鹽酸多西環(huán)素注射液在豬體內(nèi)藥代動力學(xué)-藥效學(xué)研究

黃耀凌，徐 倩，胡海燕，王亦琳，孫 雷，徐士新

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

多西環(huán)素(Doxycycline)為四環(huán)素類抗生素，具有高效、長效、廣譜等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床［1］。現(xiàn)國內(nèi)外有較多關(guān)于多西環(huán)素制劑在豬、火雞、羊等動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究報道［2-4］，但這些制劑消除半衰期較快，峰濃度相對較低。因此，本項目采用金屬離子絡(luò)合的方法，制備了緩釋的鹽酸多西環(huán)素注射液，以延長多西環(huán)素在動物體內(nèi)的消除半衰期［5］。本研究旨在探討自制鹽酸多西環(huán)素注射液在豬體內(nèi)的藥物動力學(xué)規(guī)律，并通過藥物劑量對時間-效應(yīng)的關(guān)系(藥代動力學(xué)(PK)/藥效學(xué)(PD)參數(shù))，為制定合理的臨床用藥方案提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 20%鹽酸多西環(huán)素注射液(規(guī)格:5 mL/瓶)，批號為101021，自制，經(jīng)測定含量為標(biāo)示量的101.0%;鹽酸多西環(huán)素對照品，含量為98.0%，批號 435239/1，BioChemika公司;乙腈、甲醇、乙酸乙酯、甲酸，色譜純;氫氧化鈉、Na2EDTA、Na2HPO4·12H2O、檸檬酸，分析純。

1.2 儀器 超高效液相色譜儀:ACQUITY UPLC，美國Waters公司;組織勻漿機:日本NISSEI公司;低溫高速離心機:德國Heldolph公司;渦旋混合儀:MS2德國 IKA公司;微量分析天平:AE240型，METTLER公司;氮吹儀:美國Organomation Associates公司;可微調(diào)加樣器:德國Eppendorf公司;超純水儀:美國 Millipore公司;SPE柱:HLB 3cc/60mg，美國Waters公司。

1.3 試驗動物 三元雜交健康豬10頭，雌雄各半，體重為15～50 kg，購自北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限公司。試驗前7 d，自由采食飲水，飼喂不加任何抗菌藥物的全價配合飼料。試驗前后各組飼養(yǎng)條件相同。

1.4 給藥及血樣采集 豬仰臥保定，頸部肌內(nèi)注射藥物，給藥劑量按多西環(huán)素計均為10 mg/kg。前腔靜脈采血，給藥前采空白血樣約5 mL。給藥后，分別于 10、20、30、45 min 及 1、2、4、6、8、12、24、36、48、60、72 h采血。每次采血約6mL，置于肝素化的離心管中，3 000 r/min離心10 min，取血漿樣品于-20℃冰箱保存，待測。

1.5 樣品檢測

1.5.1 血漿樣品處理 取1mL待測血漿于50 mL離心管中，加入9 mL 0.1 mol/L Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液，旋渦混勻1 min，15000 r/min高速離心5 min，取上清液于另一離心管備用。HLB固相萃取小柱，依次用甲醇、水各5 mL預(yù)洗。取上述上清液過柱，依次用水、5%甲醇水溶液各5 mL淋洗，減壓抽干，用甲醇-乙酸乙酯溶液(1+9，V/V)3 mL洗脫，洗脫液用氮氣吹干(溫度低于40℃)。用20%乙腈水0.5 mL溶解殘留物，過0.22 μm微孔濾膜后供Waters超高效液相色譜儀測定。

1.5.2 色譜條件 色譜柱:BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm);流動相:0.3%的甲酸乙腈溶液-0.3%的甲酸水溶液(18+82，V/V);流速:0.6 mL/min;柱溫:20℃;樣品溫度:15℃;進(jìn)樣量:5 μL。

1.6 數(shù)據(jù)分析 采用藥代動力學(xué)軟件WinNonlin6.3對血藥濃度-時間數(shù)據(jù)處理，計算藥代動力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 血漿多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取空白血漿樣品添加鹽酸多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液使添加濃度為25、50、100、250、1000、2000、4000 μg/L(以多西環(huán)素計，如下同)，經(jīng)前處理后，供超高效液相色譜儀測定。將結(jié)果進(jìn)行相關(guān)與回歸分析，得到線性回歸方程為:Y＝18.189X-472.07，相關(guān)系數(shù)為0.9998。

2.2 檢測限和定量限 按照《獸用化學(xué)藥物臨床藥代動力學(xué)試驗指導(dǎo)原則》的要求，對添加濃度為12.5 μg/L的樣品，經(jīng)提取后進(jìn)行測定，LOD大于3倍信噪比，為方法的檢測限;對添加濃度為25 μg/L的樣品，經(jīng)提取后進(jìn)行測定，LOQ大于10倍信噪比，且準(zhǔn)確度和精密度符合殘留檢測方法的要求，因此25 μg/L的添加濃度為方法的定量限。

2.3 回收率、準(zhǔn)確度與精密度 取空白血漿1.0 mL，添加多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液使血漿中鹽酸多西環(huán)素的濃度分別為 25、250、2000 μg/L三個不同濃度，各濃度取5個樣品進(jìn)行平行試驗，重復(fù)3次，樣品經(jīng)處理后進(jìn)超高效液相色譜測定，計算樣品的濃度、回收率、批內(nèi)、批間變異系數(shù)。結(jié)果如表1所示，樣品在25～2000 μg/L添加濃度范圍內(nèi)，回收率在85% ～105%之間，批內(nèi)變異系數(shù)為1.8% ～10%，批間變異系數(shù)為2.4% ～10%，符合方法學(xué)要求，可用于血藥濃度檢測。

表1 豬血漿中添加鹽酸多西環(huán)素的回收率與精密度表(n＝5)

2.4 血藥濃度數(shù)據(jù)與藥代動力學(xué)參數(shù) 每頭豬血藥濃度-時間數(shù)據(jù)見表2，血藥時間曲線見圖1。藥動學(xué)數(shù)據(jù)表明部分豬血漿中藥物濃度在給藥后，峰濃度之前，有迅速上升，甚至初始血藥濃度高于峰濃度的突釋(雙峰)情況，不符合典型的房室模型，因此采用非房室模型分析血藥濃度-時間數(shù)據(jù)。藥代動力學(xué)參數(shù)見表3，結(jié)果顯示，藥物在豬體內(nèi)的 t1/2為(31.3 ±9.2)h，Tmax為(0.80 ±0.7)h，Cmax為(4132 ±2475)μg/L，AUC 為(88378 ±88095)(μg/L)·h，MRT為(20.5±2.5)h?？瞻籽獫{、空白添加血漿樣品和給藥后的血漿樣品色譜圖分別見圖2-圖4，顯示多西環(huán)素的保留時間約為2.3 min，其峰形良好。

表2 鹽酸多西環(huán)素注射液給藥后1#～10#豬各時間點的血藥濃度 (μg/L)

圖1 豬肌內(nèi)注射鹽酸多西環(huán)素注射液的血藥濃度-時間曲線圖

2.5 PK/PD參數(shù)選擇給藥方案 根據(jù)文獻(xiàn)資料，多西環(huán)素對敏感菌的MIC接近0.25 mg/L［6-10］，對豬肺炎支原體(四個菌株)的MIC小于0.12 mg/L［11］。血藥濃度-時間對數(shù)藥動曲線圖中，以多西環(huán)素對大多敏感菌MIC(250 μg/L)作橫線與曲線相交，顯示給藥后24小時血藥濃度均高于MIC。表明藥物對豬常見病原菌有良好的抑制作用。多西環(huán)素為時間依賴性藥物［12］，采用 PK/PD參數(shù) T＞MIC選擇給藥方案［13-14］。一般，當(dāng)%T＞MIC在40% ～50%［15-17］時，藥物發(fā)揮有效療效。根據(jù)MIC數(shù)據(jù)和試驗中血藥濃度數(shù)據(jù)，T＞MIC約為24 h，AUC0-24/MIC比值在50～130(表3)范圍，表明鹽酸多西環(huán)素注射液以10 mg/kg劑量肌內(nèi)注射，兩天給藥一次為宜。

圖2 空白豬血漿色譜圖

圖3 空白豬血漿添加鹽酸多西環(huán)素250μg/L濃度點的色譜圖

圖4 給藥后豬血漿樣品色譜圖

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3 討論與小結(jié)

3.1 藥動學(xué)特征 在藥動學(xué)數(shù)據(jù)處理時，采用了非房室模型，這是由于部分試驗動物在給藥之后，出現(xiàn)了血藥濃度突釋(雙峰)現(xiàn)象。這可能是因為自制產(chǎn)品采用螯合反應(yīng)將多西環(huán)素與金屬離子絡(luò)合，但在產(chǎn)品制備過程中，仍有部分多西環(huán)素未完全與金屬離子絡(luò)合，在給藥后，游離部分的多西環(huán)素迅速進(jìn)入血液循環(huán)。另外，動物個體差異等因素也造成對藥物吸收的不均等，因此表現(xiàn)出給藥后，峰濃度之前出現(xiàn)的血藥濃度迅速上升。而血藥濃度迅速上升并保持在較高濃度，發(fā)揮了快速抗菌作用，從而克服了緩釋制劑給藥后緩慢釋放不能有效快速發(fā)揮抑菌或殺菌效果的缺點。

楊海峰［18］報道，普通多西環(huán)素注射液給豬10 mg/kg劑量肌內(nèi)注射，t1/2β為 5.21 h 和 Cmax為2.31 mg/L;何家康［19］報道，豬以 10 mg/kg 劑量肌內(nèi)注射鹽酸多西環(huán)素注射液，MRT為15.18 h，Cmax為2.0 mg/L。與其他長效或緩釋多西環(huán)素制劑相比，以同等劑量豬肌內(nèi)注射，楊海峰［18］報道的長效多西緩釋注射液，t1/2β為11.07 h和Cmax為1.24 mg/L;何家康［19］的緩釋鹽酸多西環(huán)素注射液，MRT為22.25 h，Cmax為 3.32 mg/L;班付國［20］報道的長效緩釋多西環(huán)素注射液，t1/2β為 9.63 h和 Cmax為1.69 mg/L。而本項目研制的鹽酸多西環(huán)素注射液，Tmax為 0.8 h，Cmax為 4132 μg/L，t1/2為 31.3 h，MRT為20.5 h。與上述的多西環(huán)素注射液相比，自制產(chǎn)品MRT更長，表明具有良好的長效作用。這其中原因與自制產(chǎn)品在制備過程中采用適宜的有機溶媒，以及藥物與金屬離子形成絡(luò)合物，使在體內(nèi)延緩了藥物的釋放有關(guān)。

3.2 給藥方案選擇 近年來，不少研究者通過藥代動力學(xué)和藥效學(xué)之間的關(guān)系來評價獸藥對病原微生物的作用［13-16］。目前，被用來評價獸用抗菌藥對微生物發(fā)揮有效療效的PK/PD參數(shù)有Cmax/MIC，AUC/MIC 和%T＞MIC。其中，參數(shù) Cmax/MIC或AUC/MIC多用于濃度依賴性藥物的評價;參數(shù)%T＞MIC或AUC/MIC用于時間依賴性藥物的評價，AUC/MIC主要用于中度和高度PAE時間依賴性藥物的評價［13-17］。一 般，當(dāng)%T＞MIC占 40% ～50%［15-17］或 Cmax/MIC 比例為8～10 時［21］，藥物發(fā)揮有效療效。而AUC/MIC比值在不同藥物表現(xiàn)并不相同，雖然研究表明，氟喹諾酮類藥物在AUC/MIC在100～125范圍時，可以取得較為理想的療效，但還沒有證據(jù)可以將這個比值應(yīng)用到其他抗菌藥物［13］。

2007 年，Burgess發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類藥物在AUC/MIC＞25時，治療效果≥95%［9］。2013 年的報道也證明，當(dāng)多西環(huán)素AUC/MIC＞25時，治療效果≥90%［10］。又據(jù)報道，多西環(huán)素對敏感病原菌的 MIC 為0.05 ～0.20 μg/mL［8-11］。Schreiner在對人的試驗中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)MIC≤0.2 μg/mL時，患者治愈率接近95%［22］。Maaland試驗認(rèn)為，多西環(huán)素的敏感折點為0.125 mg/L［10］。因此在進(jìn)行該制劑PK/PD參數(shù)計算時，MIC設(shè)定為0.25 μg/mL。

由于多西環(huán)素為中度時間依賴性藥物，因此PK/PD參數(shù)%T＞MIC和AUC/MIC可以作為評價其療效的指標(biāo)。根據(jù)MIC(0.25 μg/mL)，比較試驗的藥時數(shù)據(jù)，超過MIC的時間(T＞MIC)約為24 h。根據(jù)%T＞MIC占40% ～50%時，藥物可發(fā)揮有效的療效，因此確定該制劑給藥間隔可為兩天一次。而根據(jù)表3結(jié)果，多西環(huán)素AUC/MIC比值＞50，說明多西環(huán)素以10 mg/kg劑量給藥有較好的治療效果。因此，確定自制的鹽酸多西環(huán)素注射液推薦給藥方案為10 mg/kg劑量肌內(nèi)注射，兩天給藥一次為宜。

本項目研制的鹽酸多西環(huán)素注射液在豬體內(nèi)具有吸收快，血藥濃度較高，消除時間長的特點，而且以10 mg/kg肌內(nèi)給藥的PK/PD參數(shù)%T＞MIC和AUC/MIC比值滿足治療要求。這說明，該注射液適用于豬的臨床疾病治療。

［1］李 偉，楊 陽.多西環(huán)素的藥理學(xué)進(jìn)展及臨床應(yīng)用概述［J］.廣東畜牧獸醫(yī)科技，2009，(6):34:3-5.

［2］Riond J L，Riviere J E.Pharmacokinetics and metabolic inertness of doxycycline in young pigs［J］.Am J Vet Res，1990，51(8):1271-1275.

［3］Croubels S.Vermeersch H.Backer P D，et a1.Liquid chromatographic separation of doxycycline and 4-epidoxycycline in a tissue depletion study of doxycycline in turkeys［J］.J Chromatogr B，1998，708:145-152.

［4］Yamaoka K，Nakagaw T，Uno T.Application of Akaike’s information criterion(AIC)in the evaluation of linear pharmacokinet equations［J］.J Pharmacokinetics Biopharm，1978，6:165-175.

［5］劉 偉.長效土霉素注射液的研制及其藥動學(xué)研究［D］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［6］Brook I，Elliott T B，Pryor H I，et al.In vitro resistance of Bacillus anthracis Sterne to doxycycline，macrolides and quinolones［J］.International Journal of Antimicrobial Agents，2001，18(6):559-562.

［7］Alexander A F，Sergey N V，Irene Y L，et al.Prevention of the selection of resistant Staphylococcus aureus by moxifloxacin plus doxycycline in an in vitro dynamic model:an additive effect of the combination［J］.International Journal of Antimicrobial Agents，2004，23(5):451-456.

［8］Lever M S，Bewley K R，Dowsett B，et al.In vitro susceptibility of Coxiellaburnetii to azithromycin，doxycycline，ciprofloxacin and a range of newer fluoroquinolones［J］.International Journal of Antimicrobial Agents，2004，24(2):194-195.

［9］Burgess D S，F(xiàn)rei C R，Lewis Ii J S，et al.The contribution of pharmacokinetic-pharmacodynamic modelling with Monte Carlo simulation to the development of susceptibility breakpoints for Neisseria meningitidis［J］.Clin Microbiol Infect，2007，13(1):33-39.

［10］Maaland M G，Papich M G，Turnidge J，et al.Pharmacodynamics of doxycycline and tetracycline against Staphylococcus pseudintermedius:proposal of canine-specific breakpoints for doxycycline［J］.J Clin Microbiol，2013，51(11):3547-3554.

［11］張純萍，沈青春，胡海燕，等.豬肺炎支原體體外抗菌藥物敏感性試驗研究［J］.中國獸藥雜志，2013，47(4):10-12.

［12］Agwuh K N and MacGowan A.Pharmacokinetics and pharmacodynamics of thetetracyclines including glycylcyclines［J］.Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2006，58:256-265.

［13］Toutain P.Pharmacodynamics/pharmacokinetics integaraion in dosage regimen optimisation for veterinary medicine［J］.Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，2003，26(Supplement 1):1-18.

［14］王 睿.抗菌藥物pk/pd參數(shù)對合理設(shè)計給藥方案的意義［J］.中國藥師，2003，6(12):806-809.

［15］Kim A，Banevicius M A and Nicolau D P.In vivo pharmacodynamic profiling of doripenem against Pseudomonas aeruginosa by simulating human exposures［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52:2497-2502.

［16］Bowker K E，Noel A R，Tomaselli S G，et al.Pharmacodynamics of the antibacterial effect of and emergence of resistance to doripenem inPseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii in an in vitro pharmacokinetic model［J］.Antimicrob Agents Chemother，2012，56(10):5009-5015.

［17］陳佰義.PK/PD理論指導(dǎo)下的優(yōu)化抗菌治療［J］.中華臨床感染病雜志，2009，2(2):69-70.

［18］楊海峰，覃少華，王加才，等.2種多西環(huán)素注射液在健康豬體內(nèi)的藥動學(xué)比較［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，26:76-79.

［19］何家康，祝萬菊，周麗光，等.鹽酸多西環(huán)素緩釋注射液在豬體內(nèi)的藥物動力學(xué)［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2008，2(28):175-180.

［20］班付國，吳寧鵬.兩種鹽酸多西環(huán)素注射液在豬體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究［J］.中國獸藥雜志，2013，47(8):22-25.

［21］Burch D G S，Ripley P and Burrows M.Colon contents concentration and area under the curve/minmum inhibitory concentration relationships for valnemulin-prevention，treatment and elimination of swine dysentery［J］.Pig Journal，2004，54:198-205.

［22］Schreiner A，Digranes A.Pharmacokinetics of lymecycline and doxycycline in serum and suction blister fluid［J］.Chemotherapy，1985，31:261-265.