雞肉和雞蛋中金剛烷胺與金剛乙胺殘留檢測(cè)UPLC-MS/MS法研究

尹 暉，孫 雷，畢言鋒，王亦琳，王鶴佳，徐士新

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

金剛烷胺和金剛乙胺屬于三環(huán)胺類抗病毒藥物(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1)，在人類上有廣泛應(yīng)用。但是，將人用抗病毒藥物用于畜禽，不僅容易導(dǎo)致動(dòng)物性食品中藥物殘留、動(dòng)物中毒、動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制和耐藥性等問題，還可導(dǎo)致病毒發(fā)生變異，影響動(dòng)物疫病控制及人用抗病毒藥物的有效性［1-2］。我國(guó)農(nóng)業(yè)部2005年第560號(hào)公告明確規(guī)定金剛烷胺和金剛乙胺等抗病毒藥物在獸醫(yī)上禁止使用，美國(guó)FDA于2006年也禁止將金剛烷胺和金剛乙胺等人類抗病毒藥物用于畜禽類。因此，急需要建立動(dòng)物性食品中該類藥物的殘留檢測(cè)方法，以加強(qiáng)對(duì)該類藥物的殘留監(jiān)管，有效保護(hù)人類健康。目前我國(guó)動(dòng)物性食品中該類藥物殘留檢測(cè)方法的報(bào)道較少，少數(shù)的報(bào)道主要集中在液相色譜法［3］、氣相色譜法［4-5］和液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜法［6-9］。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有高效分離和多組分定性、定量的優(yōu)點(diǎn)，因此成為近年獸藥殘留檢測(cè)方法研究的主要方法，本研究以雞肉和雞蛋為試材，建立了同時(shí)可以檢測(cè)金剛烷胺和金剛乙胺兩種藥物的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法，以有效解決此類藥物在雞肉和雞蛋中的檢測(cè)方法的欠缺，本方法靈敏度高、定性準(zhǔn)確、前處理快速簡(jiǎn)便，為該類藥物的殘留情況進(jìn)行有效監(jiān)管提供了科學(xué)依據(jù)。

圖1 金剛烷胺和金剛乙胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 儀器 Acquity UPLC-Quattro Premier質(zhì)譜聯(lián)用儀，Waters公司;AE260電子天平，Mettler Toledo公司;Biofuge Strators高速冷凍離心機(jī)，賀利氏公司;Organomation Associates氮吹儀，Jnc公司;SIR4漩渦混合器，IKA公司。

1.2 藥品和試劑 金剛烷胺，純度為99%;鹽酸金剛乙胺，純度為99.9%;金剛烷胺 -D6，純度為99.8%，均購(gòu)自北京振翔科技有限公司;甲酸、乙腈為色譜純，均購(gòu)自MERCK公司;無(wú)水硫酸鈉、正己烷均為分析純;所用水為超純水。

1.3 對(duì)照溶液配制 精密稱定金剛烷胺和金剛乙胺對(duì)照品適量，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，再用20%乙腈稀釋成100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱為BEH C18(50×2.1 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相A相為0.1%甲酸乙腈溶液，B相為0.1%甲酸水溶液(梯度洗脫條件見表1)，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI+)，毛細(xì)管電壓為3.0 kV，萃取電壓為2.0 V，RF透鏡電壓為0.5 V，源溫為110℃，霧化溫度為350℃，霧化氣速為650 L/h，錐孔氣流速為50 L/h。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子情況見表2。

表2 金剛烷胺及內(nèi)標(biāo)、金剛乙胺的特征離子、錐孔電壓和碰撞能量

1.4.3 定性與定量 定性時(shí)試樣溶液中色譜峰的保留時(shí)間，應(yīng)與校正溶液的保留時(shí)間一致，容許偏差為±5%，試樣溶液中的離子豐度比應(yīng)與校正溶液的一致，容許偏差符合歐盟2002/657/EC決議要求。定量時(shí)金剛烷胺采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，金剛乙胺通過基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液采用外標(biāo)法定量。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密量取適量的金剛烷胺和金剛乙胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，制得濃度為2、5、10、20、50、100 ng/mL(含金剛烷胺 -D6為 100 ng/mL)的系列對(duì)照溶液，以金剛烷胺特征離子質(zhì)量色譜峰與內(nèi)標(biāo)峰面積比、金剛乙胺特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.5 樣品前處理過程 稱取(2±0.02)g勻質(zhì)的雞肉或雞蛋樣品于50 mL離心管內(nèi)，加3 g無(wú)水硫酸鈉，再加入1%甲酸乙腈10.0 mL，渦旋1 min，然后水平震蕩提取10 min，8000 r/min離心8 min，取5.0 mL上清液于溫度50℃下氮?dú)獯蹈?，加?0%乙腈溶液1.0 mL，充分渦旋溶解，再加入20%乙腈溶液飽和的正己烷2 mL，充分渦旋混合，然后室溫下靜置5 min，吸取下層溶液0.5 mL，轉(zhuǎn)移至1.5 mL塑料離心管內(nèi)，12000 r/min離心5 min，取下層清液適量，過0.2 μm濾膜后供UPLC-MS/MS法測(cè)定。

1.4.6 方法靈敏度確定 將適量金剛烷胺和金剛乙胺加入到空白雞肉和雞蛋中，制成0.5、1、2 ng/g三個(gè)濃度添加樣品，經(jīng)上述方法進(jìn)行前處理后，用UPLC-MS/MS檢測(cè)，觀察藥物特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比(S/N)和對(duì)應(yīng)藥物濃度，S/N＞3者定其為方法的檢測(cè)限;S/N＞10者定其為方法的定量限。

1.4.7 準(zhǔn)確度和精密度的測(cè)定 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白雞肉和雞蛋中各添加2、5、10 ng/g三個(gè)不同濃度藥物進(jìn)行回收率試驗(yàn)，各濃度進(jìn)行5個(gè)樣品平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，求批內(nèi)、批間RSD。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行線性回歸，得到的回歸方程及變異系數(shù)見表3。從表中可以看出金剛烷胺和金剛乙胺在2～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2分別為0.9977和0.9988。

表3 金剛烷胺和金剛乙胺線性回歸情況

2.2 方法靈敏度 按上述方法進(jìn)行處理，當(dāng)添加濃度為2 ng/g時(shí)，測(cè)得金剛烷胺和金剛乙胺的S/N＞10，說明方法定量限為2 ng/g。當(dāng)添加濃度為1 ng/g時(shí)，測(cè)得兩種藥物S/N＞3，表明方法檢測(cè)限為1 ng/g。2 ng/g添加試液中金剛烷胺、金剛乙胺及金剛烷胺-D6特征離子質(zhì)量色譜圖見圖2、圖3。

圖2 2 ng/g空白雞肉添加試液中藥物及內(nèi)標(biāo)特征離子質(zhì)量色譜圖

圖3 2 ng/g空白雞蛋添加試液中藥物及內(nèi)標(biāo)特征離子質(zhì)量色譜圖

2.3 方法準(zhǔn)確度和精密度 在空白雞肉和雞蛋中各添加三個(gè)不同濃度金剛烷胺和金剛乙胺進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果匯總見表4、表5?？梢钥闯鲭u肉中金剛烷胺平均回收率為79.6% ～107.5%，批內(nèi)RSD為4.4% ～6.8%，批間RSD為6.1% ～7.1%;金剛乙胺平均回收率為78.4% ～101.2%，批內(nèi)RSD為1.4% ～19.3%，批間RSD為2.5% ～11.3%。雞蛋中金剛烷胺平均回收率為90.8%～111.1%，批內(nèi) RSD為3.7% ～11.7%，批間 RSD為7.4% ～9.2%;金剛乙胺平均回收率為75.4% ～87.4%，批內(nèi)RSD為2.1% ～8.4%，批間RSD為5.0%～6.9%?？梢钥闯?，雞肉和雞蛋樣品中兩種藥物的回收率均在70% ～120%之間，批內(nèi)和批間RSD均小于15%。

表4 雞肉中金剛烷胺和金剛乙胺添加回收率試驗(yàn)結(jié)果

表5 雞蛋中金剛烷胺和金剛乙胺添加回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

金剛烷胺和金剛乙胺屬于三環(huán)胺類抗病毒藥物，含有氨基，屬于有機(jī)堿，在酸性溶液中易溶于水，因此，樣品前處理時(shí)采用含有甲酸的乙腈溶液進(jìn)行提取，用正己烷去除脂肪，采用高速離心的方式進(jìn)一步去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，通過樣品測(cè)試發(fā)現(xiàn)凈化效果較為理想，優(yōu)化了樣品前處理方法。雞肉和雞蛋等動(dòng)物性食品基質(zhì)較為復(fù)雜，通過充分的提取凈化后該類藥物在質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)仍存在基質(zhì)帶來(lái)的影響。在流動(dòng)相中加入0.1%甲酸溶液有利于化合物的離子化，并通過實(shí)驗(yàn)對(duì)比確定了最佳洗脫梯度，優(yōu)化了液相色譜分離條件。通過對(duì)方法線性、靈敏度、回收率和精密度等技術(shù)參數(shù)的考察，發(fā)現(xiàn)均能滿足殘留檢測(cè)方法的要求，另外，該方法簡(jiǎn)便、快速、雜質(zhì)干擾少，是一種理想的確證檢測(cè)方法。

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