腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3基因多態(tài)性與食管癌臨床特征相關(guān)性研究

黎秀月 蘇珍 何艷 鄒國(guó)榮 曹小龍

[摘要]目的探討腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3（TNFAIP3）基因多態(tài)性在食管癌癌組織與癌旁組織的分布差異及與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。方法利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和一代測(cè)序技術(shù)，對(duì)2016年1月至2019年7月在廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院住院的30例食管癌手術(shù)患者癌組織與對(duì)應(yīng)癌旁組織中 TNFAIP3基因7個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（rs2230926、rs5029928、rs5029939、rs610604、rs7753873、rs9494885、rs583522）進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果分析 TNFAIP3基因的7個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的不同基因型頻率在食管癌患者癌與癌旁組織中的分布，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P >0.05）;各多態(tài)性位點(diǎn)不同基因型與患者年齡、性別、腫瘤部位、組織分化、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期均無(wú)相關(guān)性。結(jié)論 TNFAIP3基因7個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（rs2230926、rs5029928、rs5029939、 rs610604、rs7753873、rs9494885、rs583522）的基因型頻率在食管癌患者癌與癌旁組織分布無(wú)差異，不同基因型與食管癌患者臨床參數(shù)也無(wú)相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞]腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3基因;基因多態(tài)性;食管癌;一代測(cè)序

[中圖分類號(hào)] R735.1? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A?? [文章編號(hào)]2095-0616（2021）24-0192-05

Correlation between tumor necrosis factor-alpha-induced protein3 gene polymorphism and clinical features of esophageal cancer LI? Xiuyue??? SU? Zhen??? HE? Yan??? ZOU? Guorong??? CAO? Xiaolong

Department of Oncology， Guangzhou Panyu Central Hospital， Guangdong， Guangzhou 511400， China

[Abstract] Objective To investigate the distribution difference of tumor necrosis factor-alpha-induced protein 3（TNFAIP3） gene polymorphism between esophageal cancer （EC） tissues and adjacent tissues and its correlation with clinicopathological parameters. Methods Polymerase chain reaction （PCR） and first-generation sequencing technology were used to detect seven polymorphic sites （rs2230926， rs5029928， rs5029939， rs610604， rs7753873， rs9494885 and rs583522） of TNFAIP3 gene in cancer tissues and corresponding adjacent tissues of 30 patients with EC who were hospitalized in Guangzhou Panyu Central Hospital from January 2016 to July 2019. Results The distribution of different genotype frequencies of 7 polymorphic sites of TNFAIP3 gene in cancer and adjacent tissues of EC patients was analyzed， and there was no significant difference （P >0.05）. Different genotypes of each polymorphic site were not correlated with age， gender， tumor location， tissue differentiation， invasion depth， lymph node metastasis and clinical stage. Conclusion There is no difference in the genotype frequency of seven polymorphic loci （rs2230926， rs5029928， rs5029939， rs610604， rs7753873， rs9494885 and rs583522） in the distribution of cancer and adjacent tissues of EC patients， and there is no correlation between different genotypes and clinical parameters of EC patients.[Key words] Tumor necrosis factor-alpha-induced protein 3 gene; Gene polymorphism; Esophageal cancer; First generation sequencing

腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3（tumor necrosis factor alpha-induced protein 3，TNFAIP3）是 NF-κB 誘導(dǎo)表達(dá)的泛素編輯酶，位于人類染色體6q23，具有去泛素化酶和泛素連接酶的雙重生物學(xué)功能，通過(guò)修飾 NF-κB 信號(hào)通路中的一些重要信號(hào)蛋白的泛素化狀態(tài)而發(fā)揮調(diào)控 NF-κB 表達(dá)狀態(tài)的功能[1-2]。 TNFAIP3基因在人群中呈現(xiàn)不同的多態(tài)性位點(diǎn)，已有研究表明 TNFAIP3基因多態(tài)性與包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性干燥綜合征在內(nèi)的自身免疫性疾病的疾病易感性和臨床病理參數(shù)有一定的相關(guān)性[3-5]。此外，該基因的多態(tài)性位點(diǎn) rs610604可以作為食管癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[6]。但針對(duì) TNFAIP3基因多態(tài)性和食管癌臨床特征的關(guān)聯(lián)性研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在利用一代測(cè)序技術(shù)對(duì) TNFAIP3基因進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)分型檢測(cè)，探討各多態(tài)性位點(diǎn)的不同基因型頻率在食管癌癌組織與癌旁組織中的分布差異及與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2016年1月至2019年7月于廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院住院的30例食管癌手術(shù)患者的組織蠟塊。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者在本院接受食管癌根治手術(shù)，且術(shù)后病理結(jié)果明確診斷為食管癌;②患者所有臨床資料完整;③患者同意配合研究工作。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前已行化療或放射治療患者;②合并其他類型惡性腫瘤患者;③轉(zhuǎn)移性食管癌患者。所有患者均依照2010年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（VICC）及美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）提出的第7版食管癌分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，并選取相應(yīng)癌旁組織作為對(duì)照組[7]。

1.2儀器試劑

Ezup柱式動(dòng)物組織基因組 DNA 抽提試劑盒（B518251），Taq Plus DNA 聚合酶（B600090），10× PCR Buffer（含 Mg2+）（B600017），dNTP（B500056），瓊脂糖（A500016），50× TAE（B548101），DNA Ladder Mix（100～ 3000 bp）（B500347），SanPrep柱式 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒（上海生工生物有限公司， B518141）。使用的儀器包括： PCR 儀（美國(guó) ABI 公司），3730XL 測(cè)序儀（ABI 公司），凝膠成像儀（上海復(fù)旦科技有限公司），DYY-6C 電泳儀（北京六一）等。

1.3方法

① DNA 提取：收集30例食管癌患者癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行 DNA 提取。② DNA 質(zhì)量檢測(cè)：利用瓊脂糖電泳檢測(cè)提取的 DNA 完整性，分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度。③ PCR 擴(kuò)增：依據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)合適的引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為：模板 DNA 1?l，上下游引物各1?l，dNTP mix 1?l，Taq Buffer（with? MgCl2）2.5?l，Taq 酶0.2?l，加 ddH20至25?l;反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性95℃5 min，接著進(jìn)入循環(huán)步驟變性94℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃60 s，共38個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10 min。④1%瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。利用 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行膠回收。⑤測(cè)序：測(cè)序引物由上海生工生物公司合成并進(jìn)行最后的測(cè)序工作，見(jiàn)表1。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用[n （%）]表示，比較采用 Fisher's 精確檢驗(yàn);各多態(tài)性位點(diǎn)不同基因型和臨床參數(shù)的相關(guān)性分析，由于樣本量較小，采用 Fisher's 精確檢驗(yàn)， P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1基因分型結(jié)果

TNFAIP3基因7個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)經(jīng)一代測(cè)序發(fā)現(xiàn)：rs2230926共檢測(cè)到兩個(gè)基因型，為 G/T、T/T 型; rs5029928共檢測(cè)到兩個(gè)基因型，為 C/C、C/T 型; rs5029939共檢測(cè)到兩個(gè)基因型，為 C/C、C/G 型; rs610604共檢測(cè)到三個(gè)基因型，為 G/G、G/T、T/T 型; rs7753873共檢測(cè)到兩個(gè)基因型，為 A/A、A/C 型;rs9494885 共檢測(cè)到兩個(gè)基因型，為 C/T、T/T 型;rs583522共檢測(cè)到兩個(gè)基因型，為 C/T、T/T 型。見(jiàn)圖1。

2.2 TNFAIP3多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率分布

7個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的不同基因型頻率在食管癌癌組織與癌旁組織間分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P >0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 TNFAIP3基因多態(tài)性與食管癌臨床病理特征的相關(guān)性分析

本研究中，將食管癌常見(jiàn)的臨床病理參數(shù)（患者年齡、性別、腫瘤部位、組織分化、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期）分別與不同的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)性分析，未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型分布與臨床病理參數(shù)間存在顯著的相關(guān)性，見(jiàn)表3～9?？紤]可能由于本研究納入的樣本量太少所致。

3討論

食管癌是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，位于全球癌癥相關(guān)性死亡原因的第6位[8]。我國(guó)食管癌發(fā)病率占全球發(fā)病率一半以上[9]。目前對(duì)食管癌的研究主要集中在環(huán)境危險(xiǎn)因素、飲食狀況、精神因素及是否喜好煙酒等方面。隨著分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)等技術(shù)的快速發(fā)展，各國(guó)學(xué)者對(duì)食管癌的研究方向從環(huán)境因素逐步深入到分子水平的遺傳因素?；蚨鄳B(tài)性是指生物群體中同時(shí)存在兩種或以上不連續(xù)的基因型或等位基因[10]。大量研究表明，基因多態(tài)性研究對(duì)幫助闡明疾病易感性，預(yù)測(cè)疾病預(yù)后等方面都具有十分重要的意義[11-13]。迄今已有大量研究表明基因多態(tài)性與食管癌之間存在一定的相關(guān)性[14-15]。

既往研究表明 TNFAIP3基因在食管鱗癌患者中高表達(dá)，且可作為食管鱗癌的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因子[16]。另有文獻(xiàn)報(bào)道食管癌中 TNFAIP3基因 rs583522位點(diǎn)的不同基因型與疾病復(fù)發(fā)率存在一定的相關(guān)性，AA/AG 基因型比 GG 基因型的患者更易復(fù)發(fā)[17]。本研究通過(guò)一代測(cè)序技術(shù)對(duì)符合納入標(biāo)準(zhǔn)的30例食管癌患者癌組織與癌旁組織中 TNFAIP3基因的7個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（rs2230926、 rs5029928、rs5029939、rs610604、rs7753873、 rs9494885、rs583522）進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)各基因型頻率在癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中的分布差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，研究結(jié)果顯示各多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率在癌與癌旁組織中分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析各多態(tài)性位點(diǎn)與常見(jiàn)臨床病理參數(shù)（患者年齡、性別、腫瘤部位、組織分化、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期）的相關(guān)性，尚未發(fā)現(xiàn)與這些參數(shù)有明顯相關(guān)性的多態(tài)性位點(diǎn)。綜上所述，結(jié)合已有相關(guān)研究，本研究尚未發(fā)現(xiàn) TNFAIP3基因的7個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)不同基因型頻率在鼻咽癌組織和癌旁組織間有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各多態(tài)性位點(diǎn)與臨床常見(jiàn)病理參數(shù)之間也尚未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性。這與前期相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道并不吻合，考慮可能由于樣本量太少的原因，后期將通過(guò)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步收集數(shù)據(jù)分析。

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（收稿日期：2020-11-30）