)。陽性和陰性根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占面積兩者積分之和來判斷。染色強(qiáng)度積分為，不染色，計(jì)0 分；輕度染色，計(jì)1 分；中度染色，計(jì)2 分；強(qiáng)染色，計(jì)3 分；染色面積積分為，無細(xì)胞染色，計(jì)0 分；<25%細(xì)胞染色，計(jì)1 分；25%～50%細(xì)胞染色，計(jì)2 分；>50%細(xì)胞染色，計(jì)3 分。若以上2 項(xiàng)積分之和>3，則判定為表達(dá)陽性；積分之和≤3，則判定為表達(dá)陰性。

參照文獻(xiàn)[6]的方法，在低倍物鏡下選取高血管密度區(qū)，之后在高倍鏡（400 倍）下計(jì)數(shù)3 個(gè)視野內(nèi)被CD34 染成棕黃色的血管數(shù)，取其平均值作為該例腫瘤組織MVD 的數(shù)值。判斷時(shí)需注意以下幾點(diǎn)。①任何染成棕黃色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或與鄰近微血管腫瘤細(xì)胞之間存在明顯分離的內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)，均按獨(dú)立的微血管計(jì)數(shù)，是否有血管腔不作為計(jì)數(shù)微血管的必要條件，分支血管細(xì)胞只要不相連也視為另一個(gè)微血管；②血管腔直徑大于等于8個(gè)紅細(xì)胞或管壁有平滑肌包繞的較大血管不納入計(jì)數(shù)范圍。

Fuhrman 核分級共分為4 級，1 級為小的細(xì)胞核，看不見核仁或核仁不明顯；2 級為放大400 倍鏡下可以看到核仁；3 級為放大100 倍鏡下可見核仁；4 級為在3 級的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)畸形核、多核的細(xì)胞，伴有或不伴有梭形細(xì)胞。

3.隨訪：采用瑞金醫(yī)院電子隨訪系統(tǒng)及電話對所有患者進(jìn)行隨訪，對于失訪的患者，經(jīng)所在地公安局確認(rèn)其是否存活或了解準(zhǔn)確的死亡日期。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用Wilconxon 秩和檢驗(yàn)，HIF-1ɑ 與MVD 間相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)檢驗(yàn)。生存分析數(shù)據(jù)采用Kaplan-Meier 法（K-M 生存曲線）進(jìn)行計(jì)算，采用單因素和Cox 模型多因素回歸分析確定與預(yù)后相關(guān)的臨床因素，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、PRCC 患者的臨床特征

83 例患者中，37 例行根治性腎切除，43 例行保留腎單位手術(shù)，3 例行減瘤手術(shù)。術(shù)后隨訪13～162 個(gè)月，平均為68.5 個(gè)月。根據(jù)TNM 分期，其中T1N0M046 例、T2N0M025 例、T3N0M09 例、T4N1M01 例、T4N1M12 例。根據(jù)病理診斷，其中Ⅰ型PRCC患者有49 例，Ⅱ型PRCC 患者為34 例（見圖2、表1）。

表1 PRCC 患者的臨床特征、腫瘤組織中的HIF-1α 表達(dá)及MVD（n， ）

表1 PRCC 患者的臨床特征、腫瘤組織中的HIF-1α 表達(dá)及MVD（n， ）

圖2 PRCC 分型

二、PRCC 組織中HIF-1ɑ 的表達(dá)及其與MVD間的相關(guān)性

HIF-1ɑ 在Ⅰ型和Ⅱ型PRCC 組織中均有表達(dá)，但Ⅱ型PRCC 組織中的HIF-1ɑ 陽性率為55.88%，高于Ⅰ型PRCC（32.65%）（P=0.035）。HIF-1ɑ 在癌旁非腫瘤腎組織中不表達(dá)（見表2）。

表2 PRCC 組織中HIF-1α 的表達(dá)

根據(jù)表3 所示，MVD 在Ⅱ型PRCC 組織中最高（36.88±13.59）個(gè)/高倍鏡，Ⅰ型PRCC 組織中次之（28.61±9.39）個(gè)/高倍鏡，正常腎組織中最低（14.07±5.95）個(gè)/高倍鏡，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在83 例PRCC 組織中的HIF-1ɑ 陽性表達(dá)率為42.17%（35/83）。經(jīng)Spearman 等級相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，HIF-1ɑ 在PRCC 組織中的表達(dá)與MVD 呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r=0.65，P<0.01）（見表4）。

表3 PRCC 組織及正常腎組織中的MVD

表4 PRCC 組織中HIF-1α 表達(dá)與MVD 間的關(guān)系

三、預(yù)后分析

83 例PRCC 患者的5年生存率為89.16%（74/83），至隨訪結(jié)束共有13 例患者死亡，占所有病例的15.67%，除3 例患者死亡原因不詳，余死亡患者的死因均為腫瘤復(fù)發(fā)或多發(fā)轉(zhuǎn)移。腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位以肺（41.23%）、骨（32.45%）、腦（16.89%）較常見。

比較Ⅰ型、Ⅱ型PRCC 患者的5年總體生存（overall survival，OS）率發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型患者的OS 率優(yōu)于Ⅱ型（87.8%比76.5%，P=0.01）（見圖3A）。在PRCC 組織中，HIF-1ɑ 陰性組患者的OS 率高于陽性組（91.67%比74.29%，P=0.004）（見圖3B）。而亞型分析顯示，在Ⅰ型PRCC 組織中，HIF-1ɑ 陰性組與陽性組間的OS 率相似（93.93%比93.75%）；而在Ⅱ型PRCC 組織中，HIF-1ɑ 陰性組患者的OS 率明顯高于陽性組（86.67%比57.89%，P=0.03）（見圖3C、3D）。采用單因素和多元回歸分析確定各臨床變量與OS 率間的關(guān)系（見表5），單因素分析顯示，F(xiàn)uhrman 核分級、是否存在腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和HIF-1ɑ表達(dá)情況是影響此類患者預(yù)后的預(yù)測因子。多因素分析顯示，Ⅱ型PRCC、Fuhrman 核分級Ⅲ～Ⅳ級、腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及HIF-1ɑ 陽性表達(dá)是患者預(yù)后不良的因素。

圖3 PRCC 患者的總生存率

表5 單因素及多因素Cox 回歸分析確定臨床預(yù)后因素

討 論

一、PRCC 組織中HIF-1ɑ 的表達(dá)率

在大多數(shù)人類腫瘤組織中，HIF-1ɑ 被認(rèn)為是啟動血管生成的最重要的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)某些因子如血管內(nèi)皮生長因子、血小板源性生長因子和促紅細(xì)胞生成素的轉(zhuǎn)錄，從而改變血管生成。HIF-1ɑ 在正常腎臟組織中幾乎無表達(dá)，在腎細(xì)胞癌中的平均陽性表達(dá)率為70%（17%～97%）[7]，在大多數(shù)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中其表達(dá)均顯著上調(diào)，而在其他類型的腎臟腫瘤中陽性表達(dá)率較低[8-9]。Lidgren 等[10]報(bào)道，在26 例PRCC 組織中HIF-1ɑ 的陽性表達(dá)率為57.69%，且其表達(dá)與腫瘤分級有關(guān)。目前，關(guān)于不同亞型PRCC 組織中HIF-1ɑ 表達(dá)情況的研究報(bào)道較少。本研究中，PRCC 組織中的HIF-1ɑ 總陽性表達(dá)率為42.17%，Ⅱ型PRCC HIF-1ɑ 陽性表達(dá)率高于Ⅰ型PRCC，可能提示這2 種亞型PRCC 發(fā)生、發(fā)展的分子基礎(chǔ)不同。Saleeb 等[11]對80 例PRCC（Ⅰ型、Ⅱ型各40 例）進(jìn)行RNA 測序，獲得20 531 個(gè)基因，采用聚類分析后顯示，Ⅰ型PRCC 發(fā)生、發(fā)展過程中涉及的主要信號通路為WNT、Hedgehog 和Notch，而mTOR、VEGF 和HIF 信號通路在Ⅱ型PRCC 發(fā)生、發(fā)展過程中常見。Ooi 等[12]同樣指出，在Ⅱ型PRCC 中存在HIF 通路，這也解釋了在Ⅱ型PRCC 中HIF-1ɑ 陽性表達(dá)率高的可能原因。

二、PRCC 組織中HIF-1ɑ 陽性的預(yù)后預(yù)測價(jià)值

HIF-1ɑ 是腫瘤血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，而MVD 通常用于評估腫瘤血管生成水平，反映腫瘤的侵襲能力。在PRCC 組織中HIF-1ɑ 的表達(dá)與腫瘤MVD 呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.65，說明在Ⅰ型和Ⅱ型PRCC 中，HIF-1ɑ 都參與了腫瘤血管的調(diào)控。K-M 生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型PRCC 患者的預(yù)后好于Ⅱ型，其5年生存率分別為87.8%和76.5%。目前，大多數(shù)研究認(rèn)為，PRCC 患者的預(yù)后與其腫瘤分型、腫瘤大小、Fuhrman 核分級及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況有關(guān)[13-14]，但也有研究顯示出了不同的結(jié)果。Chen 等[15]對185 例PRCC 患者進(jìn)行預(yù)后分析，認(rèn)為TNM 分期和世界衛(wèi)生組織/國際泌尿病理學(xué)會分級與OS顯著相關(guān)，而腫瘤分型與OS 無關(guān)。Ren 等[16]則認(rèn)為，腫瘤分型和腫瘤分期可作為PRCC 患者預(yù)后的獨(dú)立因素。因此，除了臨床病理因素之外，HIF-1 也被作為大多數(shù)實(shí)體腫瘤預(yù)后的預(yù)測因子，其過表達(dá)通常與預(yù)后不良相關(guān)[17-20]。HIF-1ɑ 是腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)，HIF-1ɑ 表達(dá)陽性預(yù)示患者生存率低[21-23]。但也有研究者提出相反觀點(diǎn)，認(rèn)為局部侵襲性透明細(xì)胞癌中的HIF-1ɑ 水平明顯低于局限性腫瘤，提示HIF-1ɑ 陽性表達(dá)與較好的預(yù)后相關(guān)[10]。目前，HIF-1ɑ 表達(dá)是否影響PRCC 的預(yù)后尚未明確，本研究采用單因素和多因素分析顯示，除Fuhrman 核分級、腫瘤是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之外，HIF-1ɑ 表達(dá)情況也是影響患者預(yù)后的因素。

多年來，抗血管生成藥物一直是轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌系統(tǒng)治療的基石。然而，隨著時(shí)間的推移，新型多激酶抑制劑、免疫靶點(diǎn)抑制劑以及不同的治療組合層出不窮，要做到精準(zhǔn)治療、個(gè)體化治療，就首先要確定預(yù)測患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。PRCC 是一種特殊類型的腎細(xì)胞癌，其惡性度低，進(jìn)展緩慢，患者預(yù)后較好[24]。但在靶向藥物治療的時(shí)代，轉(zhuǎn)移性PRCC患者的OS 率卻較腎透明細(xì)胞癌患者低[25]。在評估舒尼替尼作為一線藥物治療轉(zhuǎn)移性PRCC 的前瞻性Ⅱ期研究中，舒尼替尼的療效低于其在治療腎透明細(xì)胞中的療效[26]。由于PRCC 患者中HIF-1ɑ 的表達(dá)情況與其預(yù)后相關(guān)，抑制與HIF 信號通路相關(guān)的分子和（或）HIF 靶基因可能可作為PRCC 的新型治療方法。